不同種屬酵母菌共培發(fā)酵桑葚酒的工藝優(yōu)化

葉片，劉建，黃均，嚴樂晉，周榮清，2*

1(四川大學 輕工科學與工程學院，四川 成都，610065)2(制革清潔技術國家工程實驗室，四川 成都，610065)

桑葚是桑科植物桑樹的果實，富含多糖和白藜蘆醇等功能組分，有增強人體免疫力、降血脂血糖和防癌抗變等作用[1]。桑葚采摘期僅在每年的4～6月，且不耐壓、易腐爛，不宜在室溫下儲存和運輸。除以鮮食外，深加工主要是生產(chǎn)濃縮糖漿、果醬、醋和果酒等[2]，其中生產(chǎn)桑葚酒是提高附加值的重要途徑之一[3]。目前桑葚酒技術開發(fā)關注的是原料加工性能、菌株篩選和特征及功能組分的剖析等[4-6]。

酵母菌的性質對果酒風味特征影響顯著，基于釀酒酵母菌和非釀酒酵母菌的共培發(fā)酵技術不僅可改善果酒的風味特征，還使之高度發(fā)酵，是生產(chǎn)高品質果酒常用的技術之一[7-8]。Torulasporadelbrueckii具有產(chǎn)異戊醇、苯乙醇、乙酯類和萜烯等物質并賦予其風味特色組分的能力[9-10]，可采用其與Saccharomyces酵母菌共培養(yǎng)發(fā)酵方式改善果酒的品質。

本文報道了不同類型桑葚原料、預處理方式對桑葚酒品質及風格影響的研究結果。同時探討了酵母屬的S.cerevisiae和S.bayanus分別與T.delbrueckii共培及不同溫度發(fā)酵對桑葚酒風味特征的影響，旨在開發(fā)生產(chǎn)高質量桑葚酒的生產(chǎn)技術。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

新鮮桑葚果，購于本地農貿市場；冷凍桑葚，成都世煌生物科技有限責任公司饋贈。白砂糖(一級)，購于本地副食品商店。

S.cerevisiaeY1(CCTCC M 2019521)、S.bayanusY4(CCTCC M 2019522)、T.delbrueckiiY7 (CCTCC M 2019523)，本實驗室從果酒廠的發(fā)酵醪中分離，經(jīng)菌落及菌體細胞形態(tài)觀察、生理生化試驗結果[11]初步鑒定和ITS測序確認，送中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏。

1.1.2 試劑

標品草酸、檸檬酸、酒石酸、L-蘋果酸、乳酸、乙酸和丙酸，Sigma(CP，上海，中國)；Lallzyme EX-V復配果膠酶制劑P1，康禧食品飲業(yè)有限公司(上海，中國)。

1.1.3 儀器與設備

Trace GC Ultra-DSQⅡ氣相色譜質譜聯(lián)用儀，Thermo Fisher Electron；HP-INNOWAX毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)、1260高效液相色譜儀，美國Aglient；Alltech OA-1000有機酸色譜柱(300 mm×6.5 mm)，美國GRACE；SPE小柱，成都SWELL；CAR/PDMS/DVB萃取頭(50/30 μm)，美國Supelco。

1.2 試驗方法

桑葚破碎后，先加入NaHSO3(120 mg/L)，隨即加入果膠酶(70 mg/L)，室溫靜置10 h。然后添加(NH4)2HPO3(150 mg/L)，加蔗糖調整至23.5 Brix。

原料的影響：S.bayanusY4的菌懸液接種到預處理后的原料中，使其菌體初始濃度為5×106CFU/mL，17 ℃下發(fā)酵12 d，取發(fā)酵清液分析。這些原料包括鮮全果(FG)、冷凍全果(RG1，貯存1年)、冷凍全果汁(RZ)和冷凍全果(RG2，貯存2個月)等4種不同類型。

不同種屬酵母共培養(yǎng)的影響：預處理的鮮桑葚全果汁分為6份，其中4份的操作步驟為分別接種S.cerevisiae和T.delbrueckii菌懸液(1∶1，5×106CFU/mL，Y1&Y7)；S.bayanus和T.delbrueckii菌懸液(1∶1，5×106CFU/mL，Y4&Y7)，接種S.cerevisiae(Y1)和S.bayanus(Y4)為對照，菌體初始濃度和過程參數(shù)同前。置于(25±2) ℃條件下，發(fā)酵6 d時，補糖4%調整糖度，繼續(xù)發(fā)酵4 d，過濾得原酒液。

