廣西家蠶血液型膿病發(fā)病因子及其病原分子系統(tǒng)發(fā)育分析

王霞 黃旭華 蔣滿貴 唐亮 董桂清 黃深惠 石美寧 潘志新

摘要：【目的】明確病原[家蠶核型多角體病毒（BmNPV）]、寄主（家蠶品種）和環(huán)境條件（溫濕度）的相關(guān)性并掌握BmNPV的感染力差異及傳播規(guī)律，為蠶業(yè)生產(chǎn)上有效防控家蠶血液型膿病提供科學(xué)依據(jù)?！痉椒ā繙y(cè)定從廣西不同蠶區(qū)和不同季節(jié)收集的BmNPV毒株在不同溫濕度條件下對(duì)不同家蠶品種的半數(shù)致死濃度（LC50），調(diào)查病原、寄主和環(huán)境條件三者對(duì)家蠶血液型膿病發(fā)生的影響;并基于bro-a和bro-c基因序列構(gòu)建不同來(lái)源BmNPV毒株的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)及進(jìn)行相似性和遺傳距離分析?！窘Y(jié)果】15株不同來(lái)源BmNPV毒株對(duì)家蠶品種兩廣二號(hào)的LC50為2.1×106～4.2×106多角體/mL，毒株間的差異不顯著（P>0.05）;不同BmNPV毒株在不同環(huán)境條件[春季（溫度25 ℃和濕度90%）、夏季（溫度35 ℃和濕度95%）、秋季（溫度30 ℃和濕度85%）]下對(duì)家蠶的LC50排序均表現(xiàn)為春季>秋季>夏季，在夏季和秋季條件下，不同蠶品種對(duì)BmNPV的感染抵抗力排序?yàn)楣鹦QN2>兩廣二號(hào)>桂蠶2號(hào)，桂蠶N2對(duì)BmNPV的感染抵抗力顯著高于兩廣二號(hào)和桂蠶2號(hào)（P<0.05）。不同BmNPV毒株在基于bro-a和bro-c基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)上均聚在同一分支上，不同BmNPV毒株間的bro-a基因序列相似性很高、遺傳距離較小，但不同BmNPV毒株間的bro-c基因序列相似度相對(duì)低、遺傳距離相對(duì)較大。【結(jié)論】溫濕度條件是廣西蠶區(qū)家蠶血液型膿病發(fā)生的重要因子，且血液型膿病的發(fā)生流行與家蠶品種抗性也有密切關(guān)系。

