基于超快速液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)藥食兩用 薄荷中氨基酸和核苷類成分

孫慧娟，王瑞，宋芊芊，周慧銀，方成武，2*

1(安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，安徽 合肥,230012)2(安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院亳州中醫(yī)藥研究所，安徽 亳州,236800)

薄荷是唇形科薄荷屬多年生草本植物，藥食兩用植物。具有利咽、透疹等功效，用于咽喉腫痛及小兒麻疹等癥[1-3]?，F(xiàn)代藥理研究表明，薄荷能夠抗腫瘤、抗菌、消炎、有效緩解鎮(zhèn)痛[4-7]。薄荷的藥用價(jià)值很高，其營(yíng)養(yǎng)成分也十分豐富，富含氨基酸、有機(jī)元素、維生素等多種營(yíng)養(yǎng)成分，具有重要的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健價(jià)值[8-10]。

目前，對(duì)于薄荷研究多以揮發(fā)油類成分為主[11-13]，而作為一種藥食兩用的植物，薄荷作為常見(jiàn)的茶飲，其實(shí)際運(yùn)用中不僅僅局限于揮發(fā)油, 其氨基酸和核苷類成分同樣重要。而對(duì)薄荷中氨基酸、核苷類成分的研究較少，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值尚未得到充分認(rèn)識(shí)。氨基酸主要以游離及水解的形式存在于植物體內(nèi)，氨基酸檢測(cè)方法主要包括高效液相色譜法[14]、毛細(xì)管電泳法[15]、離子交換色譜法等[16]。本試驗(yàn)通過(guò)超快速液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(ultra-fast liquid chromatography-mass spectrometry,UFLC-MS/MS)，建立同時(shí)測(cè)定薄荷中21種氨基酸和10種核苷類成分含量方法，對(duì)3個(gè)不同產(chǎn)地的薄荷中氨基酸和核苷類成分差異進(jìn)行分析比較，并應(yīng)用PCA[17]和TOPSIS[18]方法對(duì)樣品進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，為藥食兩用薄荷的質(zhì)量評(píng)價(jià)和綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

Trip Quad 4500串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀，美國(guó) ABSciex公司；ExionLC AD 超快速液相色譜儀，日本Shimadzu公司；KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲清洗器(100 kHz)，昆山市超聲儀器有限公司；離心機(jī)(HC-3018)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；SArtorius BT125D十萬(wàn)分之一電子天平,德國(guó)賽多利斯公司；ME36S 型百萬(wàn)分之一電子天平,德國(guó)賽多利斯公司；LGJ-10真空冷凍干燥機(jī),北京松源華興科技發(fā)展有限公司；Milli-Q超純水系統(tǒng),Millipore公司；0.22 μm 微孔濾膜,津騰，中國(guó)天津。

1.2 材料與試劑

異亮氨酸(Ile)、組氨酸(His)、苯丙氨酸(Phe)、亮氨酸(Leu)、谷氨酸(Glu)、絡(luò)氨酸(Tyr)、丙氨酸(Ala)、胱氨酸(Cys)、蘇氨酸(Thr)、甲硫氨酸(Met)、脯氨酸(Pro)11種氨基酸，均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為140624-200805。天冬氨酸(Asp，批號(hào)B21934)、天冬酰胺(Asn，批號(hào)B21935)、絲氨酸(Ser，批號(hào)140688)、甘氨酸(Gly，批號(hào)B21915)、纈氨酸(Val，批號(hào)140681)、精氨酸(Arg，批號(hào)B21920)、羥基脯氨酸(Hpro，批號(hào)B21928)、色氨酸(Tryptophan，批號(hào)140677)、鹽酸賴氨酸(Lysine，批號(hào)140693)、γ-氨基丁酸(GABA，批號(hào)B21979)、尿嘧啶(Uracil，批號(hào)B20908)、腺嘌呤(Adenine，批號(hào)B21357)、胞苷(Cytidine，批號(hào)B20073)、肌苷(Inosine，批號(hào)B20582)、胸苷(Thymidine，批號(hào)B21915)、鳥(niǎo)苷(Guanine，批號(hào)B20905)、腺苷(Adenosine，批號(hào)B21356)、尿苷(Uridine，批號(hào)B20907)、次黃嘌呤(Hypoxanthine，批號(hào)B20211)、鳥(niǎo)嘌呤(Guanine，批號(hào)B20906)，均購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%。水為超純水；乙腈、甲酸為質(zhì)譜純，德國(guó)Merck公司；其余試劑為分析純。

