肌原纖維蛋白熱誘導凝膠特性及化學作用力研究進展

王靜宇，胡新，劉曉艷，姬紅，楊京霞，劉小麗，陳辰，屈長青*

1(阜陽師范大學 生物與食品工程學院，安徽 阜陽，236037)2(抗衰老中草藥安徽省工程技術研究中心，安徽 阜陽，236037)

肌肉中的蛋白質(zhì)根據(jù)其溶解度大小分成三類：水溶性的肌漿蛋白(30%)、不溶性的膠原蛋白(10%)以及鹽溶性的肌原纖維蛋白(myofibrillar protein，MP)(60%)；按其所在的位置可以分為MP(55%)以及其他蛋白質(zhì)(肌漿蛋白質(zhì)、顆粒蛋白質(zhì)以及肉基質(zhì)蛋白質(zhì))。由于肉的種類不同，所含比例略有差異(其中水產(chǎn)類MP占比50%～70%，而畜禽類MP占比55%～60%)。不管以何種方式劃分，MP不僅是含量最高的蛋白質(zhì)同時也是熱誘導凝膠形成最關鍵的蛋白質(zhì)[1]。肌原纖維蛋白凝膠特性決定著糜類肉制品的感官品質(zhì)(如彈性、硬度等)，改善其凝膠特性一直是肉類研究的熱點，而氫鍵、疏水相互作用、二硫鍵以及靜電相互作用這4種化學作用力又決定了凝膠特性[2]。目前國外對蛋白質(zhì)凝膠化學作用力的研究不夠全面，且主要是針對共價鍵二硫鍵的研究，而針對氫鍵、疏水相互作用以及靜電斥力研究很少，尤其是氫鍵。本文通過總結分析國內(nèi)外肌原纖維蛋白化學作用力對凝膠特性的影響，進而探討了凝膠形成的深層次原因，旨在為肉類凝膠制品的加工提供一定理論指導。

1 肌原纖維蛋白熱誘導凝膠形成機制

熱誘導是蛋白質(zhì)形成凝膠的重要形式之一，在加熱條件下，原生態(tài)肌原纖維蛋白分子內(nèi)部結構遭到破壞而發(fā)生伸展，使得其內(nèi)部的一些疏水性殘基和反應基團暴露，蛋白分子之間相互聚集而形成凝膠，由于蛋白分子之間的引力(氫鍵、疏水相互作用和二硫鍵)與斥力(靜電相互作用)相平衡形成有序而穩(wěn)定的三維網(wǎng)絡凝膠結構，而不致形成沉淀[2]。熱誘導凝膠的特性主要取決于蛋白質(zhì)變性展開的速度(v展開)和聚集的速度(v聚集)：當v展開>v聚集時，MP凝膠結構為有序均勻的，當v展開

2 肌原纖維蛋白的凝膠特性

2.1 肌原纖維蛋白凝膠的流變特性

貯能模量(G′)和損耗模量(G″)是蛋白質(zhì)動態(tài)流變性的重要指標，G′代表凝膠的彈性部分，G″代表凝膠的黏性部分。而隨著溫度的升高，G′和G″也會相應的發(fā)生改變，因此研究肌原纖維蛋白動態(tài)流變性是探索其熱誘導凝膠形成過程的有效方法之一，同樣對肉制品產(chǎn)品質(zhì)量控制是非常重要的。

動態(tài)流變儀可用于測定肌原纖維蛋白的流變特性。由于肉的種類不同，所含的肌原纖維蛋白比例不同，其流變特性(凝膠形成溫度)也略有差別。VISESSANGUAN等[4]利用動態(tài)流變儀研究了箭齒鰈的肌球蛋白(肌原纖維蛋白的主要成分)流變性，根據(jù)G′隨溫度的變化，將其凝膠形成過程歸為3個階段：凝膠開始形成(0～34 ℃)、凝膠強度降低(34～40 ℃)以及凝膠強度增加(40～80 ℃)。LI等[5]發(fā)現(xiàn)添加凝膠多糖的魚糜肌球蛋白的G′在36.4 ℃之前保持平穩(wěn)不變，36.4～46.1 ℃迅速增長，在46.1 ℃時G′達到最大，這是由于肌球蛋白頭部開始變性。46.1 ℃之后G′急劇降低，在50 ℃左右達到一個極小值，這種現(xiàn)象可能是由于肌球蛋白的螺旋與折疊結構相互轉(zhuǎn)換，破壞了蛋白質(zhì)的網(wǎng)絡結構。隨后肌球蛋白的G′從50 ℃開始緩慢增加直至80 ℃，此時蛋白質(zhì)的三維凝膠網(wǎng)絡結構形成。而王靜宇等[6]研究雞肉肌原纖維蛋白的流變特性，發(fā)現(xiàn)G′值開始先從20 ℃升至48 ℃，超過48 ℃之后G′值顯著降低，53 ℃時最低，當溫度超過53 ℃以后，G′值又快速增加。