溫度的影響：剩余2份操作步驟分別與Y1&Y7和Y4&Y7相同，僅發(fā)酵的溫度控制在(20±2)℃以探討溫度影響。樣品簡稱為LY1&Y7和LY4&Y7。

1.3 分析檢測方法

1.3.1 理化指標的測定

原料及原酒的主要理化指標按照GB/T15038—2006所述的方法檢測。

1.3.2 有機酸的測定

按照參考文獻[12]所述方法，應用HPLC檢測。主要操作步驟為3 mL離心上清液加載到活化的SPE小柱，洗脫液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，高效液相色譜法檢測，檢測波長為210 nm。以檸檬酸，酒石酸，L-蘋果酸，琥珀酸，乳酸和乙酸標準品的保留時間鑒定樣品中有機酸，并采用外標法定量。

1.3.3 揮發(fā)性組分的測定及分析

按照參考文獻[13]所述應用頂空固相微萃取-氣相質譜方法檢測。主要操作步驟為精確取0.5 mL樣品置于頂空瓶中，用NaCl飽和，加入混合內標2-辛醇(69 mg/L，GC級)和辛酸甲酯(71 mg/L，GC級) 10 μL，60 ℃平衡15 min，插入萃取頭，萃取40 min， 然后GC進樣口中解吸析3 min。通過待測樣品組分質譜數(shù)據(jù)與標準譜庫(NIST2005)比對，匹配度>800(最大為1 000)的物質予以報道，采用內標法進行半定量計算。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個樣品3次平行樣品檢測結果，采用SPSS 19.0軟件對測得各項指標分析其單因素方差(Dancan’s test，P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 原料類型及預處理方式對理化性質的影響

如表1所示，冷凍桑葚因其內源酶或原料表面棲息的微生物的作用使有機酸、總酸及揮發(fā)酸較其余類型的原料高，且酸類的含量也與貯存周期有關，如RZ的總酸和揮發(fā)酸含量高于RG2的。各樣品間的殘?zhí)呛鸵掖紳舛葻o顯著區(qū)別。

如表2所示,琥珀酸、蘋果酸和草酸等是原料中優(yōu)勢有機酸[14]。冷凍貯存過程中因物理除酸作用，尤其是酒酒球菌的作用[15-16]誘導了蘋果酸—乳酸發(fā)酵。檸檬酸和酒石酸的含量降低了，從而導致酒體失去溫和爽快和后苦時間短的新鮮口感[17]。蘋果酸部分被轉換為琥珀酸使RG2中琥珀酸含量顯著高于其他樣品，賦予了原酒鮮味和酸味[18]，而蘋果酸含量降低則減弱了果酒的酸澀及粗糙感。此外乳酸含量適量提高使之有更柔和的口感[5]，但乳酸及乙酸含量偏高，不僅酸度高，還致使果酒出現(xiàn)酸刺激味等諸多欠愉悅的缺陷，冷凍或濃縮的桑葚不適合做釀酒原料。

表1 不同原料及預處理對桑葚酒主要理化性質的影響Table 1 Effect of different raw material and pretreatment pattern on major physicochemical properties

注：表中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

表2 不同原料及預處理對桑葚酒有機酸含量的影響 單位：g/LTable 2 Effect of different materials and pretreatment pattern on organic acid contents

2.2 不同類型酵母共培的桑葚果酒生產(chǎn)工藝

2.2.1 共培發(fā)酵溫度對理化指標的影響

S.cerevisiae常用于新世紀葡萄酒的釀造[19]。在其過程中接種S.bayanus，可提高其甘油、乳酸和琥珀酸含量，使乙酸和乙醇的含量略低[20]。如表3所示，二者用于鮮全桑葚汁釀酒時，乙醇、殘?zhí)羌翱偹岷坎]有顯著差異，僅降低發(fā)酵溫度時，殘?zhí)呛柯愿叨掖紳舛嚷缘汀?/p>

2.2.2 共培養(yǎng)發(fā)酵對揮發(fā)組分的影響

同系Saccharomyces的S.cerevisiae和S.bayanus所釀桑葚原酒的主要理化指標相同，但揮發(fā)性組分含量差異顯著。這2株酵母菌分別與T.delbrueckii共培時，對揮發(fā)性組分的貢獻因種屬不同而異。S.cerevisiae與T.delbrueckii共培，揮發(fā)性組分總量略增，其中酚和酮類的含量顯著提高，但酯和酸類含量降低，比例或增或減。S.bayanus與T.delbrueckii共培，其總量及各組分比例均略增高。

