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    水稻紋枯病菌對(duì)丙環(huán)唑的敏感性及抗性檢測

    2020-05-11 06:06:33劉世江趙琪君丁怡李榮玉文小東宋星陳
    關(guān)鍵詞:丙環(huán)唑

    劉世江 趙琪君 丁怡 李榮玉 文小東 宋星陳

    摘要:【目的】測定水稻紋枯病菌對(duì)丙環(huán)唑的敏感性,并進(jìn)行水稻紋枯病菌菌株對(duì)丙環(huán)唑的抗性檢測,為水稻紋枯病的科學(xué)用藥及田間抗性種群監(jiān)測提供參考。【方法】以2017年從貴州、河南和湖南省7個(gè)市(縣、區(qū))采集分離的106株水稻紋枯病菌為研究對(duì)象,采用菌絲生長速率法測定水稻紋枯病菌對(duì)丙環(huán)唑的敏感性,建立敏感基線;以敏感基線值的10倍對(duì)2018和2019年采集的水稻紋枯病菌進(jìn)行丙環(huán)唑抗性檢測。【結(jié)果】供試106株水稻紋枯病菌菌株對(duì)丙環(huán)唑的抑制中濃度(EC50)為0.022~1.561 μg/mL,EC50均值為0.731±0.031 μg/mL。水稻紋枯病菌菌株的敏感性頻率分布呈連續(xù)單峰曲線,且Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗(yàn)結(jié)果符合正態(tài)分布(W=0.985,P=0.257>0.05),可將EC50均值0.731±0.031 μg/mL作為水稻紋枯病菌對(duì)丙環(huán)唑的敏感基線參考值。聚類分析結(jié)果表明,水稻紋枯病菌對(duì)丙環(huán)唑的敏感性差異與菌株的地理來源無明顯相關(guān)性。2018和2019年抗性檢測結(jié)果表明,水稻紋枯病菌對(duì)丙環(huán)唑仍表現(xiàn)敏感,僅發(fā)現(xiàn)1株低水平抗性菌株(18MT2)?!窘Y(jié)論】田間水稻紋枯病菌對(duì)丙環(huán)唑的敏感性仍較高,可繼續(xù)使用丙環(huán)唑防治水稻紋枯病。

    關(guān)鍵詞: 水稻紋枯病菌;丙環(huán)唑;敏感基線;抗性檢測

    0 引言

    【研究意義】由立枯絲核菌(Rhizoctonia solani Kühn)引起的水稻紋枯病是嚴(yán)重危害水稻的三大病害之一(Chen et al.,2019),在我國稻區(qū)均有發(fā)生,一般造成10%~30%的產(chǎn)量損失,嚴(yán)重時(shí)達(dá)50%以上,對(duì)我國水稻產(chǎn)量和質(zhì)量造成嚴(yán)重威脅(連娜娜等,2018)。由于栽培管理措施及環(huán)境條件的影響,水稻紋枯病已成為我國南方一些地區(qū)的水稻病害之首(譚清群等,2017)。目前,化學(xué)防治仍是控制水稻紋枯病的主要方法(羊紹武等,2019),但部分藥劑常年單一使用,會(huì)降低病原菌對(duì)殺菌劑的敏感性(劉妍等,2018)。因此,檢測田間水稻紋枯病菌對(duì)殺菌劑的敏感性有助于水稻紋枯病的有效防控,對(duì)水稻的安全生產(chǎn)具有重要意義?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】建立敏感基線是進(jìn)行抗性檢測的基礎(chǔ),而抗性檢測結(jié)果對(duì)于指導(dǎo)田間用藥有著重要意義。目前關(guān)于水稻紋枯病菌殺菌劑的敏感性研究已有較多報(bào)道。戴德江等(2017)研究表明,水稻紋枯病菌對(duì)氯苯醚酰胺的敏感性基線為0.021±0.008 mg/L;譚清群等(2017)測定了水稻紋枯病菌對(duì)噻呋酰胺和己唑醇的敏感性,其抑制中濃度(EC50)均值分別為0.0712±0.0594和0.0251±0.0158 μg/mL;楊帆等(2017)采用菌絲生長速率法測定了101株紋枯病菌對(duì)苯醚甲環(huán)唑的敏感性,結(jié)果表明,101株菌株的EC50均值為1.8721 μg/mL;連娜娜等(2018)建立了水稻紋枯病菌對(duì)咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑的敏感基線,分別為19.8194和29.3614 mg/L,并發(fā)現(xiàn)了對(duì)咪鮮胺敏感性下降的亞群體;張?jiān)疲?018)建立了水稻紋枯病菌對(duì)噻呋酰胺和戊唑醇的敏感基線,分別為0.1566和1.3393 μg/mL,并發(fā)現(xiàn)多數(shù)水稻紋枯病菌對(duì)這兩種藥劑產(chǎn)生了抗藥性。丙環(huán)唑是一種具有保護(hù)和治療作用的內(nèi)吸性三唑類殺菌劑,主要通過抑制麥角甾醇的生物合成從而干擾病原菌的生長發(fā)育,降低其致病力(楊石有等,2016),對(duì)小麥紋枯病菌、水稻稻瘟病菌和水稻紋枯病菌等植物病原真菌具有良好的抑制活性(趙琪君等,2019)。甘林等(2016)采用菌絲生長速率法研究玉米小斑病菌對(duì)丙環(huán)唑的敏感性,發(fā)現(xiàn)了敏感性下降的亞群體;徐建強(qiáng)等(2017a)研究小麥紋枯病菌和小麥全蝕病菌對(duì)丙環(huán)唑的敏感性,也發(fā)現(xiàn)了敏感性下降的亞群體?!颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前,針對(duì)水稻紋枯病菌對(duì)丙環(huán)唑的敏感性研究較少?!緮M解決的關(guān)鍵問題】以2017年從貴州、河南和湖南省7個(gè)市(縣)采集分離的106株水稻紋枯病菌為研究對(duì)象,采用菌絲生長速率法測定水稻紋枯病菌對(duì)丙環(huán)唑的敏感性,建立敏感基線,并對(duì)2018和2019年從田間分離的水稻紋枯病菌菌株進(jìn)行丙環(huán)唑抗性檢測,以期為水稻紋枯病的科學(xué)用藥及田間抗性種群監(jiān)測提供參考。