關(guān)鍵詞： 家蠶;家蠶核型多角體病毒（BmNPV）;感染力;發(fā)病因子;bro-a基因;bro-c基因

0 引言

【研究意義】廣西屬于亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，高溫多雨，有利于種養(yǎng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展的同時(shí)也適宜病原微生物繁殖感染而引發(fā)病害。隨著國(guó)家“東桑西移”工程的推進(jìn)，廣西蠶業(yè)取得了長(zhǎng)足發(fā)展，其蠶繭產(chǎn)量自2005年起已成為全國(guó)第一大?。▍^(qū)），但在實(shí)際生產(chǎn)中同樣面臨著蠶病的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，據(jù)統(tǒng)計(jì)廣西蠶業(yè)生產(chǎn)因蠶病發(fā)生而造成的蠶繭損失在15%～20%，每年損失蠶繭數(shù)萬(wàn)噸，其中由家蠶核型多角體病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV）感染引起的血液型膿病是最普遍的傳染性蠶病之一（閉立輝，2005;邵榆嵐等，2017;唐芬芬等，2019）。蠶病的發(fā)生是家蠶與病原微生物在一定環(huán)境條件下相互作用的結(jié)果，因此，調(diào)查BmNPV來(lái)源、家蠶品種及環(huán)境條件對(duì)家蠶血液型膿病的影響，有利于明確引發(fā)家蠶血液型膿病發(fā)生的關(guān)鍵因素，對(duì)科學(xué)防控家蠶血液型膿病危害及促進(jìn)蠶業(yè)持續(xù)健康發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】鑒于家蠶血液型膿病對(duì)蠶業(yè)生產(chǎn)的嚴(yán)重危害性，至今已有諸多學(xué)者對(duì)其病原感染力及分子特征進(jìn)行深入研究（黃深惠等，2012;Xu et al.，2013;唐芬芬等，2014;董戰(zhàn)旗和潘敏慧，2017）。孫京臣等（2001）通過(guò)調(diào)查廣東 8個(gè)地區(qū)BmNPV對(duì)家蠶的致病力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)的BmNPV致病力存在明顯差異。白興榮等（2010）在調(diào)查云南蠶區(qū)不同地區(qū)BmNPV對(duì)家蠶的致病力時(shí)也發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)的BmNPV致病力有明顯差異，其半數(shù)致死濃度（LC50）相差最高達(dá)5個(gè)數(shù)量級(jí)。黃深惠等（2012）調(diào)查廣西蠶區(qū)10個(gè)地方BmNPV樣品對(duì)家蠶的致病力，結(jié)果表明廣西南部BmNPV的致病力普遍高于廣西北部BmNPV，其LC50差異最高達(dá)9倍。有關(guān)Bm-NPV基因的研究也取得重要進(jìn)展，Maeda和Majima（1990）測(cè)序獲得BmNPV全基因組，并證實(shí)該基因組是一個(gè)閉合環(huán)狀的超螺旋結(jié)構(gòu)DNA分子。家蠶BmNPV基因組全長(zhǎng)為128413 bp，包含136個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORF）（Gomi et al.，1999;吳小峰，2006），但不同BmNPV株系的基因組核苷酸組成略有差異。此外，已有研究證明bro基因是BmNPV基因組中的一種重要基因簇，是影響病毒復(fù)制與分化的因子，在病毒侵染宿主的過(guò)程中發(fā)揮重要作用（龐敏，2007;周敬波，2012;張媛媛等，2016）。Gomi等（1999）研究發(fā)現(xiàn)BmNPV的bro基因存在bro-a、bro-b、bro-c和bro-d等拷貝，且基因拷貝數(shù)及片段大小因病毒毒株不同而有所差異。王霞（2005）通過(guò)比較BmNPV的T3株系和SC7株系，發(fā)現(xiàn)T3株系中存在bro-a、bro-b、bro-c、bro-d和bro-e等5個(gè)拷貝，而SC7株系的相應(yīng)區(qū)域僅有1個(gè)bro拷貝。張媛媛等（2016）利用Red重組技術(shù)敲除bro-d基因，發(fā)現(xiàn)bro-d基因缺失導(dǎo)致BmNPV基因組復(fù)制水平下降。Fujimoto等（2020）對(duì)比不同BmNPV株系的bro基因發(fā)現(xiàn)，La株系僅存在bro-a、bro-c、bro-d和bro-e等4個(gè)拷貝，與T3株系的同源性分別為98.7%、96.5%、95.4%和90.4%?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】廣西是我國(guó)的新興蠶區(qū)，但針對(duì)其主要蠶病病原特征及其流行規(guī)律的研究較少，尤其是有關(guān)家蠶血液型膿病發(fā)生影響因子及BmNPV的分子遺傳特征至今未見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】基于病害發(fā)生的三要素（寄主、病原和環(huán)境條件），調(diào)查廣西蠶區(qū)不同來(lái)源BmNPV毒株的感染力、不同蠶品種對(duì)BmNPV的抵抗力及不同環(huán)境條件下家蠶血液型膿病的發(fā)生情況，并研究不同來(lái)源BmNPV毒株的感染相關(guān)基因特性，旨在明確病原（BmNPV）、寄主（家蠶品種）和環(huán)境條件（溫濕度）的相關(guān)性并掌握BmNPV毒株的感染力差異及傳播規(guī)律，為蠶業(yè)生產(chǎn)上有效防控家蠶血液型膿病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