表3 酵母菌間共培及溫度對主要理化指標的影響Table 3 Effect of co-culture by different yeast strain and fermentation temperature on major physicochemical properties of mulberry wine

如圖1所示，6種酒樣中共檢出了73種揮發(fā)性組分，包括酯(32)、醇(10)、酸(4)、醛(6)、酮(1)、酚(6)、萜烯類(7)和其他(7)等不同類型。Y4樣品55種，Y1樣品54種，分別與T.delbrueckii共培，使組分數(shù)量增多。Y1&Y7和 Y4&Y7分別檢出了64種和59種，降低發(fā)酵溫度，前者減少了1種，而后者增加了6種。樣品間含量差異顯著的是酯、酚和醇3類組分，這些組分占總揮發(fā)組分總含量的92.95%～95.73%。

圖1 不同酵母菌共培及發(fā)酵溫度的桑葚酒揮發(fā)組分輪廓的差異Fig.1 Difference of volatiles profile among mulberry wine brewed by different co-cultured yeast and fermentation temperature

此外，這2株酵母菌分別與T.delbrueckii共培，也使桑葚酒的多種組分含量差異顯著。T.delbrueckii的貢獻主要是提高脂肪酸乙酯的含量，如辛酸乙酯和十二烷酸乙酯[21-22]。共培養(yǎng)增加了乳酸、辛酸、己酸和苯甲酸的乙酯類衍生物、十二烷酸甲酯和丁二酸二乙酯6種組分的含量，使己酸丁酯等4種組分的含量略降，且新檢出了肉桂酸乙酯和十四酸乙酯(圖2-a)。S.bayanus和S.cerevisiae因代謝途徑及生理生化性質不同，與T.delbrueckii組合共培使己酸乙酯等8種酯類組分含量的增減幅度不同(圖2-b)。S.bayanus與T.delbrueckii共培，酯類組分略增，而S.cerevisiae與T.delbrueckii共培，酯類組分略降，新檢出了苯甲酸乙酯、磷酸三丁酯和丙位癸內酯3種組分。共培發(fā)酵使異戊醇、1-己醇、異丁醇和十一醇4種醇類組分的含量增高，苯甲醇和辛醇含量降低(圖2-d)，可能與T.delbrueckii中β-葡萄糖苷酶的活性有關[23]。1-癸醇、3-甲硫基丙醇和正庚醇等3種組分僅在S.cerevisiae和T.delbrueckii共培養(yǎng)時才被檢出。T.delbrueckii合成芳樟醇和α-萜品醇的能力較強，橙花醇是芳樟醇的重要前體物之一[10]，所以前者的含量減少，而后者略增。此外，萜類及除癸酸外的酸類組分含量略增(圖2-e)。

溫度影響T.delbrueckii的代謝速率，低溫降低了其合成苯乙醇的能力，使醇類組分的含量減少[24]。己酸、辛酸、十二烷酸、苯乙酸和肉桂酸的乙酯衍生物和4-羥基丁酸乙酰酯的含量減少，而甲酸辛酯、丁二酸二乙酯和戊二酸二乙酯的含量較高(圖2-c)。T.delbrueckii與S.bayanus共培使苯甲酸、苯乙酸、苯丙酸、軟脂酸的乙酯衍生物的含量增高，與S.cerevisiae共培則使這些組分的含量減少。

