體外模擬消化對(duì)蘋果多酚及其抗氧化活性的影響

朱秀靈，葉精勤，盛伊健，孔雯瑾，陳廷然，傅錫鵬，戴清源

(安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 蕪湖，241000)

植物多酚是植物次級(jí)代謝產(chǎn)物的主要成分也是膳食中主要的抗氧化劑[1]，在胃腸消化過程中，由于食物基質(zhì)、pH、溫度、吸收抑制劑、吸收促進(jìn)劑、酶、宿主及其他相關(guān)因素的影響，其物理化學(xué)性質(zhì)、穩(wěn)定性和抗氧化活性均可發(fā)生變化[1]。由于體外消化模型不僅價(jià)格便宜、操作簡單、條件可控、采樣容易、結(jié)果可重復(fù)、不存在道德限制[2]，而且對(duì)生物利用度的評(píng)價(jià)結(jié)果與人體或動(dòng)物模型相吻合[1]，因此，體外消化模型已被廣泛用于預(yù)測(cè)酚類化合物在胃腸消化過程中的穩(wěn)定性、抗氧化活性及其生物利用度[3-8]。

蘋果是我國也是世界上種植最廣泛、消費(fèi)量最大的水果之一[1, 9]，通常以鮮果或其加工品如蘋果干、蘋果醬、蘋果汁及蘋果酒等形式在市場(chǎng)上供應(yīng)。蘋果富含膳食纖維和酚類化合物，大量食用，可降低患慢性疾病(如肺癌、哮喘和心血管疾病)的風(fēng)險(xiǎn)[1, 9-11]。蘋果中含量最高的酚類化合物是槲皮素(以糖基化形式存在)、兒茶素和表兒茶素，它們是澀味和苦味的重要成分[9]。此外，蘋果還含有以酯化形式存在的咖啡酸、奎寧酸(綠原酸)和對(duì)香豆酸。蘋果皮富含二氫查耳酮類物質(zhì)如葉綠素及其葡萄糖苷形式存在的根皮苷[9]。由于蘋果品種不同、多酚類物質(zhì)存在部位、提取方法及檢測(cè)手段的不同，蘋果多酚類物質(zhì)的主要酚類成分及其含量也不盡相同，在機(jī)體消化過程中，再加上食品基質(zhì)的影響，更加難于確定給定劑量的蘋果原料在體外消化過程中多酚類物質(zhì)的變化情況及其與抗氧化活性之間的相關(guān)性。

為此，本研究首先提取蘋果中的多酚類物質(zhì)，以富集多酚成分的提取物為研究對(duì)象，通過體外消化模型，探討多酚提取物在不同消化階段主要酚類物質(zhì)及其抗氧化活性的變化情況和相關(guān)性。研究結(jié)果為多酚類物質(zhì)的生物利用度及生物活性評(píng)價(jià)提供了參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

新鮮紅富士蘋果，購于當(dāng)?shù)卮鬂櫚l(fā)超市；胃蛋白酶、膽汁提取物、福林酚試劑，BR級(jí)，購于上海瑞永生物科技有限公司；胰蛋白酶，BR級(jí)，購于北京索萊寶科技有限公司；原花青素、兒茶素、表兒茶素、綠原酸、咖啡酸、槲皮素、根皮素等標(biāo)準(zhǔn)品，購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)，梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；2,2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(2,2′-Azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid ammonium salt，ABTS)、2,4,6-三(2-吡啶基)三嗪(2,4,6-Tri (2-pyridyl)-s-triazien，TPTZ)、奎諾二甲基丙烯酸酯(6-hydroxy- 2, 5, 7, 8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid，Trolox)，2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二鹽酸鹽 (2,2′-Azobis (2-methylpropionamidine) dihydrochloride，AAPH)、熒光素，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

L3S型可見分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司；JK-400CDB型高功率數(shù)控超聲波清洗器，合肥市金尼克機(jī)械制造有限公司；ZFD-A5140型鼓風(fēng)干燥箱，上海智城分析儀器制造有限公司；TGL-16G型臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；FD8-3型冷凍干燥機(jī)，美國Sim International Group公司；Prominence LC-20A型高效液相色譜儀，日本島津；SI-114型電子天平，美國DENVER INSTRUMENT公司；M5型酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蘋果原料處理

