優(yōu)化頂空固相微萃取/氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法測定蜂王漿揮發(fā)性化合物

王嬌，李玉新，趙保堂，何興芬，張俊，張兆云，楊富民*

1(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州， 730070)2(甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所，甘肅 蘭州，730070)

蜂王漿是一種淡黃色的乳脂狀物質(zhì)，略帶刺激性氣味[1]。蜂王漿是由年輕工蜂(ApismelliferaL.)的下咽和下頜腺分泌的一種微酸性(pH 3.5～4.5)物質(zhì)。新鮮蜂王漿含水(50%～65%)、蛋白質(zhì)(11%～18%)、碳水化合物(10%～15%)、脂肪酸和脂質(zhì)(4%～8%)、礦物質(zhì)鹽(約1.5%)以及少量的多酚和維生素[2]。有關(guān)蜂王漿的特性、營養(yǎng)功能及用途已有大量報道，但不同來源蜂王漿的揮發(fā)性化合物組成和含量測定報道很少。中國是蜂王漿生產(chǎn)及出口大國，蜂王漿揮發(fā)性化合物的研究將有助于蜂王漿進一步利用。

天然食品的風(fēng)味和香氣很大程度上取決于基質(zhì)和頂空中的揮發(fā)性化合物[3]。揮發(fā)性化合物的提取目前有同時蒸餾、動態(tài)頂空、靜態(tài)頂空、超聲波輔助提取以及蒸汽蒸餾、溶劑萃取、固相微萃取等。頂空固相微萃取(headspace-solid phase microextraction，HS-SPME)是一種快速無溶劑分離技術(shù)，其主要優(yōu)點是簡單、靈敏度高、需要的樣品量少，可與氣相色譜、氣相色譜-質(zhì)譜和高效液相色譜聯(lián)用[4]。ISIDOROV等[5]采用HS-SPME從蜂王漿中分離出了25種揮發(fā)性化合物，其中最豐富的是2-庚酮、2-壬酮、苯甲醛和辛酸,將蜂王漿樣品在-18 ℃和4 ℃下儲存10個月，其揮發(fā)性化合物的成分基本不變;但在室溫下儲存10個月，苯酚的含量為原來的50%。ZHAO等[6]分析了10個不同開花季節(jié)的蜂王漿樣品，發(fā)現(xiàn)蜂王漿揮發(fā)性化合物中富含酸、酯和醛類化合物，如乙酸、苯甲酸甲酯、己酸和辛酸等。對蜂王漿揮發(fā)性化合物進行分析，可能有助于確定其來源、質(zhì)量和新鮮度。

揮發(fā)性有機化合物的分析受提取和檢測技術(shù)的影響[7]，不同特性的原料萃取方法不同，不同來源蜂王漿其揮發(fā)性化合物含量不同，其差異有助于質(zhì)量評價。本研究采用HS-SPME方法對其萃取溫度、萃取時間、樣品量、加鹽量在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化試驗，旨在確定蜂王漿揮發(fā)性化合物的最佳提取條件，為準(zhǔn)確測定奠定基礎(chǔ)；通過對不同來源蜂王漿中揮發(fā)性化合物的檢測，揭示之間的差異，為其品質(zhì)評定及加工利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料：蜂王漿A采自寧夏固原市涇源縣，蜂王漿B、C、D、E 購自市售4個不同品牌的產(chǎn)品。

試劑：色譜級正己烷，成都科隆化工有限公司；2-甲基-3-庚酮，Shymax Chemicals 有限公司；C7-C30系列烷烴，Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

三重四級桿氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀7000D(配有EI離子源和NIST MS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng))，美國Agilent公司；DF-101S集熱式磁力攪拌器，常州市瑞華儀器制造有限公司；VF-WAXms毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm, 0.25 μm)，美國Agilent公司；手動固相微萃取裝置、50/30μm DVB/CAR/PDMS 萃取纖維頭，美國Supelco公司；微量進樣器(1 μL)，上海安亭微量進樣器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 蜂王漿揮發(fā)性化合物的提取

參照任佳淼等[8]方法略作修改，準(zhǔn)確稱取2 g蜂王漿樣品置于20 mL頂空瓶內(nèi)，加入轉(zhuǎn)子密封，在預(yù)先設(shè)置好溫度的加熱磁力攪拌器上平衡30 min。將SPME萃取頭插入頂空瓶中，推出纖維頭后吸附50 min，萃取結(jié)束后，在250 ℃的GC-MS進樣口解吸10 min。

1.3.2 氣相色譜條件

毛細(xì)管色譜柱VF-WAXms(30 m×0.25 mm, 0.25 μm)初始溫度40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升溫到200 ℃，再以10 ℃/min升溫至240 ℃，保持8 min。進樣口溫度250 ℃，載氣為He，流速1 mL/min，不分流。

1.3.3 質(zhì)譜條件

電離方式EI，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，傳輸線和四級桿溫度分別為250 ℃和150 ℃，掃描質(zhì)量范圍m/z29～600。