在廣西南寧（Nn）、河池（Hc）、貴港（Gg）、百色（Bs）和來(lái)賓（Lb）5個(gè)蠶區(qū)，根據(jù)春、夏、秋不同養(yǎng)蠶季節(jié)分別收集BmNPV樣品，樣品具體信息見(jiàn)表1。將收集的家蠶血液型膿病病蠶樣品研磨、過(guò)濾（300目篩）和離心（2000 r/min，10 min）后配制成1×107多角體/mL的病毒液，均勻涂抹于桑葉表面，給四齡起蠶添食，待家蠶發(fā)病后收集病蠶血液，2000 r/min離心10 min，純化各BmNPV樣品，4.0 ℃保存?zhèn)溆?。供試家蠶品種為兩廣二號(hào)、桂蠶2號(hào)和桂蠶N2。2×Pfu PCR MasterMix購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，DNA Marker、pMD18-T載體和大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒（HDP202-1）購(gòu)自上?；萘枭锛夹g(shù)有限公司;SDS、EDTA，NaCl和RaseA及無(wú)水乙醇等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1. 2 不同BmNPV毒株對(duì)家蠶感染力的測(cè)定

將不同BmNPV毒株配制成1.0×107多角體/mL的病毒液，并10倍梯度稀釋成三級(jí)濃度，分別為1.0×107、1.0×106和1.0×105多角體/mL。將各級(jí)濃度病毒液分別添食給兩廣二號(hào)二齡起蠶，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)區(qū)，每區(qū)30頭家蠶，添食方法為每區(qū)用3張桑葉（3 cm×4 cm），取0.6 mL病毒液均勻涂抹在桑葉表面上，給二齡起蠶添食?？瞻讓?duì)照組桑葉表面均勻涂抹蒸餾水。24 h后待家蠶食完桑葉后，用新鮮石灰粉進(jìn)行蠶體蠶座消毒，清理、更換蠶座及墊紙，并更換普通桑葉喂飼。每天上午以新鮮石灰粉進(jìn)行蠶體蠶座消毒及清潔，并更新蠶座和墊紙一次，防止蠶座內(nèi)二次感染。至添毒96 h后家蠶開(kāi)始發(fā)病，調(diào)查發(fā)病蠶頭數(shù)，連續(xù)調(diào)查4 d，計(jì)算各區(qū)家蠶血液型膿病發(fā)病率，并使用GraphPad Prism 6.0的直線內(nèi)插法計(jì)算不同BmNPV毒株對(duì)家蠶的LC50。

1. 3 不同BmNPV毒株在不同環(huán)境條件下對(duì)家蠶感染力的測(cè)定

模擬廣西蠶區(qū)春、夏、秋的氣候條件，在設(shè)置的3種環(huán)境條件[春季（溫度25 ℃和濕度90%）、夏季（溫度35 ℃和濕度95%）、秋季（溫度30 ℃和濕度85%）]下收蟻、飼養(yǎng)兩廣二號(hào)至二齡起蠶;取廣西南寧、河池、來(lái)賓、百色和貴港蠶區(qū)不同季節(jié)（春、夏、秋）的BmNPV毒株進(jìn)行梯度濃度感染家蠶，感染和調(diào)查方式同1.2，計(jì)算各區(qū)的發(fā)病率及LC50。

1. 4 不同BmNPV毒株對(duì)不同家蠶品種感染力的測(cè)定

取家蠶兩廣二號(hào)、桂蠶2號(hào)和桂蠶N2分別在設(shè)置的3種環(huán)境條件（春、夏、秋）下進(jìn)行收蟻、飼養(yǎng)至二齡起蠶，再取廣西南寧、河池和百色3個(gè)蠶區(qū)不同季節(jié)（春、夏、秋）的BmNPV毒株進(jìn)行梯度濃度感染家蠶，感染和調(diào)查方式同1.2，計(jì)算各區(qū)的發(fā)病率及LC50。