將一定量的新鮮蘋果經(jīng)清洗、干燥后切成條狀，于沸水中熱燙2～3 min，撈出瀝干，平鋪于干燥箱托盤上，于85 ℃熱風(fēng)干燥至恒重，粉碎，過100目篩，即得到蘋果粉。稱取20 g蘋果粉于500 mL錐形瓶中，按料液比1∶20(g∶mL)加入體積分?jǐn)?shù)50%乙醇，進(jìn)行超聲提取(超聲功率400 W、超聲溫度控制在50 ℃以下，超聲時(shí)間30 min)[12]，抽濾，收集濾液，將濾液經(jīng)真空濃縮、凍干，即得到蘋果多酚提取物，-20 ℃存放備用。

1.3.2 體外消化

蘋果多酚提取物體外消化，參照文獻(xiàn)[1]、[8]、[13-16]報(bào)道方法，并修改如下：

(1)模擬胃消化 準(zhǔn)確稱量40 mg胃蛋白酶，用0.1 mol/L HCl溶液定容到10 mL，配制成4 mg/mL胃蛋白酶溶液。稱取90 mg NaCl用蒸餾水溶解并定容到10 mL，即得到9 mg/mL NaCl溶液。稱量蘋果多酚提取物2.5 g，加蒸餾水溶解并定容到10 mL。取3 mL多酚溶液，加入6 mL 9 mg/mL NaCl溶液和6 mL 4 mg/mL胃蛋白酶溶液，用0.1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至2.0，取2.00 mL作為胃消化0 h樣品。其余溶液置于37 ℃恒溫振蕩箱中培養(yǎng)1 h，取2.00 mL溶液作為胃消化1 h樣品，剩余部分的胃消化液采用1 mol/L NaHCO3調(diào)節(jié)pH至7.0，用于腸消化。

(2)模擬腸消化 準(zhǔn)確稱量20 mg胰蛋白酶和120 mg膽酸鹽，用0.1 mol/L NaHCO3溶液分別定容至10 mL，得到2 mg/mL胰液和12 mg/mL膽汁。將胰液和膽汁溶液按體積比1∶1混合均勻，制得胰液-膽汁混合液。用移液管分別移取5份每份2.00 mL胃消化1 h的樣液(預(yù)先調(diào)節(jié)pH至7.0)至5個(gè)10.0 mL具塞試管中，分別加入4.0 mL胰液-膽汁混合液，并采用0.1 mol/L NaHCO3調(diào)節(jié)pH至7.0，置于37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在0、1.0、2.0、3.0和4.0 h各取出1管，作為腸消化0、1.0、2.0、3.0和4.0 h的樣品，為了確保酚類化合物的穩(wěn)定及抑制胰蛋白酶活性，采用6 mol/L HCl調(diào)節(jié)樣品pH至2.0。

以不含多酚提取物的溶液作為空白對(duì)照，按照多酚提取物體外消化的方法進(jìn)行操作，按時(shí)取樣。將不同消化階段的消化液分別離心(4 500 r/min，10 min)，棄沉淀，上清液于-20 ℃存放備用。

1.3.3 總酚含量測(cè)定

總酚含量(total phenolic content，TPC)的測(cè)定采用福林酚法，參照文獻(xiàn)[1]、[17-18]并修改如下：以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，以溶解多酚提取物的溶劑或者經(jīng)過胃消化或腸消化的空白溶液溶解沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，配成質(zhì)量濃度為0～100 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別量取1.0 mL不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液置于不同的試管中，再分別加入5.0 mL 10%福林酚試劑，搖勻反應(yīng)6 min，然后加入4.0 mL 7.5% Na2CO3溶液，用相應(yīng)的溶劑定容，搖勻，避光常溫靜置60 min，于766 nm處測(cè)定吸光度。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用同樣的方法，分別測(cè)定不同消化階段樣品溶液的吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中總酚含量，結(jié)果以每克多酚提取物(以干基計(jì))所含的沒食子酸(GAE)的毫克數(shù)表示。