a-共培前后變化趨勢相似的酯類物質的差異；b-共培前后變化相反的酯類物質的差異；c-不同溫度共培酯類和醇類物質的差異；d-共培前后醇類物質的差異；e-共培前后萜類和酸類物質的差異圖2 不同酵母菌共培及發(fā)酵溫度的桑葚酒主要揮發(fā)組分之間的差異Fig.2 Difference of major volatile among mulberries wine brewed by different co-cultured yeast and fermentation temperature注：a:1-乳酸乙酯；2-己酸丁酯；3-辛酸乙酯；4-甲酸辛酯；5-十二烷酸甲酯；6-苯甲酸乙酯；7-丁二酸二乙酯；8-乙酸苯乙酯；9十四酸乙酯；10-磷酸二乙基壬酯；11-磷酸三丁酯；12-肉桂酸乙酯；13-丙位癸內酯；b:1-己酸乙酯；2-苯甲酰甲酸酯；3-4-羥基丁酸乙酰酯；4-十二烷酸乙酯；5-苯乙酸乙酯；6-苯丙酸乙酯；7-軟脂酸乙酯；8-十八烷酸乙酯；c:1-己酸乙酯；2-辛酸乙酯；3-甲酸辛酯；4-4-羥基丁酸乙酰酯；5-十二烷酸乙酯；6-丁二酸二乙酯；7-戊二酸二乙酯；8-苯乙酸乙酯；9-肉桂酸乙酯；10-苯甲酸乙酯；11-苯丙酸乙酯；12-苯乙醇；13-丙位葵內酯；d:1-異丁醇；2-異戊醇；3-1-己醇；4-正庚醇；5-1-辛醇；6-十一醇；7-3-甲硫基丙醇；8-1-癸醇；9-苯甲醇；e:1-芳樟醇；2-(-)-4-萜品醇；3-松油醇；4-香茅醇；5-(+)-3-蒈烯，10-(乙?；谆?；6-反式-橙花叔醇；7-2-甲基乙酸；8-己酸；9-辛酸；10-癸酸

對桑葚酒風味貢獻度大的7種揮發(fā)組分(OAVs>1)的輪廓圖如圖3所示。癸醛氣味活度值(odor activity value，OAV)值最高，S.bayanus與T.delbrueckii共培養(yǎng)使之顯著降低，顯著減弱了酒樣中青草味、桔皮味和不愉快的脂肪味。S.cerevisiae與T.delbrueckii共培養(yǎng)使己酸乙酯、苯丙酸乙酯和苯乙醇升高，多種愉悅的芳香的強度增大。(20±2) ℃發(fā)酵時，LY4&Y7中己酸乙酯、苯丙酸乙酯和苯乙醇的OAV降低，癸醛、癸酸和苯乙醛的OAV上升，且未檢出肉桂酸乙酯。除苯丙酸乙酯的OAV顯著上升和癸醛、苯乙醛的OAV略微下降外，LY1&Y7中呈現(xiàn)了類似的結果。S.bayanusy和S.cerevisiae分別與T.delbrueckii共培，降低溫度共培發(fā)酵，對果香、花香等果酒的特色芳香呈負貢獻，使樣品中不愉悅的脂肪味和腐敗味及青草氣味增濃。

圖3 不同溫度及酵母菌共培樣品的OAVs輪廓Fig.3 OAVs profiles of mulberry wine samples with different co-cultured yeast and co-cultured temperature注：揮發(fā)性物質感覺閾值參考文獻[25-27]

2.2.3 共培發(fā)酵對有機酸的影響

T.delbrueckii是與S.cerevisiae共培改善葡萄酒感官特征的非釀酒酵母之一，能有效提高葡萄酒的感官特征，發(fā)酵高糖度葡萄汁，降低乙酸及揮發(fā)性酸含量[28]。如圖4所示，Y1和Y1&Y7聚為一簇，而Y4和Y4&Y7聚為一簇，Saccharomyces酵母菌影響桑葚酒的有機酸含量，且S.cerevisia的原酒8種有機酸的含量較S.bayanus的略低。S.cerevisiae和S.bayanus分別與T.delbrueckii共培，乙酸含量略降。S.bayanus與T.delbrueckii共培，檸檬酸含量略降；S.cerevisiae與T.delbrueckii共培，琥珀酸含量略低，其他有機酸無顯著差異。

圖4 基于8種主要的有機酸不同酵母共培桑葚酒樣品的熱圖分析Fig.4 Heatmap analysis based on the 8 major organic acids of mulberry wine samples with different co-cultured yeast

3 結論

桑葚原料的類型、預處理方式、不同種屬的酵母菌共培養(yǎng)發(fā)酵及溫度顯著影響桑葚酒的品質，尤其是有機酸和關鍵揮發(fā)組分。冷凍后的桑葚用于釀酒，揮發(fā)酸和乳酸含量增高，不適合釀酒。鮮果破碎直接釀酒，揮發(fā)酸含量低，酸澀及粗糙感減弱。S.cerevisiae和S.bayanus分別與T.delbrueckii共培養(yǎng)，改變了檢出的8種有機酸的比例，乙酸含量減少，也使檢出的揮發(fā)組分數(shù)量增多，含量和比例與相應單一種屬菌株不同，致使果酒的果香、花香等特色芳香及特征風味增強。發(fā)酵溫度降至(20±2) ℃則使不愉悅氣味強度增大。