1. 5 不同BmNPV毒株分子系統(tǒng)發(fā)育分析

1. 5. 1 DNA提取 將純化后的300.0 μL BmNPV加入300.0 μL提取液（100 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA，2.0 mol/L NaCl，0.1 mol/L Na2CO3，1% SDS，0.1 mg/mL RnaseA，pH 8.0）中，50 ℃孵育20 min，加入300.0 μL NaAC（3 mol/L，pH 5.2），12000 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)入滅菌的1.5 mL離心管中，向離心管加入0.35倍的無(wú)水乙醇。室溫放置10 min，12000 r/min離心15 min，棄上清液;加入1.0 mL 70%乙醇洗滌，12000 r/min離心3 min，棄上清液;沉淀重復(fù)用70%乙醇洗滌一次，棄上清液，保留沉淀，室溫放置2 min后加入100.0 μL 1×TE溶解沉淀，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 5. 2 bro-a和bro-c基因擴(kuò)增 參考已知BmNPV（登錄號(hào)FJ882854.1）中的bro-a和bro-c基因序列，通過(guò)DNASTAR設(shè)計(jì)引物bro-aF（5'-ATGGCTCAAGTT AAAATTGGAG-3'）/bro-aR（5'-GGCTTACAAGTTA AAATTGTTATTC-3'）和bro-cF（5'-GCATGGCTC AAGTTAAAATTGGAG-3'）/bro-cR（5'-TTATTGCGC

GTTGCGCAAACTG-3'），并委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以提取的BmNPV DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系：2×Pfu PCR MasterMix 25.0 μL，bro-aF/bro-aR（10 μmol/L）或bro-cF/bro-cR（10 μmol/L）各2.5 μL，DNA模板0.5 μL，ddH2O 19.5 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性4 min;95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，120 V下電泳20 min，凝膠成像系統(tǒng)成像并進(jìn)行觀察。按照瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒說(shuō)明對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收，連接至pMD18-T載體后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，陽(yáng)性菌落送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，并拼接獲得完整的bro-a和bro-c基因序列。

1. 5. 3 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析 以舞毒蛾核型多角體病毒（LdMNPV）的bro-a和bro-c基因?yàn)橥庠磳?duì)照，利用ClustalX和DNAMAN對(duì)測(cè)序獲得的15份BmNPV樣品的bro-a和bro-c基因序列進(jìn)行比對(duì)分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。利用GraphPad Prism 6.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 不同蠶區(qū)和季節(jié)BmNPV毒株對(duì)家蠶的感染情況

由圖1可看出，從不同蠶區(qū)和季節(jié)采集到的15株BmNPV毒株對(duì)家蠶均有一定的感染力，對(duì)家蠶的LC50在2.1×106～4.2×106多角體/mL。以在百色蠶區(qū)收集的BmNPV感染力相對(duì)較弱，其LC50為4.2×106多角體/mL;在來(lái)賓蠶區(qū)收集的BmNPV感染力最強(qiáng)，其LC50為2.1×106多角體/mL，二者相差2倍。對(duì)不同蠶區(qū)的BmNPV感染力（LC50）進(jìn)行方差分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)均未達(dá)顯著差異水平（P>0.05，下同），說(shuō)明廣西不同蠶區(qū)的BmNPV感染力差異不顯著;同時(shí)對(duì)同一蠶區(qū)不同季節(jié)的BmNPV感染力（LC50）進(jìn)行方差分析，其結(jié)果也表明未達(dá)顯著差異水平，說(shuō)明在廣西蠶區(qū)不同季節(jié)（春、夏、秋）采集的BmNPV在相同環(huán)境條件下其感染力雖有一定差異，但差異不顯著。

2. 2 不同BmNPV毒株在不同環(huán)境條件下對(duì)家蠶的感染情況

由圖2可看出，不同BmNPV毒株在不同環(huán)境條件下對(duì)家蠶的感染力存在一定差異，不同蠶區(qū)BmNPV毒株對(duì)家蠶的LC50排序均表現(xiàn)為春季（4.8×106～11.4×106多角體/mL）>秋季（3.1×106～3.9×106多角體/mL）>夏季（1.4×106～3.1×106多角體/mL），其中，Lb-BmNPV毒株在春季的LC50顯著高于其在夏季和秋季的LC50（P<0.05，下同），Hc-BmNPV毒株在春季的LC50顯著高于其在夏季的LC50。說(shuō)明在夏季的環(huán)境條件下，BmNPV的感染力更強(qiáng)，與蠶業(yè)生產(chǎn)上高溫多濕的5—8月家蠶血液型膿病發(fā)病率較高相吻合。