1.3.4 HPLC檢測(cè)主要酚類物質(zhì)

量取消化前后的樣品溶液各1 mL，4 500 r/min離心10 min，棄沉淀，上清液加入3倍體積的甲醇，手動(dòng)攪拌5 min，離心(4 500 r/min，10 min)，棄沉淀，將上清液過0.22 μm濾膜，采用日本島津Prominence LC-20A高效液相色譜儀檢測(cè)上清液中多酚成分。色譜條件：Omsi Sype C18柱(250 mm× 4.6 mm，5 μm)，保護(hù)柱(ChrmSEP 1 cm×3 mm)。流動(dòng)相A相為0.1%磷酸、B相為體積分?jǐn)?shù)100%甲醇。梯度洗脫為5%B(0 min)，25%B(0～5 min)，34%B(5～14 min)，37%B(14～25 min)，40%B(25～30 min)，49%B(30～34 min)，50%B(34～35 min)，51%B(35～58 min)，55%B(58～60 min)，80%B(60～62 min)，保持在80%B(62～65 min)，降至5%B(65～67 min)，維持在5%B(67～72 min)。流量為0.8 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；檢測(cè)波長為280 nm。以綠原酸、表兒茶素、兒茶素、咖啡酸、原花青素、根皮素、槲皮素為標(biāo)準(zhǔn)品，混標(biāo)進(jìn)樣，以峰面積為縱坐標(biāo)，以濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得到各標(biāo)準(zhǔn)品的線性方程，根據(jù)線性方程，計(jì)算得出不同消化階段消化液中的主要酚類物質(zhì)含量，結(jié)果以每毫升消化液所含的對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的毫克數(shù)表示。

1.3.5 抗氧化活性

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力

參照文獻(xiàn)[19]并修改如下：準(zhǔn)確稱取2.4 mg DPPH，用無水乙醇溶解并定容至50 mL，得到濃度為48 mg/L DPPH貯備液，-20 ℃避光保存。向測(cè)試管1中加入2.00 mL 48 mg/L DPPH溶液和1.00 mL待測(cè)樣品，搖勻，避光反應(yīng)30 min，用可見分光光度計(jì)測(cè)定517 nm處的吸光度(即為待測(cè)樣品的吸光度AS)。向測(cè)試管2中加入2.00 mL DPPH溶液和1.00 mL無水乙醇，搖勻，避光反應(yīng)30 min，測(cè)定517 nm處的吸光度(即為初始溶液的吸光度A0)。向待測(cè)樣品管中加入待測(cè)樣品1.0 mL和2.00 mL無水乙醇，搖勻，避光反應(yīng)30 min，測(cè)定517 nm處的吸光度值(即為參比溶液的吸光度Ar)。樣品對(duì)DPPH自由基清除率(IDPPH，%)按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：IDPPH，DPPH自由基清除率，%；A0，初始溶液的吸光度；Ar，參比溶液的吸光度；As，待測(cè)溶液的吸光度。

1.3.5.2 ABTS自由基清除能力

參照文獻(xiàn)[20-22]方法，稱取96.0 mg ABTS，用去離子水溶解并定容至25 mL，配制成7 mmol/L ABTS溶液；稱取16.6 mg過硫酸鉀，用去離子水溶解并定容至25 mL，配制成2.45 mmol/L溶液；按體積比2∶1將ABTS溶液和過硫酸鉀溶液混合，黑暗中靜置12～16 h，以形成穩(wěn)定的ABTS自由基陽離子(ABTS+·)，此溶液即為ABTS+·儲(chǔ)備液。使用前用去離子水將ABTS+·儲(chǔ)備液稀釋使其在734 nm波長處的吸光度值為(0.700 ± 0.02)。然后量取2.9 mL ABTS+·稀釋液與0.1 mL胃腸消化不同時(shí)間樣液混合，于黑暗處30 ℃反應(yīng)10 min，在734 nm波長處測(cè)定其吸光度。以去離子水為空白對(duì)照。則樣品對(duì)ABTS自由基清除率(IABTS，%)按公式(2)計(jì)算：

(2)

