香菇酶解液熱反應(yīng)條件優(yōu)化

劉麗娜，魏書信，王安建，田廣瑞，高帥平，邢彩云

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)副產(chǎn)品加工研究中心，河南 鄭州 450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450002）

香菇（Lentinus edodes）是我國(guó)特產(chǎn)食用菌，也是食用菌中最具有代表性的品種之一，不僅肉質(zhì)肥厚脆嫩，滋味鮮美，香氣獨(dú)特，而且具有很高的營(yíng)養(yǎng)、藥用和保健價(jià)值[1]，深受人們的喜愛(ài)。據(jù)中國(guó)食用菌協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)，2017年我國(guó)香菇產(chǎn)量986.51萬(wàn)t，占全國(guó)食用菌總產(chǎn)量的26%以上，是產(chǎn)量最大的食用菌品種。近年來(lái)，隨著人們生活水平的不斷提高，香菇國(guó)際國(guó)內(nèi)市場(chǎng)日益擴(kuò)大，香菇加工開(kāi)始向多元化方向發(fā)展，對(duì)香菇產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)已有很多研究報(bào)道[2-7]，如香菇面包、香菇餅干、香菇保健茶、香菇酥糖、香菇熱狗腸、香菇醬等。由于香菇含有豐富的呈味物質(zhì)，獨(dú)特的鮮美滋味使其深加工成為調(diào)味料開(kāi)發(fā)的重要方向。目前在調(diào)味料上還是以粗加工為主，工藝簡(jiǎn)單，香菇的鮮味和滋味物質(zhì)釋放不完全，特征香氣不明顯，因此有必要研究開(kāi)發(fā)一種香菇深加工風(fēng)味產(chǎn)品。

熱反應(yīng)技術(shù)是改進(jìn)食品風(fēng)味和制取新型風(fēng)味物質(zhì)的重要手段，廣泛應(yīng)用于香精領(lǐng)域，利用各種不同糖類和氨基酸化合物的熱反應(yīng)能產(chǎn)生各種不同的風(fēng)味物質(zhì)[8-9]，熱反應(yīng)的程度和系統(tǒng)中的組分、溫度、時(shí)間以及pH值等條件有關(guān)[10]。各種深入研究發(fā)現(xiàn)采用合適的天然原料，如水解動(dòng)物蛋白、水解植物蛋白等代替氨基酸來(lái)制備香精，可以使得產(chǎn)品的風(fēng)味更佳飽滿逼真[11]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)香菇的研究主要集中在栽培技術(shù)、干制加工、功能成分提取及活性研究等，對(duì)干香菇的揮發(fā)性香味成分分析研究的也較多，而對(duì)其熱反應(yīng)香精的風(fēng)味研究鮮見(jiàn)報(bào)道，香菇中氨基酸豐富，含有構(gòu)成蛋白質(zhì)的20種氨基酸中的18種，且含有豐富的糖類，這些都是制備熱反應(yīng)香精的風(fēng)味前提物質(zhì)。因此，本研究選用香菇酶解液為原料，添加外源氨基酸和還原糖進(jìn)行熱反應(yīng)，制備一款具有菌菇風(fēng)味、能增香增鮮的新型食品調(diào)味料，以期為香菇的精深加工提供一條新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香菇：購(gòu)自西峽縣孫氏菌業(yè)專業(yè)合作社，烘干后粉碎過(guò)80目篩，取篩下物密封保存?zhèn)溆?；中性蛋白酶（酶?.8AU/g）：諾維信投資有限公司；氫氧化鈉、木糖、L-半胱氨酸（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；濃鹽酸（分析純）：煙臺(tái)市雙雙化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ZX-9140MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱、SHZ-B水浴恒溫振蕩器：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；XB-20B多功能粉碎機(jī)：上海兆申科技有限公司；FA2004C分析天平：上海越平科學(xué)儀器有限公司；超聲波細(xì)胞破碎儀：上海汗諾軒儀器有限公司；HC-3018高速冷凍離心機(jī)：安徽中科中加科學(xué)儀器有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：河南省予華儀器有限公司；FE20 pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器上海有限公司；UV-1800型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：濟(jì)南海能儀器股份有限公司；MJ-78A高壓滅菌鍋：施都凱儀器設(shè)備上海有限公司；Advanced-Ⅰ艾柯超純水機(jī)：臺(tái)灣艾柯成都康寧實(shí)驗(yàn)專用純水設(shè)備廠；Agilent 7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）儀：美國(guó)Agilent公司；固相微萃取手柄、50 μmDVB/CAR/PDMS萃取頭：美國(guó)Supelco公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 香菇酶解液的制備