2. 3 不同BmNPV毒株對(duì)不同家蠶品種的感染情況

由圖3可看出，不同BmNPV毒株對(duì)不同家蠶品種的感染力也存在明顯差異，在夏季和秋季的條件下，不同蠶品種對(duì)BmNPV的感染抵抗力排序?yàn)楣鹦QN2>兩廣二號(hào)>桂蠶2號(hào)，桂蠶N2對(duì)BmNPV的感染抵抗力顯著高于兩廣二號(hào)和桂蠶2號(hào)，而兩廣二號(hào)與桂蠶2號(hào)間的差異不顯著;在春季的條件下，不同家蠶品種對(duì)BmNPV的感染抵抗力差異不顯著?？梢?jiàn)，在高溫多濕季節(jié)不同家蠶品種對(duì)BmNPV的感染抵抗力存在明顯差異，因此在高溫多濕季節(jié)及家蠶血液型膿病高發(fā)地區(qū)應(yīng)選用高抗BmNPV家蠶品種飼養(yǎng)。

2. 4 不同BmNPV毒株分子系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果

通過(guò)PCR擴(kuò)增及測(cè)序分析，獲得15株BmNPV毒株的bro-a和bro-c基因序列，序列長(zhǎng)度約951 bp，不同毒株間存在1～3個(gè)核苷酸差異。經(jīng)序列比對(duì)分析后，分別基于bro-a和bro-c基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。由圖4可知，不同蠶區(qū)和季節(jié)的15株BmNPV毒株在基于bro-a基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)上聚在同一分支上，與LdMNPV的親緣關(guān)系較遠(yuǎn);綜合相似性和遺傳距離分析結(jié)果（表2）發(fā)現(xiàn)，15株BmNPV毒株間的bro-a基因序列相似性為88.2%～100.0%，大部分大于95.0%，其中Bs2毒株與Bs3毒株的相似度達(dá)100.0%;15株BmNPV毒株的遺傳距離為0～9.3，其中，Bs2毒株與Bs3毒株的遺傳距離為0，而Nn1毒株與Hc3毒株的遺傳距離為9.3。說(shuō)明BmNPV的bro-a基因遺傳進(jìn)化較保守，也證實(shí)15株BmNPV毒株間具有很近的親緣關(guān)系。

基于bro-c基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)也顯示，15株BmNPV毒株聚在同一分支上（圖 5），但不同蠶區(qū)不同季節(jié)的BmNPV毒株分散于不同小分支上。綜合相似性和遺傳距離分析結(jié)果（表3）發(fā)現(xiàn)，雖然Bs2毒株與Bs3毒株的相似性最高（100.0%）、遺傳距離最?。?），但大部分毒株間的bro-c基因序列相似性低于bro-a基因序列相似性，而bro-c基因序列的遺傳距離大于bro-a基因序列，如Lb1毒株與Nn3毒株的相似性最低（80.5%）、遺傳距離最大（13.6）。說(shuō)明15株BmNPV毒株間的bro-c基因遺傳進(jìn)化差異較bro-a基因明顯。

3 討論

家蠶血液型膿病是蠶業(yè)生產(chǎn)中危害最嚴(yán)重的一種蠶病。本研究通過(guò)綜合分析BmNPV、家蠶品種和環(huán)境條件三者相互作用影響家蠶血液型膿病發(fā)生及流行的規(guī)律，經(jīng)測(cè)定廣西不同蠶區(qū)和季節(jié)BmNPV對(duì)家蠶的感染力，發(fā)現(xiàn)不同蠶區(qū)的BmNPV感染力雖存在一定差異，但未達(dá)顯著水平;在廣西蠶區(qū)不同季節(jié)（春、夏、秋）采集的BmNPV在相同環(huán)境條件下其感染力雖有一定差異，但差異也不顯著。這可能與廣西不同蠶區(qū)、不同季節(jié)BmNPV毒株的bro-a基因序列在系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)上聚在同一個(gè)分支上，其遺傳進(jìn)化較保守及毒株間的親緣關(guān)系很近有關(guān)，與孫京臣等（2001）、白興榮等（2010）、黃深惠等（2012）的研究結(jié)果存在一定差異，但具體原因有待進(jìn)一步探究。

