提高苦蕎醋黃酮含量的工藝研究

汪 沙，盧紅梅 *，陳 莉，張玉梅，吳 震，李榮源

（1.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué) 貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025）

苦蕎（Fagopyrum tataricum）為藥食同源類糧食作物[1]，屬蓼蕎麥屬，自古以來，被民間稱為“凈腸草”?？嗍w味苦，性平寒，具有益氣續(xù)神、祛積化滯、利耳安神、止咳平喘、活血寬腸、減肥美容等功效。其含有黃酮、多種氨基酸、微量元素、維生素以及多酚、膳食纖維等功能活性物質(zhì)。黃酮類化合物具有多重生理功能，在改善非特異性免疫功能的同時(shí)[2]，還能抑制粥樣動(dòng)脈硬化，達(dá)到降血脂、改善脂代謝的功效[3]?？嗍w中的黃酮類化合物可提高超氧化物歧化酶活性，從而降低丙二醛的含量，達(dá)到抗衰老、增強(qiáng)活力的目的[4-5]。黃酮中的蘆丁還有防止腦細(xì)胞老化、作抗癌藥物[6-7]、抑制疼痛等作用，其鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)于阿司匹林[8-9]。

食醋味酸而醇厚，液香而柔和，富含氨基酸，具有生津止渴、改善食欲的功效[10]，食醋中的醋酸、乳酸、蘋果酸和琥珀酸等多種有機(jī)酸，能有效促進(jìn)肝臟排毒，減少肝病發(fā)生的機(jī)率，是烹飪時(shí)一種不可或缺的調(diào)味品[11]。此外，食醋還有利尿、防結(jié)石護(hù)腎等作用。

在以苦蕎為原料釀制苦蕎醋的過程中，黃酮損失較大，降低了苦蕎醋的保健功能；且苦蕎中的多糖含量高，導(dǎo)致發(fā)酵過程中發(fā)酵液黏稠，影響發(fā)酵液中部分酶的活性，不利于發(fā)酵的進(jìn)行，導(dǎo)致產(chǎn)率不高品質(zhì)下降。因此，本研究將提取過多糖、黃酮的苦蕎粉釀制成苦蕎醋，再將所提取的黃酮添加到苦蕎醋中，探究苦蕎破碎度、糊化與否、糖化時(shí)蛋白酶添加等條件對(duì)苦蕎粉釀醋的影響，以期達(dá)到提高苦蕎醋黃酮含量，改善操作性能的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

苦蕎：貴州師范大學(xué)試驗(yàn)基地；醋酸菌：由貴陽味莼園食品股份有限公司提供；活性安琪酵母：安琪酵母股份有限公司；小麥、高粱：市售。

1.1.2 主要試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%）：貴州迪大生物科技有限責(zé)任公司；硫酸：重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司；重鉻酸鉀、苯酚、硫酸亞鐵銨、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、亞硝酸鈉：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；硝酸鋁、乳酸：天津市密歐化學(xué)試劑有限公司；石油醚（沸程為60～90 ℃）：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；碘化鉀、碘：天津市北辰方正試劑廠；甲基紅：天津市化學(xué)試劑有限公司；乙酸鋅：天津市優(yōu)譜化學(xué)試劑有限公司；硫代硫酸鈉、甲醛溶液、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、亞鐵氰化鉀：成都金山化學(xué)試劑有限公司；檸檬酸、乙酸鈉：重慶茂業(yè)化學(xué)試劑有限公司；鹽酸、丙酮：重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司；1,10-鄰菲啰啉、三氯乙酸、L-酪氨酸：上海展云化工有限公司；酪蛋白、酸性蛋白酶（5 700 U/g）、中性蛋白酶（1 2000 U/g）、堿性蛋白酶（4 000 U/g）、α-淀粉酶酶活（4 000 U/g、糖化酶（3 700 U/g）：上海源葉生物科技有限公司；高峰氏淀粉酶：上海滬宇生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

101-1電熱干燥箱：北京科偉永興儀器有限公司；HH-b型數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州奧華儀器有限公司；FA2004N精密電子天平：上海菁海儀器有限公司；SPX-250生化培養(yǎng)箱：上海恒豐儀器儀表有限公司；THZ-92C 臺(tái)式恒溫振蕩器：上海浦東物理光學(xué)儀器廠；721型可見光分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司；pHS-3C 數(shù)顯酸度儀、上海虹益儀器儀表有限公司；Vaco 5-II-D真空冷凍干燥機(jī)：ZiRBUSTechnology GmbH。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 操作要點(diǎn)