式中：IABTS，ABTS自由基清除率，%；AB，空白對(duì)照溶液的吸光度；AS，待測(cè)樣品溶液的吸光度。

1.3.5.3 鐵離子還原能力(ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP)

參照文獻(xiàn)[23-24]方法，首先配制溶液：乙酸鈉緩沖溶液(300 mmol/L，pH 3.6)的配制：稱取1.55 g三水合乙酸鈉，用適量去離子水溶解并轉(zhuǎn)移到500 mL容量瓶中，加入8 mL乙酸，然后再補(bǔ)加去離子水至刻度，混勻；10 mmol/L TPTZ溶液：稱取156 mg TPTZ，用40 mmol/L HCl溶解并定容至50 mL，混勻；20 mmol/L FeCl3·6H2O溶液的配制：稱取270 mg FeCl3·6H2O，加入去離子水溶解并定容至50 mL，混勻；FRAP試劑的配制：將乙酸鈉緩沖溶液、TPTZ溶液和FeCl3·6H2O溶液，按照體積比10∶1∶1混勻配制而成。然后，將2 850 μL FRAP試劑(預(yù)熱至37 ℃)和150 μL胃腸消化不同時(shí)間樣液混合，室溫暗處反應(yīng)30 min，于593 nm處測(cè)定吸光度。以去離子水作為空白對(duì)照，以Trolox為參照，結(jié)果以每毫克多酚提取物(以干基計(jì))所對(duì)應(yīng)的Trolox當(dāng)量表示(μmol Trolox/mg)。

1.3.5.4 氧自由基吸收能力(oxygen radical absorbance capacity，ORAC)

將胃腸消化不同時(shí)間樣品溶液(各1 mL)，離心(4 500 r/min，10 min)，棄沉淀，上清液冷凍干燥，然后參照文獻(xiàn)[25]方法測(cè)定氧自由基吸收能力。方法如下：采用75 mmol/L pH 7.4 磷酸鹽緩沖溶液溶解熒光素并配制成120 μmol/L熒光素儲(chǔ)備液，在4 ℃存放，使用前再稀釋100倍。將凍干樣品分別采用75 mmol/L pH 7.4 磷酸鹽緩沖溶液溶解并配制成6 mg/mL溶液，各取20 μL樣品溶液和120 μL 1.2 μmol/L 熒光素加入到黑色96孔酶標(biāo)板中，混合均勻，于37 ℃保溫15 min。然后每孔內(nèi)快速加入60 μL 12 mmol/L AAPH溶液，酶標(biāo)儀讀取每孔的熒光值，每隔1 min讀數(shù)1次，測(cè)定80 min。整個(gè)測(cè)試過程中酶標(biāo)儀溫度控制在37 ℃，激發(fā)波長和發(fā)射波長分別設(shè)定為485 nm和530 nm。以75 mmol/L pH 7.4 磷酸鹽緩沖溶液作為空白對(duì)照，以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)品。按公式(3)計(jì)算待測(cè)樣品熒光強(qiáng)度曲線下方的面積(AUCSample)及空白對(duì)照熒光強(qiáng)度曲線下方的面積(AUCBlank)，按公式(4)計(jì)算待測(cè)樣品熒光強(qiáng)度曲線下方的凈面積。以標(biāo)準(zhǔn)品Trolox濃度及其熒光衰減曲線下方的凈面積建立回歸方程，待測(cè)樣品的ORAC值通過回歸方程計(jì)算，結(jié)果以每毫克多酚提取物(以干基計(jì))所對(duì)應(yīng)的Trolox當(dāng)量表示(μmol Trolox/mg)。

(3)

AUCNet=AUCSample-AUCBlank

(4)

式中：F0，時(shí)間為0 min時(shí)的熒光強(qiáng)度；Fi，時(shí)間為第imin 時(shí)的熒光強(qiáng)度；AUC，待測(cè)樣品在時(shí)間imin內(nèi)熒光衰減曲線下方的面積；AUCNet，待測(cè)樣品在時(shí)間imin內(nèi)熒光衰減曲線下方的凈面積。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(standard deviation，SD)表示。運(yùn)用SPSS version 17.0 軟件分析不同處理間的差異顯著性。運(yùn)用Excel 2007中的Correl函數(shù)計(jì)算總酚含量與以DPPH、ABTS、FRAP和ORAC法測(cè)定的抗氧化活性之間的相互關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外模擬消化過程中總酚含量的變化