取適量香菇粉，按照料液比1∶15（g∶mL）加去離子水混合均勻，超聲細(xì)胞破碎儀作用10 min（超聲功率800W、頻率20 kHz），添加0.7%中性蛋白酶在50 ℃酶解3 h后，沸水浴滅酶10 min，冷卻，4 000 r/min離心20 min，取上清液即為酶解液（其水解度為18.36%）。

1.3.2 熱反應(yīng)制備菇精的試驗(yàn)

（1）熱反應(yīng)原料的確定

稱取香菇酶解液40 g，分別加入不同含量木糖（0.2 g、0.4 g、0.6 g、0.8 g、1.0 g）、不同含量半胱氨酸（0.05 g、0.10 g、0.15 g、0.20 g、0.25 g），在100 ℃反應(yīng)2 h，考察熱反應(yīng)原料對(duì)熱反應(yīng)的影響，通過(guò)感官評(píng)分和熱反應(yīng)中間產(chǎn)物A280nm值來(lái)確定熱反應(yīng)原料的添加量。

（2）熱反應(yīng)條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

稱取香菇酶解液40 g，添加木糖0.6 g和半胱氨酸0.1 g，考察不同反應(yīng)溫度（80 ℃、90 ℃、100 ℃、110 ℃、120 ℃），不同反應(yīng)時(shí)間（0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h），不同反應(yīng)pH值（5、6、7、8、9）對(duì)熱反應(yīng)的影響，通過(guò)感官評(píng)分和熱反應(yīng)中間產(chǎn)物A280nm值來(lái)確定熱反應(yīng)條件。

（3）熱反應(yīng)條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

表1 熱反應(yīng)條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for thermal reaction conditions optimization

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選擇反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)pH值3個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，對(duì)熱反應(yīng)條件參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

1.3.3 分析檢測(cè)

（1）熱反應(yīng)中間產(chǎn)物的檢測(cè)[12]

熱反應(yīng)產(chǎn)物中的低分子質(zhì)量香味中間體可以用280 nm波長(zhǎng)處紫外吸光度值表示，吸光度值越大，香味物質(zhì)越多。將熱反應(yīng)產(chǎn)物稀釋100倍，以蒸餾水作為參比溶液，在280 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。

（2）熱反應(yīng)產(chǎn)物的感官評(píng)價(jià)[13]

由五位有感官評(píng)定經(jīng)驗(yàn)的評(píng)定人員從焦香味、糊味、香菇特征香氣、整體香氣4個(gè)方面對(duì)熱反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行感官評(píng)定。焦香味、糊味、香菇特征香氣和整體香氣所占的權(quán)重分別是20%、20%、30%和30%，感官評(píng)分取加權(quán)平均數(shù)，總分9分。熱反應(yīng)產(chǎn)物感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。

表2 熱反應(yīng)產(chǎn)物感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of thermal reaction products

（3）氣質(zhì)聯(lián)用分析[14]

固相微萃?。╯olid-phase microextraction，SPME）條件：取10 mL樣液放入40 mL萃取瓶中，蓋上瓶蓋在60 ℃水浴攪拌中平衡20 min后，用萃取頭吸附30 min，然后將萃取頭插入氣質(zhì)聯(lián)用儀的進(jìn)樣器中解吸5 min。