蠶業(yè)生產(chǎn)中，溫濕度條件對(duì)家蠶生長(zhǎng)及病原微生物繁殖有明顯影響。本研究測(cè)定不同季節(jié)（春、夏、秋）條件下BmNPV對(duì)家蠶的感染力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同蠶區(qū)BmNPV毒株對(duì)家蠶的LC50排序均表現(xiàn)為春季>秋季>夏季，其中，Lb-BmNPV毒株在春季的LC50顯著高于其在夏季和秋季的LC50，Hc-BmNPV毒株在春季的LC50顯著高于其在夏季的LC50。說(shuō)明不同季節(jié)條件下，BmNPV的感染力存在明顯差異，即溫濕度條件是廣西蠶區(qū)家蠶血液型膿病發(fā)生的重要因子，且越是高溫多濕條件其發(fā)病概率越高，與廣西蠶區(qū)在高溫多濕的5—8月家蠶血液型膿病發(fā)病率較高相吻合。因此，在高溫多濕季節(jié)加強(qiáng)消毒和通風(fēng)排濕措施，有利于控制家蠶血液型膿病發(fā)生。

不同蠶品種由于基因上的差異，對(duì)BmNPV的感染抵抗力也存在明顯差異。本研究通過(guò)測(cè)定廣西蠶區(qū)現(xiàn)行主推3個(gè)家蠶品種（兩廣二號(hào)、桂蠶2號(hào)和桂蠶N2）對(duì)BmNPV的感染抵抗力，發(fā)現(xiàn)在夏季和秋季的條件下，不同蠶品種對(duì)BmNPV的感染抵抗力排序?yàn)楣鹦QN2>兩廣二號(hào)>桂蠶2號(hào)，桂蠶N2對(duì)BmNPV的感染抵抗力顯著高于兩廣二號(hào)和桂蠶2號(hào)，而兩廣二號(hào)與桂蠶2號(hào)間的差異不顯著;在春季的條件下3個(gè)家蠶品種對(duì)BmNPV的感染抵抗力差異不顯著。說(shuō)明在高溫多濕季節(jié)不同家蠶品種對(duì)BmNPV的感染抵抗力存在顯著差異，即家蠶血液型膿病的發(fā)生流行與蠶品種抗性也有密切關(guān)系，與陸瑞好等（2007）、石美寧等（2012）、劉昌文等（2016）的研究結(jié)果基本一致。因此，在高溫多濕季節(jié)及家蠶血液型膿病高發(fā)地區(qū)應(yīng)選用高抗BmNPV家蠶品種，可有效降低家蠶血液型膿病發(fā)生。

唐芬芬等（2014）研究報(bào)道，BmNPV的bro家族基因是一種相對(duì)保守的基因簇，適合作為BmNPV株系的分子鑒定依據(jù)。本研究基于bro-a和bro-c基因序列對(duì)不同蠶區(qū)和季節(jié)的BmNPV毒株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)不同BmNPV毒株在基于bro-a和bro-c基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)上均聚在同一分支上，且不同BmNPV毒株間的bro-a基因序列相似性很高、遺傳距離較小，說(shuō)明廣西蠶區(qū)不同BmNPV毒株的血緣關(guān)系密切;但不同BmNPV毒株間的bro-c基因序列相似度相對(duì)低、遺傳距離相對(duì)較大，廣西蠶區(qū)不同BmNPV毒株的感染力存在差異性，可能與bro-c基因的功能和遺傳相關(guān)。

4 結(jié)論

廣西不同蠶區(qū)和季節(jié)的BmNPV親緣關(guān)系密切，對(duì)家蠶的感染力無(wú)顯著差異，但在不同季節(jié)條件下存在顯著差異，說(shuō)明溫濕度條件是廣西蠶區(qū)家蠶血液型膿病發(fā)生的重要因子。在高溫多濕季節(jié)，不同家蠶品種對(duì)BmNPV的感染抵抗力存在顯著差異，即家蠶血液型膿病的發(fā)生流行與蠶品種抗性也有密切關(guān)系。因此，蠶業(yè)生產(chǎn)中為有效防控家蠶血液型膿病發(fā)生，在高溫多濕季節(jié)應(yīng)重點(diǎn)采取以下措施：一是加強(qiáng)蠶室、蠶具及周邊環(huán)境的消毒，把BmNPV分布降低至最低限度;二是推廣應(yīng)用高抗BmNPV蠶品種，如桂蠶N2等以降低家蠶血液型膿病發(fā)生;三是蠶室配備溫濕度控制設(shè)備以加強(qiáng)通風(fēng)排濕，促進(jìn)家蠶生長(zhǎng)發(fā)育以提高其免疫力和抵抗力。