2.2 肌原纖維蛋白凝膠的質(zhì)構特性

肌原纖維蛋白凝膠的質(zhì)構特性除受MP分子特性和結構特征影響之外，還受一些外在因素的影響，比如：超高壓、超聲波、pH、離子強度、添加物等，如表1所示。

2.3 肌原纖維蛋白凝膠的保水性

保水性是凝膠性質(zhì)中的一種重要性質(zhì)。測定蛋白質(zhì)凝膠保水性最常見的方法就是離心，但是離心必須在高速條件下，這樣蛋白質(zhì)的凝膠網(wǎng)絡結構就會遭到破壞，從而導致所測得的保水值不夠準確。而新興的高新技術低場核磁共振，是一種無損的、非侵入式的測量高含水量樣品水分分布狀態(tài)和移動性的儀器，能夠在不破壞凝膠結構的情況下測定凝膠中各種水的可移動性及各水分的比例，能夠較好地反映凝膠保水性。保水性要符合以下情況：保留水的空間以及留住水分所需要的作用力。PUOLANNE等[17]指出蛋白質(zhì)與水之間的氫鍵作用和毛細管作用是維持凝膠中水分主要作用力。而GUO等[18]指出0.5 mT低頻磁場處理的豬肉肌原纖維熱誘導凝膠的保水性最好，這是因為α-螺旋增加和β-折疊減少導致其結構發(fā)生改變，疏水作用增加，而在熱誘導凝膠形成過程中，疏水作用力能形成更好的蛋白-蛋白聚集物，從而能夠促進形成均一、致密結構的凝膠，最終凝膠的保水性得到提高。王靜宇等[2]表明凝膠保水性的大小受其作用力影響，研究得出短時間的超聲波處理(0～6 min)雞肉肌原纖維蛋白，其凝膠保水性與疏水作用力、靜電斥力以及氫鍵這3種作用力都隨著超聲時間的增加顯著增加。適量的強氧化劑HClO(5 mmol/L)可有效增加豬肉肌原纖維蛋白分子表面的凈電荷，從而改善其保水性[19]。

表1 質(zhì)構特性的主要外在影響因素Table 1 The main external influence factors of texture property

3 肌原纖維蛋白凝膠形成的作用力

在MP熱誘導凝膠形成過程中，化學作用力(氫鍵、靜電相互作用、疏水相互作用和二硫鍵)是決定蛋白凝膠特性的關鍵因素。ZHOU等[20]通過高速剪切力對肌原纖維蛋白與低脂形成的混合凝膠進行研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)熱誘導凝膠形成過程中的主要作用力是氫鍵、靜電斥力和疏水相互作用，而不是二硫鍵。IWAMI等[21]在研究鮭魚肌原纖維蛋白熱凝膠過程時，推測疏水相互作用和靜電相互作用是肌原纖維蛋白交聯(lián)形成具有三維網(wǎng)絡結構的凝膠的主要作用力。張興等[22]通過添加尿素研究了雞肉肌原纖維蛋白熱誘導凝膠形成過程，也認為靜電相互作用和疏水相互作用比氫鍵的作用更重要。LIU等[23]研究了魚肉和豬肉肉糜在加熱過程中蛋白分子間的相互作用，發(fā)現(xiàn)當溫度達到25 ℃時，肉糜凝膠中的氫鍵數(shù)量迅速改變。