以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用福林酚法測(cè)定總酚含量，線性方程為Y=0.115 1X+0.002 5，R2=0.997 3，線性范圍為0～100 mg/L。根據(jù)線性方程，計(jì)算不同消化階段樣品中的總酚含量，結(jié)果如表1所示。

由表1可知，消化前樣品中的總酚含量最高，經(jīng)過胃消化(胃消化0、0.5、1 h相比)，總酚含量顯著增加，與文獻(xiàn)[15]報(bào)道一致，但在腸消化過程中，總酚含量先增加而后減少，且胃腸消化過程中總酚含量均低于消化前樣品，說明胃腸消化導(dǎo)致多酚降解或者轉(zhuǎn)化，與文獻(xiàn)[1]報(bào)道一致。胃消化0.5 h時(shí)總酚含量顯著高于胃消化0 h的含量，可能是因?yàn)槲赶缸饔眉捌鋸?qiáng)酸環(huán)境，使部分結(jié)合態(tài)酚分解釋放出游離態(tài)酚，從而使可測(cè)定的總酚含量增加；此后，直至胃消化1 h，總酚含量略有下降，可能與胃消化酶活性被抑制使游離態(tài)酚釋放量減少有關(guān)。在腸消化初始階段(0 h)，總酚含量突然降低，這是由于腸消化液的加入，對(duì)多酚起到稀釋作用，此外，pH值上升，酸堿環(huán)境改變，導(dǎo)致可測(cè)的多酚含量降低。此后，直至腸消化2 h，總酚含量基本保持不變。在腸消化3 h時(shí)，總酚含量又突然增加，可能與腸消化酶作用有關(guān)，腸消化酶使底物中的結(jié)合態(tài)酚分解，釋放游離態(tài)酚，因此總酚含量增加。此后，總酚含量開始減少，其原因可能是胰酶活性降低，結(jié)合態(tài)酚分解減慢，也可能是游離態(tài)酚轉(zhuǎn)化為其他化合物，從而使游離態(tài)酚含量減少。在胃腸消化過程中，腸消化液中總酚含量低于胃消化液中的含量，說明胃腸消化降低了蘋果多酚提取物中的總酚含量。

表1 體外不同消化階段消化液中總酚含量Table 1 Total phenolic content at different digestion stages in vitro

注：不同字母表示在相同消化液中消化不同時(shí)間，差異顯著(P<0.05)

2.2 體外模擬消化過程中抗氧化活性變化

2.2.1 DPPH自由基清除能力

體外模擬消化過程中DPPH自由基清除率的變化如圖1所示。由圖1可知，消化前樣品對(duì)DPPH自由基清除率為(37.24±1.63)%，胃消化0 h和1 h、腸消化2 h和4 h時(shí)DPPH自由基清除率分別為(74.17±1.40)%，(68.57±1.25)%，(88.81±2.95)%和(80.84±2.22)%。當(dāng)胃消化0 h和1 h時(shí)，蘋果多酚對(duì)DPPH自由基清除率分別是消化前樣品的1.99倍和1.84倍；在腸消化2 h和4 h時(shí)，DPPH自由基清除率分別是消化前樣品的2.38倍和2.17倍。在腸消化2 h時(shí)DPPH自由基清除率最大。

與消化前樣品相比，胃消化0 h時(shí)，DPPH自由基清除率顯著增加，可能是由于胃消化液的強(qiáng)酸性環(huán)境，促使某些結(jié)合態(tài)酚分解釋放出游離態(tài)酚，增強(qiáng)了對(duì)DPPH自由基的清除能力。在胃消化1 h時(shí)，DPPH自由基清除能力略有下降，可能是游離酚降解或轉(zhuǎn)化為其他成分。在腸消化2 h時(shí)，DPPH自由基清除率最大，這是由于腸消化液中消化酶的作用，使得結(jié)合態(tài)酚分解釋放出游離態(tài)酚。在腸消化4 h時(shí)，DPPH自由基清除率顯著下降，可能是因?yàn)榉磻?yīng)體系中易被氧化的多酚類物質(zhì)發(fā)生降解或轉(zhuǎn)化，從而使得DPPH自由基清除率降低。