苦蕎黃酮提?。涸跍囟?0 ℃，酒精含量60%vol的條件下，超聲輔助提取30 min，料液比1∶50，黃酮提取液于65 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)直至乙醇全部蒸干后低溫鼓風(fēng)干燥備用。

水提苦蕎多糖：提取溫度70 ℃，超聲輔助提取50 min，料液比1∶25，多糖的提取液真空冷凍備用；濾過的苦蕎粉在60 ℃干燥，打散，備用。

粉碎及原料配比：苦蕎粉碎15 s，?。?0目苦蕎粉160 g，活性干酵母0.5 g，食鹽5 g，醋酸菌種子液96 mL，料水比1∶4。

糊化：沸水浴15min。

液化：調(diào)pH為6.5，按0.15%加入α-淀粉酶（最適溫度55～65 ℃），于60 ℃水浴鍋中液化2.5 h。

糖化：調(diào)節(jié)pH為5.0，按1.5%加入糖化酶，于60 ℃水浴鍋中糖化3 h，調(diào)節(jié)pH至4.5備用。

酒精發(fā)酵：稱取發(fā)酵液質(zhì)量0.1%的活性干酵母，置于5%的蔗糖溶液中，配制成10 g/100mL的酵母活化液，在30 ℃活化30 min后加入制備好的糖化醪中。用保鮮膜封口后，28 ℃條件下發(fā)酵3 d開始測(cè)發(fā)酵液酒精度，直至發(fā)酵液澄清、無氣泡產(chǎn)生、酒精度不再上升，取出酒醪過濾，調(diào)節(jié)酒精度為6%vol。

醋酸發(fā)酵：按酒醪體積的12%加入醋酸菌種子液，裝液量25%，在29 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，從接種當(dāng)天開始，每天取醋液測(cè)總酸含量，當(dāng)總酸含量開始下降，立即加鹽結(jié)束發(fā)酵。

添加黃酮：將提取的黃酮添加到苦蕎醋中后充分混勻，靜置1 h后經(jīng)過濾得半成品，再經(jīng)調(diào)配后得到苦蕎醋成品。

1.3.3 單因素優(yōu)化試驗(yàn)

粉碎度對(duì)糖化效果的影響：將粉碎15 s的苦蕎粉用不同目數(shù)的篩子進(jìn)行篩選，分別取未過篩、20～40目、40～60目、60～80目、≥80目的苦蕎粉各10 g，制成糖化醪液，測(cè)還原糖含量。

糊化對(duì)發(fā)酵的影響：分別用提取黃酮、多糖的苦蕎粉及原粉（未提取黃酮、多糖的苦蕎粉）160 g按料水比1∶4（g∶mL）（發(fā)酵液體積為800 mL），按沸水浴糊化和不糊化共四種（以下簡(jiǎn)稱“提”、“提糊”、“未提”、“未提糊”）處理后進(jìn)行酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵，除糊化過程外其他工藝均與操作要點(diǎn)相同，分別測(cè)定每個(gè)階段發(fā)酵液的還原糖、酒精等的含量及酒精發(fā)酵后的上清液體積。

蛋白酶的添加對(duì)發(fā)酵的影響：?。?0目提取多糖黃酮的苦蕎粉和原粉各100 g，加水比1∶4（g∶mL），分別在糖化前、后添加酸性蛋白酶（2.5%）、中性蛋白酶（1.3%）、堿性蛋白酶（0.4%），進(jìn)行發(fā)酵，以不添加蛋白酶為空白對(duì)照，測(cè)定發(fā)酵液中酒精、總酸、氨基酸態(tài)氮、多糖和黃酮等的含量。

不同的黃酮處理方式對(duì)苦蕎醋中最終黃酮含量的影響：將提取出來的黃酮加入經(jīng)提取多糖黃酮后的苦蕎粉釀制的醋液中。

1.3.4 測(cè)定方法

還原糖含量測(cè)定：參考GB 5009.7—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中還原糖的測(cè)定》[12]；乙醇含量的測(cè)定：參考GB 5009.225—2016《酒中乙醇濃度的測(cè)定》[13]；發(fā)酵液中黃酮含量的測(cè)定：按照參考文獻(xiàn)[14]的方法測(cè)定；發(fā)酵液中多糖含量的測(cè)定：按照參考文獻(xiàn)[15]的方法測(cè)定；酸含量的測(cè)定：參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》[16]；氨基酸態(tài)氮含量的測(cè)定：參照GB 5009.235—2016《食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定》[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 粉碎度對(duì)糖化效果的影響