由于蛋白質(zhì)原材料、處理手段等的不同，使得每種化學作用力在凝膠形成過程中的作用存在差異，但普遍認為在凝膠形成過程中，非共價鍵(氫鍵、靜電相互作用和疏水相互作用)作用大于共價鍵(二硫鍵)，后者只延長了蛋白質(zhì)分子的鏈長，對形成或維持其凝膠網(wǎng)絡結構沒有作用[24]?；瘜W作用力與蛋白質(zhì)結構也是息息相關的。蛋白質(zhì)一級結構主要依靠肽鍵和二硫鍵連接，氫鍵是穩(wěn)定二級結構的主要作用力，尤其是α-螺旋結構，而維持三級和四級結構的作用力主要是二硫鍵和疏水相互作用。而MP熱誘導凝膠的形成正是因為加熱使得原始肌原纖維蛋白分子內(nèi)部結構遭到破壞而發(fā)生伸展，其埋藏在分子內(nèi)部的巰基和疏水基團暴露，蛋白分子間的化學作用力達到平衡，從而形成了有序而穩(wěn)定的三維網(wǎng)絡凝膠結構。

研究不同的作用力需要用不同的方法，但目前對這4種作用力的測定方法研究還不夠完善。其中二硫鍵測定方法的研究是最多的，靜電斥力和疏水相互作用次之，氫鍵最少，而且研究不夠全面和深入。

3.1 二硫鍵

二硫鍵屬于共價化學鍵，國內(nèi)外針對蛋白質(zhì)凝膠中二硫鍵的研究最多，相應的測定方法也是最成熟的，其中利用總巰基和活性巰基含量變化來表征二硫鍵的變化是最常見的；也可以通過添加化學試劑影響二硫鍵的作用。最近研究發(fā)現(xiàn)SDS-PAGE技術以及拉曼光譜也可以用來研究蛋白質(zhì)分子的二硫鍵。

許多學者通過巰基含量變化研究了肌原纖維蛋白與其主要成分肌球蛋白凝膠形成過程中二硫鍵的變化，總巰基含量指暴露在蛋白表面和埋藏在蛋白分子內(nèi)的巰基，而活性巰基指暴露在蛋白分子表面的巰基。YONGSAWATDIGU等[25]指出馬鲅魚肌動球蛋白在整個加熱過程中(5～90 ℃)，總巰基含量先保持不變(5～30 ℃)，之后逐漸降低(40～90 ℃)，而活性巰基含量先增加后降低， 50 ℃達到最大值，可能是隨加熱溫度的上升，蛋白分子逐漸展開，內(nèi)部巰基逐漸暴露出來，使活性巰基含量達到最大并促進蛋白分子內(nèi)部的巰基形成二硫鍵。RIEBROY等[26]通過研究鱈魚肌動球蛋白酸誘導凝膠形成過程，猜測二硫鍵的形成是因為巰基基團氧化，從而導致總巰基含量的減少。VISESSANGUA等[27]對箭齒鰈肌球蛋白熱誘導凝膠形成過程進行研究，也得出同樣的結論。ZHANG等[28]指出超聲波能夠使水分子解離出高活性的自由基(H2O→·H+·OH)，進而反應生成的過氧化氫很容易把蛋白質(zhì)中的巰基氧化成二硫鍵，導致總巰基減少。

添加化學試劑也可以影響二硫鍵的變化，最常見的就是添加化學試劑二硫蘇糖醇(DL-dithiothreitol，DTT)，這是因為其可用于阻止蛋白質(zhì)中的半胱氨酸之間所形成的蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間二硫鍵。SMYTH等[29]通過添加DTT于雞胸肉肌球蛋白中來研究其熱誘導凝膠形成過程，發(fā)現(xiàn)二硫鍵存在與否，雞胸肉肌球蛋白凝膠都可形成，但二硫鍵存在時，有助于凝膠網(wǎng)絡結構的形成。LIU等[30]通過添加DTT研究了大豆分離蛋白間的相互作用，也得出了同樣結論。有人曾使用FeCl3、H2O2、抗壞血酸鹽等氧化蛋白質(zhì)中的活性巰基，導致二硫鍵的形成[31]。

SDS-PAGE技術近年來被用于研究蛋白質(zhì)中的二硫鍵。KO等[32]通過SDS-PAGE電泳對熱變性后的羅非魚肌動球蛋白分子質(zhì)量進行測定時，發(fā)現(xiàn)當溫度達到75 ℃后發(fā)現(xiàn)有聚合物生成，并進一步指出75 ℃以上的熱聚集主要歸功于二硫鍵。潘錦鋒等[33]以1 ℃/min的升溫速率加熱草魚肌原纖維蛋白溶液進行研究，其SDS-PAGE電泳結果表明肌球蛋白重鏈隨著溫度的上升而減少，同時分離膠上方還有一定的大分子物質(zhì)生成，即草魚肌原纖維蛋白在加熱過程中(>45 ℃時)產(chǎn)生了二硫鍵。