因此，經(jīng)過胃腸消化，蘋果多酚提取物對(duì)DPPH自由基清除率顯著提高，說明胃腸消化增強(qiáng)了蘋果多酚提取物的抗氧化活性，這與JAYAWARDENA等[15]報(bào)道不一致，JAYAWARDENA等[15]發(fā)現(xiàn)胃腸消化不一定增強(qiáng)蘋果汁對(duì)DPPH自由基的清除效果。

2.2.2 ABTS自由基清除能力

不同消化階段蘋果多酚提取物對(duì)ABTS自由基清除能力如圖1所示。與消化前樣品相比，胃消化和腸消化均顯著提高蘋果多酚提取物對(duì)ABTS自由基清除能力(P<0.05)。在胃消化階段，ABTS自由基清除率逐漸增加但效果不顯著(P>0.05)；與胃消化相比，腸消化階段ABTS自由基清除率顯著增加，在腸消化2 h時(shí)，ABTS自由基清除率最高為(84.31±3.51)%，約是消化前樣品的1.95倍，再隨著腸消化時(shí)間延長，ABTS自由基清除率反而顯著下降，這與QUAN等[26]報(bào)道一致。其原因可能是從胃消化到腸消化pH值的改變導(dǎo)致多酚類化合物的結(jié)構(gòu)變化，從而降低對(duì)自由基的清除能力[26]。據(jù)報(bào)道，蘋果多酚在較低的pH條件下顯示出較強(qiáng)的抗氧化能力，在較高的pH條件下被氧化成醌，清除自由基能力下降[26]。此外，消化酶(蛋白質(zhì))可能通過氫鍵、共價(jià)鍵、疏水相互作用與多酚鍵合，從而影響多酚的抗氧化能力[22, 26]。

圖1 體外模擬消化過程中DPPH和ABTS自由基清除率的變化Fig.1 Changes of DPPH and ABTS radical scavenging rates during in vitro simulated digestion注：不同大小寫字母分別表示ABTS和DPPH自由基清除率差異顯著(P < 0.05)(下同)

2.2.3 鐵離子還原能力

如圖2所示，與消化前樣品相比，體外模擬胃消化能夠顯著提高蘋果多酚提取物的鐵離子還原能力(P< 0.05)，在胃消化1 h時(shí)，F(xiàn)RAP達(dá)到最大值為(4.25±0.13) μmol Trolox/mg。但是當(dāng)蘋果多酚提取物由胃消化進(jìn)入腸消化后，F(xiàn)RAP值呈顯著性下降趨勢(shì)，說明蘋果多酚提取物對(duì)鐵離子的還原能力隨著腸消化時(shí)間延長顯著下降，這一現(xiàn)象與BOUAYED等[1]報(bào)道一致。鐵離子還原能力在腸消化階段顯著下降，可能與腸消化階段多酚濃度低有關(guān)，也可能與pH值有關(guān)[1]。根據(jù)鐵離子還原能力測(cè)定方法，可以得知pH 3.6是FRAP值測(cè)定的合適條件，胃消化液pH 2.0與pH 3.6較接近，而腸消化液pH 7.0與pH 3.6偏離較遠(yuǎn)，由此推測(cè)，pH值的改變可能是導(dǎo)致腸消化階段FRAP值顯著下降的原因之一[1]。

2.2.4 氧自由基吸收能力

胃腸消化過程中氧自由基吸收能力變化如圖2所示。胃腸消化后溶液的ORAC值顯著高于消化前樣品(P< 0.05)，在胃消化1 h時(shí)，ORAC值最大，最大值為(4.77±0.19) μmol Trolox/mg。由胃消化進(jìn)入到腸消化時(shí)，ORAC值顯著降低，可能是由于pH值改變及消化酶作用，導(dǎo)致酚類物質(zhì)不穩(wěn)定發(fā)生降解或轉(zhuǎn)化，從而降低其抗氧化活性。但在腸消化階段隨著消化時(shí)間的延長，ORAC值下降并不明顯(P>0.05)。