圖1 粉碎度對(duì)苦蕎粉糖化效果的影響Fig.1 Effect of fragmentation degree on tartary buckwheat powder saccharification

由圖1可知，未過篩（＜20目）的苦蕎粉糖化醪糖化效果最差（還原糖含量11.07 g/100 g），粉碎度為40～60目的苦蕎粉糖化醪糖化效果最好（還原糖含量12.82 g/100 g），略高于粉碎度60～80目、20～40目、≥80目的苦蕎粉糖化醪中的還原糖含量，后兩者可能因?yàn)榭嗍w粉太細(xì)，苦蕎多糖充分溶出后阻礙了還原糖的進(jìn)一步溶解。

2.2 糊化對(duì)發(fā)酵的影響

2.2.1 糊化對(duì)還原糖含量的影響

根據(jù)苦蕎醋的工藝流程，分別取160 g原粉和已提黃酮多糖的苦蕎粉進(jìn)行糊化、液化、糖化處理，另分別取160 g不做糊化處理，直接液化、糖化，分別測(cè)四種試驗(yàn)的還原糖含量，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，糊化能夠提高還原糖的含量。糊化使得提取黃酮和多糖的苦蕎粉與原粉中的還原糖含量分別提高了32.57%、7.33%，且糊化后提取多糖黃酮的發(fā)酵液還原糖含量稍高于原粉。

圖2 糊化對(duì)還原糖含量的影響Fig.2 Effect of gelatinization on reducing sugar content

2.2.2 糊化對(duì)酒精含量的影響

由圖3可知，未經(jīng)糊化處理提取黃酮多糖的苦蕎粉酒精發(fā)酵液酒精含量（9.85%vol）比糊化的酒精含量（8.3%vol）提高了19%，原粉糊化處理的酒精發(fā)酵液酒精含量比未糊化的酒精含量提高了11%。在酒精發(fā)酵階段，提取黃酮多糖經(jīng)糊化處理的發(fā)酵液黏稠度比未糊化處理的發(fā)酵液黏稠度高，導(dǎo)致還原糖利用不完全，因而發(fā)酵液中還原糖含量高但酒精含量低。

圖3 糊化對(duì)酒精含量的影響Fig.3 Effect of gelatinization on alcohol content

2.2.3 糊化對(duì)酒精發(fā)酵上清液體積的影響

糊化后靜置30 min，糊化對(duì)酒精發(fā)酵醪上清液體積的影響結(jié)果見圖4。

圖4 糊化對(duì)酒精發(fā)酵液上清液體積的影響Fig.4 Effect of gelatinization on the volume of supernatant of alcohol fermentation broth

由圖4可知，原粉糊化后的酒精發(fā)酵液上清液體積（80mL）不到未糊化體積（260 mL）的1/3。未經(jīng)過糊化處理的提取黃酮多糖的苦蕎粉酒精發(fā)酵液上清液體積（340 mL）高于原粉糊化后發(fā)酵所得上清液體積（300 mL），這是由于多糖的提取使得發(fā)酵液黏度降低，液體和固體更易分離。

綜上所述，蒸煮糊化對(duì)苦蕎醋的發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)并不明顯，提取黃酮和多糖的苦蕎粉采用不糊化的發(fā)酵工藝效益更高。所以苦蕎醋的釀造工藝選擇不糊化處理。

2.3 添加蛋白酶對(duì)發(fā)酵的影響[18]

2.3.1 添加蛋白酶對(duì)酒精含量的影響

圖5 添加蛋白酶對(duì)酒精含量的影響Fig.5 Effect of protease addition on alcohol content

由圖5可知，在提取黃酮、多糖的苦蕎粉和原粉的液態(tài)法釀醋過程中，糖化前后添加酸性、中性、堿性蛋白酶對(duì)發(fā)酵醪酒精含量的影響較大，對(duì)原粉均有明顯的提高，其中糖化后加入酸性蛋白酶的酒精含量最高（9.15%vol），比空白樣（5.55%vol）增加65%；對(duì)提取黃酮、多糖的苦蕎粉，蛋白酶的添加不如對(duì)原粉的影響大，但糖化后加入中性蛋白酶的酒精含量最高（9.48%vol），稍微高于空白（9.05%vol）。從酒精含量來看，提取黃酮多糖的苦蕎粉產(chǎn)酒精量?jī)?yōu)于原粉，蛋白酶的添加有助于酒精發(fā)酵，這可能是因?yàn)槎嗵呛忘S酮提取后，去掉了水溶性和醇溶性物質(zhì)，剩下淀粉等糖類物質(zhì)的占比增加，黏度降低，提高酶及微生物的作用效率，導(dǎo)致酒精含量增加。