1.3.2 單因素試驗設(shè)計

按照1.3.1的方法，在樣品量為2 g、萃取溫度為60 ℃、萃取時間50 min、飽和NaCl用量2 mL、平衡30 min、解析10 min的基礎(chǔ)條件下，保持其他條件不變，分別設(shè)置萃取溫度40、50、60、70、80 ℃，萃取時間30、40、50、60、70 min，樣品用量1、1.5、2、2.5、3 g，飽和NaCl 溶液用量0、1、2、3、4 mL，以總峰面積為指標(biāo)進行單因素優(yōu)化試驗，每個試驗重復(fù)3次。

1.3.3 Box-Behnken 響應(yīng)面試驗

依據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取萃取溫度(X1)、萃取時間(X2)、樣品量(X3)、飽和NaCl溶液用量(X4)為影響因素，以總峰面積為響應(yīng)值，做4因素3水平響應(yīng)面試驗，設(shè)計如表1所示。

表1 Box-Behnken 試驗因素水平表Table 1 Factors and levels used in Box-Behnken analysis

1.4 蜂王漿揮發(fā)性化合物的測定

采用試驗所優(yōu)化的條件，將蜂王漿置于20 mL頂空瓶中，加入1 μL的內(nèi)標(biāo)(2-甲基-3-庚酮，8.16 μg/μL，正己烷溶液溶解)，磁力攪拌平衡30 min，SPME萃取60 min，250 ℃ GC-MS進樣口解吸10 min, 溶劑延遲4 min。氣相色譜及質(zhì)譜條件同1.3.2和1.3.3。

1.5 定性定量分析

定性分析：檢索NIST MS數(shù)據(jù)庫比對目標(biāo)化合物，進行定性分析；采用相同條件對正構(gòu)系列烷烴(C7～C30)進行GC-MS分析，利用色譜峰的保留時間計算目標(biāo)相應(yīng)化合物的保留指數(shù)，并與在數(shù)據(jù)庫中查詢的RI值比對(認(rèn)定范圍為相差0～100)，實現(xiàn)化合物的輔助定性。色譜峰保留指數(shù)計算如公式(1)所示：

(1)

式中：ta為色譜峰a的保留時間，tn為正構(gòu)烷烴Cn的保留時間(色譜峰a的保留時間須在正構(gòu)烷烴Cn和Cn+1之間)。

定量分析：根據(jù)蜂王漿樣品中添加的內(nèi)標(biāo)化合物含量、內(nèi)標(biāo)化合物色譜峰面積及目標(biāo)化合物色譜峰面積，計算目標(biāo)化合物的含量，計算如公式(2)所示：

(2)

式中：CX為目標(biāo)化合物的質(zhì)量濃度，CA為內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量濃度，SX為目標(biāo)化合物的峰面積，SA為內(nèi)標(biāo)的峰面積。

1.6 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用 SPSS 25.0 軟件進行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 萃取單因素試驗

由圖1-a可見，萃取溫度40～60 ℃，隨著溫度上升，總峰面積不斷增大，60 ℃時達(dá)到最大值，之后稍有下降，70 ℃與80 ℃的總峰面積無顯著差異。因此，宜選擇60 ℃作為萃取溫度。圖1-b表明，萃取時間為30～60 min，隨時間延長，總峰面積不斷增大，60 min時，總峰面積最大，之后開始減小，其原因可能是隨著萃取時間的延長部分物質(zhì)會從萃取頭上解析下來，進而造成總峰面積的降低。由圖1-c可以看出，樣品量對總峰面積的影響呈現(xiàn)出先增大再減小的趨勢。在2 g時總峰面積最大，其原因可能是因為樣品量少，吸附物的量??；樣品量過大，頂空體積變小，影響吸附效果。添加適宜鹽可以提高極性化合物和揮發(fā)性化合物的提取效率[9]。由圖1-d可知，飽和NaCl溶液的添加量在1 mL時，總峰面積最大，表明蜂王漿萃取適宜的鹽添加為飽和NaCl溶液1 mL。

a-萃取溫度;b-萃取時間;c-樣品量;d-飽和NaCl添加量圖1 單因素試驗結(jié)果Fig.1 Single-factor test results

2.2 響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗

利用Design Expert軟件，對表2的數(shù)據(jù)進行二次多項式回歸擬合，以色譜總峰面積為響應(yīng)值，得到二次多元回歸方程如下：

表2 響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果Table 2 Response surface design and results

表3 二次回歸方程模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the quadratic regression model

圖2 響應(yīng)面三維分析圖Fig.2 Response surface 3D analysis chart

Expert-design軟件預(yù)測的萃取條件條件為萃取溫度61.91 ℃，萃取時間59.99 min，樣品量2.02 g，飽和NaCl溶液添加量為0.92 mL，總峰面積的預(yù)測值為3.310 11×1010?？紤]到試驗的實際操作情況，將萃取條件優(yōu)化為萃取溫度62 ℃，萃取時間60 min，樣品量2 g，飽和NaCl溶液的添加量為1 mL，在此條件下進行3次驗證試驗，得到總峰面積的平均值為3.247 99×1010，試驗值與預(yù)測值基本吻合。