圖2 體外模擬消化過程中FRAP值和ORAC值的變化Fig.2 Changes of FRAP and ORAC values during in vitro simulated digestion

2.3 總酚含量與抗氧化活性之間的相關(guān)性

利用Excel 2007中的correl函數(shù)，分別對(duì)消化前樣品、胃消化0 h和1 h、腸消化2 h和4 h樣品的總酚含量與DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率、ORAC值及FRAP值之間的相互關(guān)系進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果以絕對(duì)值表示見表2，其絕對(duì)值越接近于1，說明兩者相關(guān)性越強(qiáng)，其絕對(duì)值越小，說明兩者之間相關(guān)性小或不相關(guān)。

表2 總酚含量及抗氧化活性之間的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis between total phenolic content and antioxidant activities

由表2可知，總酚含量與以DPPH、ABTS及ORAC法測(cè)定的抗氧化活性高度相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)分別為0.933 7、0.851 3和0.747 6；總酚含量與FRAP值之間相關(guān)系數(shù)為0.504 7，說明兩者之間相關(guān)性不高；DPPH與ABTS之間相關(guān)系數(shù)為0.960 8，表明兩者高度相關(guān)(如圖1所示)；ORAC與DPPH、與ABTS之間的相關(guān)系數(shù)分別為0.687 8和0.785 7，說明相關(guān)性高；FRAP與TPC、DPPH、ABTS及ORAC之間的相關(guān)系數(shù)均低于0.60，說明FRAP值與總酚含量及其他方法測(cè)定的抗氧化活性之間相關(guān)性不高。PODSEDEK等[27]研究發(fā)現(xiàn)總酚含量與抗氧化活性(以ABTS和FRAP法測(cè)定)之間的相關(guān)系數(shù)大于0.97，說明總酚含量與抗氧化活性高度相關(guān)。本研究中總酚含量與ABTS法測(cè)定的抗氧化活性相關(guān)性較高，但與FRAP測(cè)定的抗氧化活性相關(guān)性不高，這與PODSEDEK等[27]報(bào)道不完全一致。JAYAWARDENA等[15]報(bào)道總酚含量與ORAC、FRAP、DPPH、ABTS之間的相關(guān)系數(shù)分別為0.975、0.893、0.821、0.752，DUDONNE等[20]報(bào)道總酚含量與ABTS、DPPH、FRAP、ORAC相關(guān)系數(shù)依次為0.966、0.939、0.906和0.831，而本研究發(fā)現(xiàn)總酚含量與不同方法測(cè)定的抗氧化活性按照相關(guān)系數(shù)由高到低依次為DPPH(0.933 7)、ABTS(0.851 3)、ORAC(0.747 6)及FRAP(0.504 7)。由此看出，總酚含量與抗氧化活性之間的相關(guān)性，除了與抗氧化活性的測(cè)定方法有關(guān)[15]，還可能與酚類物質(zhì)的來源、主要酚類成分、游離或結(jié)合狀態(tài)等有關(guān)。

2.4 體外模擬消化過程中主要酚類物質(zhì)的變化

圖3-a為標(biāo)準(zhǔn)品綠原酸、兒茶素、表兒茶素、咖啡酸、原花青素，槲皮素和根皮素的高效液相色譜圖，分別對(duì)應(yīng)峰1～7，其保留時(shí)間分別為19.391、19.865、21.242、22.351、25.858、53.275、56.142 min。圖3-b～圖3-f分別為消化前樣品、胃消化0 h、胃消化1 h、腸消化 2 h和4 h的樣品的高效液相色譜圖。

a-標(biāo)準(zhǔn)品;b-消化前樣品;c-胃消化0 h;d-胃消化1 h;e-腸消化2 h;f-腸消化4 h峰1～7分別對(duì)應(yīng)綠原酸、兒茶素、表兒茶素、咖啡酸、原花青素、槲皮素和根皮素圖3 胃腸消化液及標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖Fig.3 High performance liquid chromatogram of gastrointestinal digestive juice and standards