    1 材料與方法

    1. 1 試驗(yàn)材料

    1. 1. 1 供試病原菌 2017—2019年從貴州?。ㄩ_陽、惠水、湄潭、黃平)、湖北?。ㄎ溲ā⑽錆h江夏)和湖南?。ㄩL沙市)7個(gè)市(縣、區(qū))的水稻田采集水稻紋枯病發(fā)病樣本,經(jīng)單菌絲分離純化共獲得223株菌株。其中2017年106株,分別為貴州省黃平(HP)13株、湄潭(MT)17株、開陽(KY)12株、惠水(HS)17株,湖北省武穴(WX)19株、武漢江夏(JX)15株,湖南長沙(CS)13株;2018年52株,2019年65株。

    1. 1. 2 供試藥劑 丙環(huán)唑原藥(96%,連云港埃森化學(xué)有限公司),用丙酮配制10000 μg/mL母液,置于4 ℃冰箱備用。

    1. 1. 3 供試培養(yǎng)基 水瓊脂培養(yǎng)基:瓊脂15.00 g,去離子水1000 mL,121 ℃滅菌20 min備用。PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200.00 g、葡萄糖20.00 g、瓊脂17.00~20.00 g,去離子水1000 mL,121 ℃滅菌20 min備用。AEA培養(yǎng)基:酵母粉5.00 g、KCl 0.50 g、MgSO4 0.25 g、KH2PO4 1.50 g、NaNO3 6.00 g、丙三醇20 mL、瓊脂粉20.00 g,去離子水1000 mL。

    1. 2 試驗(yàn)方法

    1. 2. 1 水稻紋枯病菌對(duì)丙環(huán)唑的敏感性測定 采用菌絲生長速率法測定(孫雪等,2015)。將丙環(huán)唑母液用無菌水稀釋為系列梯度濃度,按比例加入到AEA培養(yǎng)基中,混勻倒入滅菌培養(yǎng)皿,配制含丙環(huán)唑梯度濃度的AEA培養(yǎng)基。將培養(yǎng)好的水稻紋枯病菌用6 mm打孔器沿菌落邊緣打取菌餅,接種至含藥培養(yǎng)基上,以不加藥為空白對(duì)照,置于培養(yǎng)箱中28 ℃黑暗培養(yǎng)24 h,每處理3次重復(fù)。采用十字交叉法測量菌落直徑,按公式計(jì)算菌絲生長抑制率。菌絲生長抑制率(%)=(對(duì)照菌落生長直徑-處理菌落生長直徑)/(對(duì)照菌落生長直徑-6)×100。

    1. 2. 2 敏感基線的建立 參照徐建強(qiáng)等(2017b)、楊帆等(2017)的方法建立敏感基線,稍作修改。將水稻紋枯病菌對(duì)丙環(huán)唑的敏感性由高到低劃分成7組,將EC50最大值減最小值除以7得到組距,以最小值為最下限,統(tǒng)計(jì)各區(qū)間的菌株數(shù),計(jì)算其所占總菌株數(shù)的頻率(%)。以劃分區(qū)間的組中值為x軸,相應(yīng)區(qū)間的頻率(%)為y軸,繪制水稻紋枯病菌對(duì)丙環(huán)唑的敏感性頻率分布圖。根據(jù)敏感性頻率分布情況和Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗(yàn)結(jié)果,建立水稻紋枯病菌對(duì)丙環(huán)唑的敏感基線。