參考文獻(xiàn)：

白興榮，冉瑞法，董占鵬，董家紅，黃平. 2010. 云南不同地區(qū)BmNPV對(duì)家蠶致病力的研究[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，23（6）：2019-2101. [Bai X R，Ran R F，Dong Z P，Dong J H，Huang P. 2010. Study on virulence of BmNPV to Bombyx mori in different areas of Yunnan[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences，23（6）：2019-2101.]

閉立輝. 2005. 廣西當(dāng)前主要蠶病與防治[J]. 廣西蠶業(yè)，42（4）：10-14. [Bi L H. 2005. Sillkworm diseases and control in Guangxi[J]. Guangxi Sericulture，42（4）：10-14.]

董戰(zhàn)旗，潘敏慧. 2017. 對(duì)家蠶抗核型多角體病毒的研究策略及研究進(jìn)展[J]. 蠶業(yè)科學(xué)，43（1）：139-146. [Dong Z Q，Pan M H. 2017. Research strategy and progress on resistance of Bombyx mori to nucleopolyhedrovirus[J]. Science of Sericulture，43（1）：139-146.]

黃深惠，石美寧，唐亮，黃旭華. 2012. 廣西不同蠶區(qū)家蠶核型多角體病毒對(duì)家蠶致病力的研究[J]. 廣西蠶業(yè)，49（2）：17-19. [Huang S H，Shi M N，Tang L，Huang X H. 2012. Study on virulence of Bombyx mori nuclearpolyhedrovirus to silkworm in different areas of Guangxi[J]. Guangxi Sericulture，49（2）：17-19.]

劉昌文，艾均文，薛宏，何行健，鄭穎，劉勇. 2016. 湖南省主要家蠶品種資源及現(xiàn)行一代雜交種對(duì)血液型膿病的抗性[J]. 中國(guó)蠶業(yè)，37（3）：12-16. [Liu C W，Ai J W，Xue H，He X J，Zheng Y，Liu Y. 2016. Resistance of main kinds of silkworm and the first generation hybrids to BmNPV in Hunan[J]. China Sericulture，37（3）：12-16.]

陸瑞好，石美寧，閉立輝，顧家棟，黃君霆. 2007. 廣西地區(qū)家蠶品種資源對(duì)BmNPV抵抗性的初步調(diào)查[J]. 蠶業(yè)科學(xué)，33（1）：117-120. [Lu R H，Shi M N，Bi L H，Gu J D，Huang J T. 2007. A preliminary investigation on the resistance of the silkworm variety resources in Guangxi to BmNPV[J]. Science of Sericulture，33（1）：117-120.]

龐敏. 2007. 家蠶核型多角體病毒廣東分離株空斑克隆株系的建立及其bro基因家族的分析[D]. 重慶：西南大學(xué). [Pang M. 2007. Establishment of Bombyx mori nucleopolyhedrovirus of plaque-purified GD strain and analysis of its bro genes[D]. Chongqing：Southeast Agriculture University.]

邵榆嵐，唐芬芬，張一川，張永紅，朱峰，白興榮. 2017. 云南蠶區(qū)家蠶品種資源對(duì)家蠶核型多角體病毒的抗性評(píng)價(jià)分析[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，48（3）：517-523. [Shao Y L，Tang F F，Zhang Y C，Zhang Y H，Zhu F，Bai X R. 2017. Resistance of silkworm variety resources from Yunnan sericultural areas to Bombyx mori nucleopolyhedrovirus（BmNPV）[J]. Journal of Southern Agriculture，48（3）：517-523.]

石美寧，閉立輝，顧家棟，費(fèi)美華，祁廣軍，韋博尤，黃君霆，黃玲莉，蘇紅梅，蒙藝英，張桂征，張雨麗，黃旭華，黃文功. 2012. 家蠶抗血液型膿病新品種桂蠶N2的選育[J]. 廣西蠶業(yè)，49（4）：1-12. [Shi M N，Bi L H，Gu J D，F(xiàn)ei M H，Qi G J，Wei B Y，Huang J T，Huang L L，Su H M，Meng Y Y，Zhang G Z，Zhang Y L，Huang X H，Huang W G. 2012. Breeding of new highly resistant nuclear polyhedrosis disease silkworm variety Guican N2[J]. Guangxi Sericulture，49（4）：1-12.]