氣相色譜條件：采用HP-5MS毛細(xì)色譜柱（30m×0.25mm×0.25 μm），載氣氦氣（He），流速1 mL/min，不分流，進(jìn)樣口溫度230 ℃；程序升溫起始溫度35 ℃，保持5 min，5 ℃/min升溫至150 ℃，再以10 ℃/min的速率升至220 ℃，保持2 min，檢測(cè)器溫度：280 ℃。質(zhì)譜條件：電離方式為電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量為70 eV，離子源溫度為230 ℃，四極桿溫度150 ℃，質(zhì)譜接口溫度250 ℃，質(zhì)量掃描范圍30～550m/z。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱反應(yīng)原料的確定

2.1.1 木糖添加量的確定

還原糖是熱反應(yīng)中重要的反應(yīng)物質(zhì)，木糖價(jià)廉易得，反應(yīng)活性好，是呋喃類物質(zhì)產(chǎn)生的良好前體物，還能促進(jìn)焦香味和甜味產(chǎn)物產(chǎn)生[15-16]。由圖1可知，在40 g香菇酶解液中，隨著木糖添加量的增加熱反應(yīng)中間產(chǎn)物A280nm值逐漸增加并趨于平緩，說(shuō)明木糖增加使熱反應(yīng)程度增大并產(chǎn)生更多的風(fēng)味物質(zhì)。熱反應(yīng)產(chǎn)物的感官評(píng)分隨木糖添加量的增加不斷升高，但木糖添加量為0.7 g時(shí)感官評(píng)分反而低于0.6 g時(shí)，這可能是由于木糖添加量過(guò)多，發(fā)生過(guò)度焦糖化反應(yīng)，導(dǎo)致產(chǎn)物產(chǎn)生焦糊味使感官評(píng)分降低。綜合考慮木糖的最適添加量為0.6 g。

圖1 木糖添加量對(duì)熱反應(yīng)的影響Fig.1 Effect of xylose addition on thermal reaction

2.1.2 半胱氨酸添加量的確定

圖2 半胱氨酸添加量對(duì)熱反應(yīng)的影響Fig.2 Effect of cysteine addition on thermal reaction

香菇中蛋白質(zhì)含量很高，且氨基酸種類豐富[17]，酶解后是一種理想的熱反應(yīng)原料。不同的氨基酸在熱反應(yīng)中會(huì)產(chǎn)生不同的風(fēng)味，在香菇酶解液中添加一定量的半胱氨酸，有助于形成更多的香味物質(zhì)[18]。由圖2可知，在40 g香菇酶解液中，隨著半胱氨酸添加量的不斷增加，熱反應(yīng)中間產(chǎn)物A280nm值和熱反應(yīng)產(chǎn)物的感官評(píng)分均呈先上升后下降的趨勢(shì)，二者變化趨勢(shì)相似，半胱氨酸添加量為0.1 g時(shí)A280nm值和感官評(píng)分最高。半胱氨酸添加量太多會(huì)造成熱反應(yīng)產(chǎn)物產(chǎn)生硫味，使感官評(píng)分降低。因此，半胱氨酸添加量選擇0.1 g。

2.2 熱反應(yīng)條件的單因素試驗(yàn)