試驗(yàn)所研究的樣品，采集于3個(gè)不同產(chǎn)地的薄荷植物新鮮葉片，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)方成武教授鑒定為唇形科植物薄荷MenthahaplocalyxBriq.的干燥地上部分。樣品信息如表1所示。

表1 薄荷主輔料樣品來(lái)源及基本信息Table 1 Source and basic information of main products of mint steamed vegetables

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

Waters XBridge Amide專用柱(100 mm×2.1 mm,3.5 μm)；流動(dòng)相∶水(含0.2%甲酸)(A)-乙腈(含0.2%甲酸)(B)，梯度洗脫(0～2.5 min，15% A；2.5～5 min，15%～50% A；5～7 min，50% A；7～8 min，50%～15% A；8～11 min，15% A)；柱溫 30 ℃，流速0.2 mL/min，進(jìn)樣量1 μL。其正離子多反映監(jiān)測(cè)色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 21種氨基酸和10種核苷的MRM圖Fig.1 UFLC-MS/MS multiple-reaction monitoring(MRM) chromatograms of 21 amino acids and 10 nucleosides

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子化模式ESI+下，采取多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)檢測(cè)；噴霧電壓5.5 kV；離子化溫度550 ℃；氣簾氣為241.3 kPa(35 psi)，Gas1為379.2 kPa(55 psi)，Gas2 為379.2 kPa(55 psi)；同時(shí)對(duì)碰撞電壓、去簇電壓和檢測(cè)離子對(duì)進(jìn)行優(yōu)化。31種目標(biāo)成分的優(yōu)化質(zhì)譜檢測(cè)條件參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 31種目標(biāo)成分的優(yōu)化質(zhì)譜檢測(cè)條件參數(shù)Table 2 Optimized MS/MS spectrometry detection condition parameters of 31 target components

1.3.3 溶液制備

1.3.3.1 對(duì)照品溶液制備

精密稱取天冬氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、精氨酸、組氨酸、胱氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、羥脯氨酸、脯氨酸、色氨酸、γ-氨基丁酸、鹽酸賴氨酸、尿嘧啶、腺嘌呤、胞苷、肌苷、鳥(niǎo)苷、胸苷、腺苷、尿苷、鳥(niǎo)嘌呤、次黃嘌呤對(duì)照品適量，分別置25 mL容量瓶中，加超純水配制成0.16、0.18、0.12、0.12、0.14、0.13、0.11、0.14、0.18、0.12、0.13、0.13、0.13、0.12、0.11、0.15、0.13、0.11、0.17、0.17、0.15、0.17、0.13、0.11、0.15、0.12、0.15、0.16、0.11、0.13、0.13 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。取各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加水配制成混合對(duì)照品溶液，逐級(jí)稀釋，得到一系列不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.2 供試品溶液的配制

稱取鮮品薄荷葉500 g，用水清洗干凈，均勻鋪散在托盤(pán)上，覆蓋上已扎孔的薄膜，置于-20℃冰箱預(yù)凍，隨后將其置于真空冷凍干燥機(jī)[19-21]，直至水分含量達(dá)到8%以下，即干燥完成。取薄荷粉末(過(guò)40目篩)1.000 g，置于100 mL容量瓶中，加入20 mL超純水，室溫超聲處理(100 kHz)提取30 min，吸取上清液于4 500 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，過(guò)0.22 μm 微孔濾膜，供分析。