拉曼光譜是一種新型技術，廣泛應用于研究分子結構，屬于分子振動光譜，可以提供分子振動信息，具有分辨振動頻率強，測定方法簡單且不損壞樣品等優(yōu)點。二硫鍵(S—S)會發(fā)生伸縮振動，在拉曼光譜的譜峰中會顯示二硫鍵的3種構象，在510 cm-1處是扭式-扭式-扭式(g-g-g)構象；525 cm-1處是扭曲-扭曲-反式(g-g-t)構象，540 cm-1處是反式-扭曲-反式(t-g-t)構象[34],如表2所示。因此拉曼光譜中500～550 cm-1附近的酰胺Ⅲ氨基酸側(cè)鏈的伸縮振動可以反映S—S三種構象的變化，從而引起二硫鍵的改變。WANG等[9]通過拉曼光譜分析發(fā)現(xiàn)經(jīng)不同時間的超聲處理，二硫鍵扭曲-扭曲-反式(g-g-t)構象的伸縮振動均會顯著增強。

表2 拉曼光譜中二硫鍵構象譜圖分析Table 2 Analysis of disulfide bond conformation in Raman spectra

3.2 疏水相互作用

疏水相互作用是指蛋白質(zhì)在水溶液中由水結構誘導的非極性基團之間的相互作用。普遍認為疏水作用力是蛋白凝膠形成過程中最主要的作用力之一。RELKIN等[35]研究發(fā)現(xiàn)在加熱條件下蛋白質(zhì)分子內(nèi)部包埋的多肽鏈就會暴露到表面，是相鄰多肽鏈間的疏水作用力增強的最主要原因。VISESSANGUAN等[27]通過研究箭齒鰈肌球蛋白的熱誘導形成凝膠過程，得出即使在高溫條件下，疏水相互作用也是凝膠形成過程中的主要化學作用力。疏水性氨基酸的暴露為蛋白質(zhì)提供了表面疏水性，能夠反映蛋白質(zhì)分子微觀構象的變化，因此疏水作用力可以用其來衡量[36]。熒光分光光度法通?？捎脕頊y定疏水作用力[34]。8-苯氨基-1-萘磺酸銨鹽作為一個疏水性熒光探針，被用于通過與蛋白質(zhì)的疏水區(qū)域結合來監(jiān)測蛋白質(zhì)構象變化[37]。王靜宇等[2]研究表明適度的超聲波(0～6 min)處理，顯著增強了肌原纖維蛋白凝膠的表面疏水性。

近期發(fā)現(xiàn)拉曼光譜也可以測定蛋白質(zhì)的疏水相互作用，其既能反映蛋白質(zhì)主鏈的骨架振動，也能反映其側(cè)鏈周圍微環(huán)境的變化。由于苯丙氨酸的強度不隨蛋白質(zhì)結構的變化而發(fā)生改變，因此可以根據(jù)其在拉曼光譜1 003 cm-1處伸縮振動的強度作為內(nèi)標進行歸一化，其中以色氨酸疏水殘基的760 cm-1處的歸一化強度(I760/I1003)反映蛋白的疏水性[38]。ZHANG等[39]研究了在低鈉和不同鹽替代NaCl條件下MP凝膠的拉曼光譜變化情況，數(shù)據(jù)顯示常規(guī)鈉組(0.6 mol/L NaCl)凝膠在760 cm-1處歸一化強度顯著高于低鈉組(0.4 mol/L NaCl)，由此得出低濃度的鈉鹽會減弱MP熱誘導凝膠的疏水相互作用的結論。

3.3 靜電相互作用

靜電相互作用是肌原纖維蛋白形成凝膠的重要作用力。由加熱形成的肌原纖維蛋白凝膠網(wǎng)絡結構是蛋白質(zhì)分子中引力和斥力平衡的結果，蛋白質(zhì)分子受熱打開，內(nèi)部的功能基團暴露出來形成引力，而蛋白質(zhì)分子表面電荷形成斥力[40]。一般在蛋白質(zhì)聚集過程中，靜電相互作用常表現(xiàn)為靜電斥力。遠離等電點時，蛋白質(zhì)分子表面的正電荷與負電荷數(shù)目不等，此時靜電斥力作用最大，蛋白質(zhì)表面的氫鍵結合位點增加，氫鍵作用增強，因此蛋白質(zhì)多肽鏈結構中的非共價鍵平衡被打破，疏水相互作用減弱，導致蛋白質(zhì)分子中引力和斥力不平衡，不利于形成均一穩(wěn)定的肌原纖維蛋白凝膠網(wǎng)絡結構。而在等電點附近時，剛好相反，排斥的靜電相互作用和吸引的疏水相互作用、分子間的氫鍵作用以及二硫鍵能保持很好的平衡，有利于形成均一穩(wěn)定的肌原纖維蛋白凝膠網(wǎng)絡結構[11]。