    1. 2. 3 水稻紋枯病菌對(duì)丙環(huán)唑的抗性檢測 以敏感基線值的10倍作為水稻紋枯病菌對(duì)丙環(huán)唑抗性的區(qū)分劑量,配制含藥PDA培養(yǎng)基,接種培養(yǎng)活化的菌株,以不加藥為空白對(duì)照。含菌培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱中28 ℃黑暗培養(yǎng)24 h,將能在含藥培養(yǎng)基上正常生長的菌株重新活化,測定其EC50,EC50與敏感基線的比值即為抗性倍數(shù)(鮮菲等,2015;祁之秋等,2017)。

    1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

    試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過Excel 2010計(jì)算毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)(R)和EC50,運(yùn)用SPSS 24.0進(jìn)行Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗(yàn)、單因素方差分析和系統(tǒng)聚類分析,用Origin 2017作圖。

    2 結(jié)果與分析

    2. 1 水稻紋枯病菌對(duì)丙環(huán)唑的敏感性及敏感基線建立

    測定結(jié)果(圖1-A)表明,供試106株水稻紋枯病菌菌株對(duì)丙環(huán)唑的敏感性呈連續(xù)性分布,EC50為0.022~1.561 μg/mL,敏感性較弱菌株的EC50是敏感性較強(qiáng)菌株EC50的70.95倍,EC50均值為0.731±0.031 μg/mL。在EC50值范圍內(nèi),從0.020 μg/mL開始,組距為0.226 μg/mL,將其劃分為7個(gè)組,統(tǒng)計(jì)每組的菌株數(shù)量,計(jì)算其占總菌株數(shù)的頻率,繪制敏感性頻率分布圖(圖1-B)。在敏感性頻率分布中,0.698~0.924 μg/mL區(qū)間的菌株數(shù)量最多,其頻率為37.70%,敏感性頻率分布為連續(xù)單峰曲線,且Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗(yàn)顯示供試菌株對(duì)丙環(huán)唑的敏感性頻率近似正態(tài)分布(W=0.985,P=0.257>0.05)。在藥劑作用下,根據(jù)病原菌群體對(duì)藥劑敏感性呈正態(tài)分布的原理(蓋鈞鎰,2000),可將EC50均值0.731±0.031 μg/mL作為水稻紋枯病菌對(duì)丙環(huán)唑敏感基線的參考值。

    2. 2 不同稻區(qū)水稻紋枯病菌對(duì)丙環(huán)唑的敏感性比較結(jié)果

    由表1可知,來自7個(gè)市(縣、區(qū))的水稻紋枯病菌群體對(duì)丙環(huán)唑的敏感性無顯著差異(P>0.05),其EC50均值為0.643~0.836 μg/mL。其中,貴州惠水的水稻紋枯病菌菌株較敏感,EC50為0.022~1.217 μg/mL,均值為0.643 μg/mL;湖北武漢江夏的水稻紋枯病菌菌株較不敏感,EC50為0.290~1.499 μg/mL,均值為0.836 μg/mL。

    2. 3 不同地理來源菌株對(duì)丙環(huán)唑敏感性的系統(tǒng)聚類分析結(jié)果

    參照徐建強(qiáng)等(2017b)的方法,從每個(gè)稻區(qū)隨機(jī)選取8株菌株,共56株菌株進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析,結(jié)果(圖2)顯示,可將56株菌株分為4個(gè)聚類組,第1組共25株菌株(JX 5株、MT 2株、WX 6株、CS 3株、HP 3株、HS 2株、KY 4株);第2組有4株菌株,均為開陽菌株;第3組共16株(JX 2株、CS 3株、MT 3株、HP 3株、WX 2株、HS 3株);第4組共11株菌株(CS 2株、HP 2株、HS 3株、JX 1株、MT 3株)。從聚類組可知,不同地理來源的水稻紋枯病菌菌株可聚在同一聚類組中,只有貴州開陽的4株菌株單獨(dú)聚在一組,表明水稻紋枯病菌對(duì)丙環(huán)唑的敏感性差異與菌株地理來源無明顯相關(guān)性。