2.3.2 添加蛋白酶對(duì)總酸的影響

從醋酸發(fā)酵開始，每天取樣測(cè)酸度，直到酸度略有下降，停止取樣，結(jié)束發(fā)酵。

由圖6可知，不同處理的原粉總酸含量在發(fā)酵第1、2天無明顯差異，第3天后總酸含量開始產(chǎn)生差距，在第6天時(shí)達(dá)到最高總酸含量；由圖7可知，提取黃酮多糖的苦蕎粉醋酸發(fā)酵的第1天總酸含量開始上升，糖化后添加中性蛋白酶的酒精含量從第3天開始高于其他處理，第6天時(shí)達(dá)到最大值（5.2 g/100 mL）。

圖6 蛋白酶對(duì)未提取黃酮和多糖的苦蕎醋酸發(fā)酵時(shí)總酸的影響Fig.6 Effect of protease on total acid in the acetic fermentation process of tartary buckwheat without extracting flavonoids and polysaccharides

由圖7可知，相比于蛋白酶對(duì)酒精發(fā)酵階段的影響，蛋白酶的添加對(duì)總酸含量影響不大，可能是因?yàn)榈鞍酌笇?duì)酵母菌的影響比醋酸菌明顯。提取黃酮多糖的苦蕎粉與原粉在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，均是糖化后添加中性蛋白酶的處理總酸含量最高（5.23 g/100 mL、5.2 g/100 mL），但含量無顯著差異。

圖7 蛋白酶對(duì)提取黃酮和多糖后的苦蕎醋酸發(fā)酵時(shí)總酸的影響Fig.7 Effect of protease on total acid in the acetic fermentation process of tartary buckwheat after extracting flavonoids and polysaccharides

2.3.3 添加蛋白酶對(duì)氨基酸態(tài)氮的影響

分別取酒精發(fā)酵結(jié)束后、剛添加醋酸菌種子液時(shí)（醋酸發(fā)酵第0天）和醋酸發(fā)酵結(jié)束后的上清液，測(cè)定氨基酸態(tài)氮含量。結(jié)果見圖8和圖9。

由圖8和圖9可知，醋酸發(fā)酵初始樣氨基酸態(tài)氮含量均下降，是因?yàn)榫凭l(fā)酵完后加水將酒精度調(diào)到6%vol，使得氨基酸態(tài)氮含量被稀釋；醋酸發(fā)酵后又小幅度降低，可能是因?yàn)榇姿峋L過程消耗。與空白樣相比，蛋白酶的添加可以增加苦蕎醋中氨基酸態(tài)氮的含量。提取黃酮多糖的苦蕎粉糖化后添加酸性蛋白酶效果最好，其含量（0.12g/100mL）比空白（0.07 g/100 mL）提高了71.43%。

圖8 未提取黃酮和多糖苦蕎在發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮含量的變化Fig.8 Changes in amino acid nitrogen content in the fermentation process of tartary buckwheat without extracting flavonoids and polysaccharides

圖9 提取黃酮和多糖后苦蕎在發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮含量的變化Fig.9 Changes of amino acid nitrogen content in the fermentation process of tartary buckwheat after extracting flavonoids and polysaccharides

2.3.4 添加蛋白酶對(duì)多糖的影響

圖10 添加蛋白酶對(duì)多糖含量的影響Fig.10 Effect of protease addition on polysaccharides contents

由圖10可知，原粉發(fā)酵液多糖含量均高于提取黃酮多糖的苦蕎粉發(fā)酵液的含量，因?yàn)樵垲A(yù)處理時(shí)未提取多糖，兩者醋酸發(fā)酵液多糖含量均高于酒精發(fā)酵液。原粉酒精發(fā)酵液多糖含量參差不齊，酒精發(fā)酵結(jié)束后的最高多糖含量（6.95mg/mL）為糖化前添加堿性蛋白酶，是空白（2.49mg/mL）的兩倍多，而醋酸發(fā)酵結(jié)束后的最高和最低多糖含量分別為糖化后添加酸性蛋白酶（8.72 mg/mL）和未添加蛋白酶（2.51 mg/mL）；提取多糖黃酮的苦蕎粉醋酸發(fā)酵液多糖含量均高于空白（2.06 mg/mL），糖化后添加堿性蛋白酶的醋酸發(fā)酵液多糖含量最高（3.44 mg/mL），可知蛋白酶的添加有助于多糖的溶出或生成。