2.3 蜂王漿揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測定

圖3為樣品A的總離子流圖，其余樣品與樣品A基本相似。由圖3可知，色譜條件適合HS-SPME萃取的蜂王漿揮發(fā)性化合物測定，色譜峰完全分離，很少重疊，分離效果好。

由表4可看出，5個蜂王漿樣品中共檢出48種化合物，其中酸類15種、酯類12種、醛類5種、醇類5種、酮類4種、酚類2種、其他5種；33種化合物是通過保留指數(shù)和NIST MS數(shù)據(jù)庫的雙重定性，結(jié)果較為可靠。就含量而言，不同蜂王漿樣品中單一揮發(fā)性化合物的含量范圍為0.09～17.48 μg/μL。辛酸在蜂王漿的揮發(fā)性化合物中含量最高，其次是反式-2-癸烯酸、苯甲醛、(E)-2-辛烯酸、2-壬酮、己酸、2-庚酮等。

圖3 樣品A的總離子流圖Fig.3 Total ion chromatogram of volatile components in sample A

表4 蜂王漿樣品中揮發(fā)性化合物的定性和定量分析 單位：μg/μLTable 4 Qualitative and quantitative analysis of volatile compounds in royal jelly samples

續(xù)表4

注：同一行不同小寫字母表示具有顯著性差異(P<0.05);--表示未檢出或未檢索到

由圖4可知，5個蜂王漿樣品中揮發(fā)性化合物含量較高的是酸類、酯類、醛類和酮類，其中酸類遠(yuǎn)高于其他類別。不同樣品間，A樣品酸類、醛類、酮類和其他類的含量最高，分別為(26.16±0.43)、(3.37±0.03)、(5.45±0.08)、(1.16±0.01) μg/μL；B樣品除酯類和其他類外，均低于其他樣品；C樣品醇類和酚類最高；D樣品酯類最高，其他類未檢出；E樣品除酯類、醇類、其他類低于其他樣品外，其余類別高低不一。不同來源蜂王漿揮發(fā)性化合物種類含量的不同，可能與蜜源、新鮮度及貯藏條件有關(guān)。

圖4 不同蜂王漿中各類揮發(fā)性化合物的含量變化Fig.4 Contents of various volatile components of different royal jelly samples

3 討論

HS-SPME是從固體或液體樣品的頂部空間中提取揮發(fā)性化合物到涂覆有聚合物相的萃取纖維頭上。因此，HS-SPME萃取條件會影響其分析的靈敏度和準(zhǔn)確性[10]。由于HS-SPME的機理是建立在三相分析物(纖維涂層、頂空、樣品)之間平衡的基礎(chǔ)上，因此HS-SPME對頂空揮發(fā)性化合物的分析在很大程度上受到小瓶中揮發(fā)性化合物蒸氣壓的影響。據(jù)報道，影響蒸氣壓力和頂部空間中揮發(fā)性成分平衡的主要變量是萃取溫度、平衡時間和萃取時間[11-12]。添加NaCl用于揮發(fā)物的提取，主要是利用鹽析效應(yīng)增加分析物進入頂空及纖維涂層的量[13]。因此，可以通過優(yōu)化所涉及的參數(shù)來獲得靈敏度和萃取率之間平衡良好的方法[14]。

基于試驗獲得的蜂王漿揮發(fā)性性化合物的萃取條件，檢測出了符合條件的48種物質(zhì)，酸類物質(zhì)和酯類占比最高，分別是31%、25%。其次為醛類、醇類各占10%、酮類8%。揮發(fā)性化合物對香氣及某些成分的味道有著很大的影響[15-16]，5個樣品中酸類物質(zhì)最多，含量也最高，這與蜂王漿自身的酸味相吻合。5個樣品中共有的化合物有16種，如辛酸、己酸、苯甲醛、苯酚和苯甲酸甲酯等，這些共有化合物可能與蜂王漿的特征風(fēng)味有關(guān)。

4 結(jié)論

蜂王漿組成與特性顯著不同于其他食品原料，其揮發(fā)性化合物的提取需要依據(jù)其特性采用適宜的方法及條件。采用HS-SPME方法，在萃取溫度62 ℃、萃取時間60 min、樣品量2 g、飽和NaCl溶液的添加量為1 mL的條件下，總峰面積的平均值可達(dá)到3.247 99×1010，提取分離效果好。不同蜂王漿因蜜蜂品種、蜜源等條件不同，揮發(fā)性化合物存在差異，但其共有的辛酸、己酸、苯甲醛、苯酚和苯甲酸甲酯等可能與蜂王漿的特征風(fēng)味有關(guān)。本實驗僅測定了5個不同樣品的揮發(fā)性化合物，應(yīng)對不同蜜源、不同貯存條件的蜂王漿進行進一步的測定，揮發(fā)性化合物的測定有助于評價蜂王漿的新鮮度，而對貯存條件、方式、時間等方面進行深入研究將是未來蜂王漿揮發(fā)性物質(zhì)的研究方向之一。