2.2.1 反應(yīng)溫度對(duì)熱反應(yīng)的影響

在初始pH值為6的條件下反應(yīng)2 h，溫度對(duì)熱反應(yīng)的影響見(jiàn)圖3。由圖3可知，反應(yīng)溫度較低時(shí)，熱反應(yīng)較為緩慢，此時(shí)，熱反應(yīng)中間產(chǎn)物A280nm值和熱反應(yīng)產(chǎn)物的感官評(píng)分都處于較低水平；隨著溫度的升高，反應(yīng)底物活性增加，熱反應(yīng)進(jìn)程不斷加速，溫度每升高10 ℃，反應(yīng)速率增加3～5倍，熱反應(yīng)產(chǎn)物增加，因此，熱反應(yīng)中間產(chǎn)物A280nm值升高趨勢(shì)加快，熱反應(yīng)產(chǎn)物的感官評(píng)分逐漸增加；但反應(yīng)溫度過(guò)高熱反應(yīng)產(chǎn)物會(huì)產(chǎn)生焦味和異味，致使熱反應(yīng)產(chǎn)物的感官評(píng)分下降明顯。因此，最適的反應(yīng)溫度為100 ℃，這與張書香等[19]研究結(jié)果相一致。

圖3 反應(yīng)溫度對(duì)熱反應(yīng)的影響Fig.3 Effect of reaction temperature on thermal reaction

2.2.2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)熱反應(yīng)的影響

圖4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)熱反應(yīng)的影響Fig.4 Effect of reaction time on thermal reaction

在反應(yīng)溫度100 ℃、初始pH值為6的條件下，反應(yīng)時(shí)間對(duì)熱反應(yīng)的影響見(jiàn)圖4。由圖4可知，反應(yīng)時(shí)間較短時(shí)，熱反應(yīng)發(fā)生不完全，產(chǎn)物生成較少，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，熱反應(yīng)發(fā)生充分，產(chǎn)物含量增加，因此，熱反應(yīng)中間產(chǎn)物A280nm值和熱反應(yīng)產(chǎn)物的感官評(píng)分逐漸增加；但時(shí)間延長(zhǎng)到2 h后，會(huì)出現(xiàn)焦糊味影響熱反應(yīng)液的可接受性，從而引起感官評(píng)分降低。因此，反應(yīng)時(shí)間選擇2 h為宜。

2.2.3 反應(yīng)pH值對(duì)熱反應(yīng)的影響

在反應(yīng)溫度100 ℃、時(shí)間2 h的條件下，采用不同反應(yīng)pH值進(jìn)行熱反應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知，不同的起始反應(yīng)pH值對(duì)熱反應(yīng)產(chǎn)物的風(fēng)味存在影響[20]。隨著pH值的升高，熱反應(yīng)中間產(chǎn)物A280nm值不斷增加，這符合熱反應(yīng)在pH 3～10時(shí)隨著pH升高而加劇的一般規(guī)律。熱反應(yīng)產(chǎn)物的感官評(píng)分隨著pH值的升高先升后降，當(dāng)pH值達(dá)到6.0以上時(shí)，由于氨基的反應(yīng)性加強(qiáng)，熱反應(yīng)速度加快，導(dǎo)致產(chǎn)生不良風(fēng)味[21]（如NH3等）。因此，選擇最適反應(yīng)pH值為6。

圖5 反應(yīng)pH值對(duì)熱反應(yīng)的影響Fig.5 Effect of reaction pH value on thermal reaction

2.3 熱反應(yīng)條件的優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以感官評(píng)分為考察指標(biāo)，對(duì)熱反應(yīng)溫度、時(shí)間、pH值進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn)，結(jié)果與分析見(jiàn)表3，方差分析見(jiàn)表4。

表3 熱反應(yīng)條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal tests for thermal reaction conditions optimization

由表3可知，經(jīng)極差分析可知，3個(gè)因素對(duì)感官評(píng)分的影響從大到小的順序?yàn)锳＞C＞B，即反應(yīng)溫度影響最大，其次是反應(yīng)pH值和反應(yīng)時(shí)間。最優(yōu)水平組合為A2B1C3，即反應(yīng)溫度為100 ℃，反應(yīng)時(shí)間為1.5 h，反應(yīng)pH值為7。在此優(yōu)化條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，其反應(yīng)產(chǎn)物感官評(píng)分為8.8。由表4方差分析可知，反應(yīng)溫度對(duì)感官評(píng)分影響顯著（P＜0.05），而反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)pH值對(duì)感官評(píng)分無(wú)顯著影響（P＞0.05）。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal tests results