    2. 4 水稻紋枯病菌對(duì)丙環(huán)唑的抗性檢測結(jié)果

    以敏感基線值的10倍(7.310 μg/mL)作為區(qū)分劑量,對(duì)2018和2019年從7個(gè)稻區(qū)分離的水稻紋枯病菌菌株進(jìn)行抗藥性檢測,結(jié)果表明,2018年分離的52株水稻紋枯病菌菌株中,貴州湄潭稻區(qū)有1株菌株(18MT2)能在含藥的PDA培養(yǎng)基上生長,測定該菌株對(duì)丙環(huán)唑的敏感性,其EC50為2.381 μg/mL,抗性倍數(shù)為3.26;2019年分離的65株水稻紋枯病菌菌株中未檢測到抗性菌株。

    3 討論

    建立敏感基線是對(duì)病原菌進(jìn)行抗性監(jiān)測及抗性治理的基礎(chǔ)(韓永超等,2014)。本研究測定了106株水稻紋枯病菌菌株對(duì)丙環(huán)唑的敏感性,根據(jù)其敏感性頻率符合正態(tài)分布的特點(diǎn),建立了水稻紋枯病菌對(duì)丙環(huán)唑的敏感基線(0.731 μg/mL)。孫樹青等(2016)測定水稻紋枯病菌對(duì)丙環(huán)唑的EC50為0.045 μg/mL,與本研究的EC50均值相差較大,但其EC50在本研究測定結(jié)果的EC50范圍內(nèi),表明不同水稻紋枯病菌對(duì)丙環(huán)唑的敏感性存在差異。丙環(huán)唑?qū)┰嚨?06株水稻紋枯病菌菌株的EC50為0.022~1.561 μg/mL,敏感性較弱菌株的EC50是敏感性較強(qiáng)菌株EC50的70.95倍,敏感性相差70.95倍,不同水稻紋枯病菌的EC50跨度較大,可能與病原菌本身的生理差異及病原菌群體間的復(fù)雜多樣性有關(guān)(祁之秋等,2012)。不同地區(qū)間的水稻紋枯病菌對(duì)丙環(huán)唑的敏感性差異不顯著,且聚類分析結(jié)果表明,水稻紋枯病菌對(duì)丙環(huán)唑的敏感性差異與菌株地理來源無明顯相關(guān)性,說明不同地區(qū)水稻紋枯病菌對(duì)丙環(huán)唑的敏感性基本在一個(gè)相近的水平。水稻紋枯病菌的菌絲融合群和異核現(xiàn)象可能會(huì)導(dǎo)致菌株間致病力和敏感性存在差異,陳濤等(2010)研究報(bào)道AG-1融合群菌株間致病力差異無相關(guān)性;白慶榮等(2014)研究發(fā)現(xiàn)高山紅景天立枯病菌的不同菌絲融合群對(duì)殺菌劑的敏感性存在差異;張優(yōu)等(2017)研究表明水稻紋枯病菌多核菌株的致病性較強(qiáng),而雙核菌株表現(xiàn)出較弱的致病性。水稻紋枯病菌對(duì)丙環(huán)唑敏感性差異與菌絲融合群和異核是否有關(guān),還需進(jìn)一步探究。

    唐正合等(2012)研究表明,丙環(huán)唑?qū)λ炯y枯病菌有較好的抑制作用,且田間對(duì)水稻紋枯病的防治效果達(dá)89.15%。郭地(2014)通過丙環(huán)唑誘導(dǎo)水稻紋枯病菌進(jìn)行抗性風(fēng)險(xiǎn)分析,認(rèn)為水稻紋枯病菌對(duì)丙環(huán)唑的抗性屬于低風(fēng)險(xiǎn)。本研究以建立的敏感基線為基礎(chǔ),檢測了2018和2019年分離的117株水稻紋枯病菌菌株對(duì)丙環(huán)唑的抗性,發(fā)現(xiàn)多數(shù)水稻紋枯病菌對(duì)丙環(huán)唑仍敏感,僅發(fā)現(xiàn)一株低抗菌株(18MT2),抗性倍數(shù)為3.26。因此,丙環(huán)唑在水稻紋枯病的防治中仍具有較好的應(yīng)用價(jià)值,但需監(jiān)測田間水稻紋枯病對(duì)丙環(huán)唑的抗性水平變化;同時(shí),使用丙環(huán)唑防治水稻紋枯病時(shí)應(yīng)注意與其他作用機(jī)理不同的藥劑混勻或交替使用,以延長藥劑的使用壽命。

    4 結(jié)論

    建立了水稻紋枯病菌對(duì)丙環(huán)唑的敏感基線(0.731±0.031 μg/mL),檢測2018和2019年田間水稻紋枯病菌菌株對(duì)丙環(huán)唑的抗性水平,僅發(fā)現(xiàn)1株低抗菌株(18MT2)。田間水稻紋枯病菌對(duì)丙環(huán)唑的敏感性仍較高,可繼續(xù)使用丙環(huán)唑防治水稻紋枯病。

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    (責(zé)任編輯 麻小燕)

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