2.3.5 添加蛋白酶對(duì)黃酮的影響

由圖11可知，原粉的醋酸發(fā)酵液相比于酒精發(fā)酵液，除在糖化后添加中性蛋白酶的處理黃酮含量上升了0.04mg/mL外，其余處理均降低，糖化后添加中性蛋白酶的處理黃酮含量最高（4 mg/mL），其余五種發(fā)酵液相差不大。提取多糖黃酮的苦蕎粉醋酸發(fā)酵液相比于酒精發(fā)酵液，除糖化后添加中性蛋白酶的黃酮含量小幅度降低外，其余處理黃酮含量明顯降低。

圖11 添加蛋白酶對(duì)黃酮含量的影響Fig.11 Effect of protease addition on flavonoids contents

綜合以上蛋白酶的添加對(duì)酒精含量和總酸含量的影響可知，未提取黃酮多糖的苦蕎粉在發(fā)酵過程中酒精含量均高于未添加蛋白酶的處理，總酸含量幾乎相等。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，添加蛋白酶的處理樣中氨基酸態(tài)氮、多糖、黃酮均高于空白樣，以酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵為主，結(jié)合各項(xiàng)指標(biāo)，糖化后加入中性蛋白酶的處理總體優(yōu)于其他六種蛋白酶添加方式，所以選擇糖化后加入中性蛋白酶進(jìn)行后續(xù)苦蕎醋發(fā)酵。

2.4 不同的黃酮處理方式對(duì)苦蕎醋中最終黃酮含量的影響

在以苦蕎為原料釀制苦蕎醋的過程中，黃酮損失較大，降低了苦蕎醋的保健功能，本試驗(yàn)在以提取多糖黃酮的苦蕎粉釀制的苦蕎醋中加入預(yù)處理時(shí)提取出的黃酮，并在同樣條件下以未提取多糖黃酮的苦蕎粉釀造苦蕎醋，對(duì)比兩種黃酮處理方式對(duì)苦蕎醋中最終黃酮含量的影響。將提取出來的黃酮按20.78 mg/g加入160 g苦蕎粉釀制的醋中，結(jié)果如圖12。

由圖12可知，醋酸發(fā)酵結(jié)束后提取黃酮多糖的苦蕎粉釀制的苦蕎醋黃酮含量（1.35 mg/mL）低于原粉（3.02 mg/mL），將預(yù)處理時(shí)提取出的黃酮加入到提取黃酮多糖的苦蕎粉所釀的醋中，其黃酮含量（5.20 mg/mL）比原粉所釀的醋增加72%，高于張素云[19]所釀苦蕎醋黃酮含量（3.53 mg/g），更是遠(yuǎn)高于申瑞玲[20]研究的苦蕎醋（0.496 mg/mL），可知將黃酮提取后加入釀制好的醋中，黃酮的損失較小，可以得到比原粉釀醋黃酮高得多的苦蕎醋。

圖12 不同處理方式對(duì)苦蕎醋黃酮含量的影響Fig.12 Effect of different treatment methods on flavonoids content in Tartary buckwheat vinegar

3 結(jié)論

提高苦蕎醋黃酮含量的工藝研究表明，蒸煮糊化對(duì)苦蕎醋的發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)并不明顯，提取黃酮和多糖的苦蕎粉酒精發(fā)酵液上清液體積比原粉酒精發(fā)酵液上清液體積明顯增加，蛋白酶的添加有助于氨基酸態(tài)氮生成、多糖溶出和酒精發(fā)酵，糖化后添加中性蛋白酶的酒精發(fā)酵液酒精度為9.48%vol，黃酮的損失最小，通過將黃酮提取后再加入苦蕎醋的方式有效的減少黃酮在發(fā)酵過程中的損失，得到的高黃酮苦蕎醋的最佳工藝為破碎度＞40目，糖化后添加中性蛋白酶，不糊化，在提取黃酮、多糖后的苦蕎粉釀制的醋中再加入黃酮（黃酮添加量：苦蕎中提取出的黃酮20.78 mg/g），得到的苦蕎醋中黃酮含量為5.20 mg/mL，高于傳統(tǒng)苦蕎醋黃酮含量，說明將黃酮提取后再加入苦蕎醋的方式能有效減少黃酮在發(fā)酵過程中的損失，從而更進(jìn)一步增加苦蕎醋的養(yǎng)生功效。