1.3.4 線性關(guān)系考察、檢測(cè)限和定量限

精密吸取“1.3.3”項(xiàng)下不同濃度系列對(duì)照品溶液及混合對(duì)照品儲(chǔ)備液各1 μL，按照“1.3.1”和“1.3.2”項(xiàng)下色譜-質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以對(duì)照品的峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)，對(duì)照品的質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，得出回歸方程、相關(guān)系數(shù)(r)、線性范圍。以信噪比(S/N)約為3 計(jì)算各成分的檢測(cè)限(LOD)，以信噪比(S/N)約為10，計(jì)算各成分的定量限(LOQ)，結(jié)果見(jiàn)表3。

1.3.5 方法學(xué)考察

1.3.5.1 精密度試驗(yàn)

精密吸取一定濃度的混合對(duì)照品溶液，按照“1.3.1”和“1.3.2”項(xiàng)下色譜-質(zhì)譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，得出21種氨基酸和10種核苷對(duì)照品峰面積的RSD在0.20%～3.36%。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表4。

1.3.5.2 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取S5—薄荷樣品6份，每份1.000 g，按照“1.3.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“1.3.1”和“1.3.2”項(xiàng)下色譜-質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算21種氨基酸和10種核苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD在0.21%～3.60%。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表4。

表3 21種氨基酸和10種核苷的線性關(guān)系考察Table 3 Investigation of liner relationship of 20 amino acids and 10 nucleosides

1.3.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取S5—薄荷樣品的供試品溶液，分別在 0、2、4、8、12、24 h時(shí)按照“1.3.1”和“1.3.2”項(xiàng)下色譜-質(zhì)譜條件下進(jìn)樣分析，測(cè)定21種氨基酸和10種核苷成分峰面積的RSD值，RSD在0.65%～3.84%。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表4。

1.3.5.4 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取S5—薄荷樣品6份，每份1.000 g，分別加入與1.000 g樣品中各待測(cè)成分含量相當(dāng)?shù)膶?duì)照品，按照“1.3.3.2”項(xiàng)下方法制備加樣回收供試品溶液，按照“1.3.1”和“1.3.2”項(xiàng)下色譜-質(zhì)譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見(jiàn)表4。31種成分的平均加樣回收率在94.18%～98.76%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.17%～3.56%。

表4 21種氨基酸和10種核苷方法學(xué)考察 單位：%Table 4 Methodological study of 21 amino acids and 10 nucleosides

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品測(cè)定結(jié)果

按照“1.3.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“1.3.1”和“1.3.2”項(xiàng)下色譜-質(zhì)譜條件進(jìn)樣得相應(yīng)的峰面積，根據(jù)對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出供試樣品中21種氨基酸和10種核苷類成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 薄荷中21種氨基酸和10種核苷的含量測(cè)定結(jié)果 單位：μg/gTable 5 Determination results of 21 amino acids and 10 nucleosides in peppermint

2.2 主成分(PCA)分析

由于薄荷樣品中各成分在量綱和數(shù)量級(jí)上存在較大差異，為更好地分析結(jié)果，將原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，對(duì)21種氨基酸和10種核苷含量分別應(yīng)用SPSS 23.0軟件進(jìn)行主成分(PCA)分析。以特征值大于1，累積貢獻(xiàn)率大于70%為提取標(biāo)準(zhǔn)。

提取了PCA初始因子載荷矩陣，因子載荷矩陣主要說(shuō)明主成分在各變量上的載荷，載荷越高，越相關(guān)。在氨基酸中，甘氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、胱氨酸、γ-氨基丁酸在PC1上有較高的載荷，說(shuō)明PC1能反映這5種氨基酸的信息；同理，PC2能反映脯氨酸、丙氨酸的信息。在核苷中，尿嘧啶、腺嘌呤、胞苷、尿苷、鳥(niǎo)嘌呤在PC1上有較高的載荷，說(shuō)明PC1能反映這5種核苷成分的信息；同理，PC2能反映胸苷的信息。綜上，不同產(chǎn)地薄荷的氨基酸類成分中，甘氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、胱氨酸、γ-氨基丁酸、脯氨酸、丙氨酸為主要成分；同理，在核苷類成分中，尿嘧啶、腺嘌呤、胞苷、尿苷、鳥(niǎo)嘌呤、胸苷為主要成分。