2.4 香菇酶解液熱反應(yīng)后揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

將所得最優(yōu)組合條件下的熱反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)GC-MS分析，熱反應(yīng)產(chǎn)物的揮發(fā)性成分總離子流色譜圖見(jiàn)圖6，分離鑒定出的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成及相對(duì)含量見(jiàn)表5。

圖6 熱反應(yīng)產(chǎn)物的揮發(fā)性成分總離子流色譜圖Fig.6 Total ionization chromatogram of volatile flavor substances in thermal reaction products

由表5可知，香菇酶解液經(jīng)過(guò)熱反應(yīng)后共檢測(cè)出20種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，主要包括含硫化合物3種（72.28%），含氮化合物1種（11.86%），醛類7種（11.51%），醇類4種（2.80%），酯類4種（1.20%），烴類1種（0.35%）。很多研究表明[22-25]，含硫化合物是香菇風(fēng)味的重要物質(zhì)，其閾值較低，能影響香菇的整體風(fēng)味，本實(shí)驗(yàn)熱反應(yīng)產(chǎn)物中檢測(cè)出1,2,4-三硫雜環(huán)戊烷、1,2,4,5-四硫雜環(huán)己烷、1,2,4,5,7-五硫雜環(huán)辛烷，這些含硫化合物總相對(duì)含量占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，因此對(duì)熱反應(yīng)產(chǎn)物風(fēng)味的貢獻(xiàn)最大。但香菇中常見(jiàn)的1,2,3,5,6-五硫雜環(huán)庚烷并未檢測(cè)出，這可能與其受熱不穩(wěn)定易分解有關(guān)。八碳化合物也被認(rèn)為是香菇的重要風(fēng)味物質(zhì)，1-辛烯-3-醇、3-辛醇、2-辛烯-1-醇均在本實(shí)驗(yàn)熱反應(yīng)產(chǎn)物中檢測(cè)到，這些化合物具有典型的蘑菇香味，是蘑菇特征香味的重要組成部分。據(jù)報(bào)道[26]，熱反應(yīng)能夠引起脂肪酸的降解生成閾值較低的醛類揮發(fā)性化合物，熱反應(yīng)產(chǎn)物中檢測(cè)出相對(duì)含量較高的醛類化合物，與這一研究報(bào)道相符合。此外，熱反應(yīng)產(chǎn)物中還檢測(cè)到含氮化合物、酯類、烴類等，這些化合物對(duì)產(chǎn)物的整體香氣有協(xié)調(diào)和互補(bǔ)的作用。所有這些揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)共同構(gòu)成熱反應(yīng)產(chǎn)物香菇菇精的特殊風(fēng)味。

表5 熱反應(yīng)產(chǎn)物中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)GC-MS分析結(jié)果Table 5 Analysis results of volatile flavor substances in thermal reaction products by GC-MS

3 結(jié)論

本試驗(yàn)利用熱反應(yīng)制備香菇菇精，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)對(duì)熱反應(yīng)工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定了菇精的熱反應(yīng)最佳工藝為香菇酶解液40 g，木糖0.6 g，半胱氨酸0.1 g，反應(yīng)溫度100 ℃，反應(yīng)時(shí)間1.5 h，pH值為7。在此優(yōu)化條件下，所得的菇精香菇味濃厚、焦香味突出、無(wú)糊味且整體香氣協(xié)調(diào)。采用固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)所制備的香菇菇精中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析，共檢測(cè)出20種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，包括含硫化合物（72.28%），醛類7種（11.51%），醇類（2.80%），酯類（1.20%）等，其中含硫化合物總相對(duì)含量占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，對(duì)香菇精風(fēng)味貢獻(xiàn)最大；具有蘑菇特征香味的八碳化合物類在熱反應(yīng)產(chǎn)物中均存在。所有這些揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)共同構(gòu)成熱反應(yīng)香菇菇精的特殊風(fēng)味。