靜電相互作用常用的測定方法是Zeta電位。因其能測定蛋白質(zhì)表面電荷的電位，常用于解釋蛋白質(zhì)凝膠顆粒間的靜電相互作用。ZHANG等[41]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)超高壓處理后的肌原纖維蛋白再經(jīng)熱處理凝膠化后，Zeta電位的絕對值持續(xù)升高，這是由于超高壓能夠破壞蛋白聚集體，并使蛋白質(zhì)分子鏈逐漸展開，暴露更多的疏水基團、帶電基團和羥基等極性基團，導致蛋白分子間靜電斥力增強。

3.4 氫鍵

通常情況下，大量的氫鍵用以維系蛋白質(zhì)的各級結構，同時其在凝膠結構和黏彈性的形成方面也起重要作用。針對氫鍵在蛋白質(zhì)凝膠形成中的作用，說法不一。倪娜等[12]通過改變pH來研究羔羊背最長肌肌原纖維蛋白，發(fā)現(xiàn)pH為7.5時，疏水相互作用是形成凝膠最主要的作用力，但pH對氫鍵具有較大影響。SHIGERU等[42]通過對大豆蛋白熱誘導凝膠形成過程的研究，提出在凝膠網(wǎng)絡結構的形成和維持中，起到最重要作用的是氫鍵，而不是其他化學作用力(二硫鍵等)。

在肌原纖維蛋白熱誘導凝膠形成過程中，對各種化學作用力的研究，很少有針對氫鍵的研究報道。原因可能包括兩個方面，一方面是肌原纖維蛋白分子處在一個復雜的環(huán)境溶液中，因此氫鍵既能作用于蛋白分子內(nèi)部也能作用于蛋白分子之間，同時也能作用于蛋白分子與其所在溶劑之間；第二是很難定量測定氫鍵作用。

4 討論與展望

肌原纖維蛋白的凝膠特性決定著肉制品的質(zhì)量，而化學作用力(疏水相互作用、靜電相互作用、氫鍵以及二硫鍵)決定著蛋白質(zhì)的凝膠特性。我們可以通過一些物理(超聲波、超高壓等)或者化學(尿素、pH等)方法來改變肌原纖維蛋白凝膠化學作用力，進而改變其凝膠特性，找出最優(yōu)處理條件，從而為糜類凝膠制品(香腸、丸子等)實際生產(chǎn)應用提供參考。因此研究化學作用力對肌原纖維蛋白凝膠特性的影響至關重要。目前國內(nèi)外對蛋白質(zhì)凝膠化學作用力的研究不夠全面，且主要是針對共價鍵二硫鍵的研究，但針對氫鍵、疏水相互作用以及靜電斥力研究很少。因此現(xiàn)階段對肌原纖維蛋白凝膠形成的主要化學作用力還不夠深入，且方法單一，尤其是氫鍵。酰胺(—CO—NH2)、氨基酸(NH2—CH—COOH)和羥基(—OH)是最重要的氫鍵給體與受體，因此可以根據(jù)測定這3個基團的改變來間接研究肌原纖維蛋白熱誘導凝膠中氫鍵的變化?，F(xiàn)已有利用拉曼光譜技術，基于酪氨酸上的酚羥基與水形成氫鍵的原因來研究蛋白質(zhì)凝膠中氫鍵的改變。近些年各種檢測技術手段的更新發(fā)展，比如近紅外光譜技術，它可以確定酰胺基團間的氫鍵作用，反過來我們也可以把這種技術應用在蛋白質(zhì)凝膠中氫鍵的研究。由于蛋白質(zhì)分子相互作用決定其結構變化，且多個酰氨基團在分子中的位置對于凝膠的理化性質(zhì)也有很大影響，因此我們也可以更加深入地從蛋白質(zhì)分子官能團結構角度認識及解釋化學作用力在凝膠形成過程中的具體變化，進而引起凝膠特性的改變，這將為糜類肉制品品質(zhì)的進一步改善提供理論依據(jù)。