孫京臣，金豐良，徐興耀，譚佩嬋. 2001. 不同地區(qū)BmNPV對(duì)家蠶致死中量的比較研究[J]. 廣東蠶業(yè)，35（4）：35-37. [Sun J C，Jing F L，Xu X Y，Tan P C. 2001. Comparative study of BmNPV LC50 in different regions[J]. Guangdong Sericulture，35（4）：35-37.]

唐芬芬，邵榆嵐，鐘健，張永紅，黃平，董占鵬，廖鵬飛，白興榮. 2014. 家蠶核型多角體病毒株系的分子鑒定初探[J]. 蠶業(yè)科學(xué)，40（6）：1030-1035. [Tang F F，Shao Y L，Zhong J，Zhang Y H，Huang P，Dong Z P，Liao P F，Bai X R. 2014. A preliminary study on molecular identification of Bombyx mori nucleopolyhedrovirus strains[J]. Science of Sericulture，40（6）：1030-1035.]

唐芬芬，楊偉克，朱峰，邵榆嵐，張永紅，白興榮. 2019. BmNPV對(duì)家蠶抗氧化酶基因表達(dá)及其酶活性的影響[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，50（10）：2308-2313. [Tang F F，Yang W K，Zhu F，Shao Y L，Zhang Y H，Bai X R. 2019. Effects of BmNPV on the antioxidant enzyme gene expression and enzyme activity of Bombyx mori[J]. Journal of Southern Agriculture，50（10）：2308-2315.]

王霞. 2005. 家蠶核型多角體病毒（BmNPV）bro基因的遺傳多樣性和進(jìn)化分析[D]. 重慶：西南大學(xué). [Wang X. 2005. Genetic diversity and evolution about bro genes in Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus[D]. Chongqing：Sou-theast Agriculture University.]

吳小峰. 2006. 家蠶核型多角體病毒的基因組結(jié)構(gòu)及其表達(dá)模式[J]. 病毒學(xué)報(bào)，22（4）：324-328. [Wu X F. 2006. Genome structure and expression pattern of Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus[J]. Chinese Journal of Virology，22（4）：324-328.]

張媛媛，魏銘，李俊，張婷，全滟平，舒特俊，于威. 2016. 家蠶桿狀病毒bro-d基因缺失對(duì)病毒基因轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞凋亡的影響[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，24（7）：1073-1082. [Zhang Y Y，Wei M，Li J，Zhang T，Quan Y P，Shu T J，Yu W. 2016. Effect of bro-d deletion on the viral transcription and cell apoptosis in silkworm（Bombyx mori）[J]. Journal of Agricultural Biotechnology，24（7）：1073-1082.]

周敬波. 2012. 家蠶核型多角體病毒泰國(guó)株的鑒定及其bro基因家族分析[D]. 合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué). [Zhou J B. 2012. Indentification of a new Bombyx mori nucleopolyhedrovirus and analysis of its bro gene family[D]. Hefei：Anhui Agricultural University.]

Fujimoto S，Kawamoto M，Shoji K，Suzuki Y，Katsuma S，Iwanaga M. 2020. Whole-genome sequencing and comparative transcriptome analysis of Bombyx mori nucleopolyhedrovirus La strain[J]. Virus Genes，56（2）：249-259.

Gomi S，Majima K，Maeda S. 1999. Sequence analysis of the genome of Bombyx mori nucleopolyhedrovirus[J]. The Journal of General Virology，80（5）：1323-1337.

Maeda S，Majima K. 1990. Molecular cloning and physical mapping of the genome of Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus[J]. The Journal of General Virology，71（8）：1851-1855.

Xu Y P，Cheng R L，Xi Y，Zhang C X.2013. Genomic diversity of Bombyx mori nucleopolyhedrovirus strains[J].Genomics，102（1）：63-71.

（責(zé)任編輯 蘭宗寶）