2.3 TOPSIS分析

分別以氨基酸和核苷類成分以及總成分含量為分析指標(biāo)，采樣TOPSIS分析方法對(duì)6份樣品進(jìn)行綜合分析，得出排序結(jié)果。

2.3.1 歸一化處理

將6份樣品中 21種氨基酸和 10種核苷成分的含量數(shù)據(jù)矩陣分別進(jìn)行歸一化處理，并建立相應(yīng)矩陣，計(jì)算α值，如公式(1)所示：

(1)

式中：αij表示第i個(gè)評(píng)價(jià)對(duì)象在第j個(gè)指標(biāo)上歸一化處理后的取值，Xij表示第i個(gè)評(píng)價(jià)對(duì)象在第j個(gè)指標(biāo)上的取值。

2.3.2 最優(yōu)與最劣方案

根據(jù)歸一化處理后的樣本情況，得到最優(yōu)(Z+)和最劣(Z-)值向量。

2.3.3 相對(duì)貼近度(Ci)的計(jì)算

相對(duì)貼近度根據(jù)公式(2)計(jì)算：

(2)

2.3.4 TOPSIS分析結(jié)果

按照Ci大小將各評(píng)價(jià)對(duì)象排序，Ci值越大，表示綜合品質(zhì)越好。6份樣品中 21種氨基酸和 10種核苷類成分 TOPSIS 分析結(jié)果見(jiàn)表6。

結(jié)果表明，以氨基酸為分析指標(biāo)，S4樣品最佳；以核苷為分析指標(biāo)，S2樣品最高；以總成分為分析指標(biāo)，S1樣品最高。

表6 6份樣品中21種氨基酸和10種核苷類成分TOPSIS分析結(jié)果Table 6 Results of TOPSIS analysis of 21 amino acids and 10 nucleosides in 11 samples

3 討論

各產(chǎn)地樣品在氨基酸和核苷酸樣品的組成和比例均存在一定差異。從總氨基酸含量來(lái)看，亳州產(chǎn)樣品總氨基酸含量高達(dá)48 337.11 μg/g，阜陽(yáng)次之，商丘最低。氨基酸成分以谷氨酸平均含量最高(22 710.19 μg/g)，天冬酰胺、組氨酸、羥脯氨酸、天冬氨酸等含量次之，脯氨酸平均含量最低(5.28 μg/g)。從核苷酸總量來(lái)看，阜陽(yáng)產(chǎn)樣品總核苷含量為2 309.02 μg/g，亳州次之，商丘最低。核苷類成分以鳥(niǎo)嘌呤平均含量最高(12 677.08 μg/g)，尿嘧啶、胞苷等次之，腺苷平均含量最低(0.83 μg/g)。由此說(shuō)明產(chǎn)區(qū)環(huán)境生態(tài)因子對(duì)薄荷中氨基酸和核苷類成分的合成積累影響較大。TOPSIS綜合分析結(jié)果顯示, 就總成分而言, S1(安徽阜陽(yáng)) 樣品薄荷相對(duì)較優(yōu)。

本試驗(yàn)建立了UFLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定3個(gè)不同產(chǎn)地薄荷中21種氨基酸和10種核苷含量的方法，比較了不同產(chǎn)地對(duì)薄荷中氨基酸和核苷類成分的影響，綜合評(píng)價(jià)顯示，阜陽(yáng)產(chǎn)薄荷的綜合質(zhì)量最優(yōu)，亳州其次，商丘綜合質(zhì)量最差。通過(guò)PCA和TOPSIS對(duì)藥食兩用薄荷質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，為優(yōu)選薄荷最優(yōu)產(chǎn)地提供理論依據(jù)，同時(shí)為進(jìn)一步探索評(píng)價(jià)藥食兩用薄荷的內(nèi)在質(zhì)量與控制提供依據(jù)及新的質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)參考方法。