由圖3可知，綠原酸是蘋果多酚提取物中的主要成分，在胃腸消化液中均可檢出，其峰面積及峰高均隨著消化進(jìn)程(消化前→胃消化→腸消化)顯著性下降；兒茶素在消化前樣品中未被檢出，在胃消化的初始階段(0 h)及胃消化1 h時(shí)，均檢測(cè)到兒茶素色譜峰，可能是由于胃消化液pH值較低的強(qiáng)酸性環(huán)境使蘋果多酚提取物中其他成分轉(zhuǎn)化為兒茶素，但隨著腸消化液pH值升高，兒茶素分子又轉(zhuǎn)化為其他成分，所以在腸消化液中未檢出兒茶素。表兒茶素和咖啡酸在消化前樣品及胃消化液中均可檢測(cè)到色譜峰，在腸消化液中未檢測(cè)到，說明胃腸消化也影響其分子存在形式；原花青素僅在消化前樣品中檢測(cè)到色譜峰，說明原花青素不穩(wěn)定，在胃腸消化中容易降解或轉(zhuǎn)化。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間，初步判斷不同消化階段樣品中多酚成分；以標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)、以濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到各標(biāo)準(zhǔn)品的線性方程，根據(jù)消化液中多酚對(duì)應(yīng)的峰面積，由線性方程計(jì)算消化液中主要酚類物質(zhì)的含量(表3)。

由表3可知，消化前樣品中綠原酸含量最高為(285.46±20.55) μg/mL，其次為原花青素(19.60±1.26) μg/mL、表兒茶素(17.92±5.02) μg/mL和咖啡酸(12.60±3.73) μg/mL。兒茶素、槲皮素及根皮素在消化前樣品未檢測(cè)到，說明蘋果多酚提取物不含有兒茶素、槲皮素及根皮素，或因其含量較低未被檢出。

表3 不同消化階段消化液中主要酚類物質(zhì)含量 單位：μg/mLTable 3 The content of main phenolic components in digestive juice at different digestion stages

注：同一行中不同字母表示差異顯著(P<0.05)，-表示未檢出

由表3還可以看出，蘋果多酚提取物在胃腸消化過程中主要酚類物質(zhì)的含量發(fā)生顯著性變化，經(jīng)胃腸消化后，僅能檢測(cè)出綠原酸，其含量由消化前(285.46±20.55) μg/mL減少到(16.24±4.55) μg/mL。BOUAYED等[28]報(bào)道綠原酸是蘋果多種含量最高的酚類物質(zhì)(11.8～16.3 mg/100g)，其次，因蘋果品種不同，可能是表兒茶素(4.8～7.8 mg/100g)也可能是原花青素(5.0～7.1 mg/100g)；在胃消化和腸消化過程中綠原酸含量急劇減少，表兒茶素和咖啡酸在胃消化液中含量均較低，在腸消化液中其含量更低甚至檢不出含量，原花青素在腸消化液中未檢出。由此看出，本研究中主要酚類物質(zhì)含量高低及在胃腸消化過程中的變化趨勢(shì)與BOUAYED等[28]報(bào)道相一致。

由圖3和表3可知，蘋果多酚提取物中主要酚類物質(zhì)在胃腸消化過程中不穩(wěn)定，會(huì)發(fā)生降解或轉(zhuǎn)化。與腸消化相比，胃消化過程中強(qiáng)酸性環(huán)境在一定程度上抑制酚類物質(zhì)的降解，這一現(xiàn)象與文獻(xiàn)[29]報(bào)道一致。

由表1不同消化液中總酚含量及表3不同消化液中主要酚類物質(zhì)的含量，可以看出，總酚含量高于主要酚類物質(zhì)的含量之和，說明胃腸消化液中存在一定量的不同于研究中所使用的標(biāo)準(zhǔn)品的酚類物質(zhì)，或許是這些標(biāo)準(zhǔn)品的降解或轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。由圖1和圖2可以看出胃腸消化后抗氧化能力顯著高于消化前樣品，說明蘋果多酚提取物經(jīng)過胃腸消化產(chǎn)生了抗氧化物質(zhì)，這些抗氧化物質(zhì)并不是這幾種給定的標(biāo)準(zhǔn)品，胃腸消化后抗氧化能力的增強(qiáng)歸因于胃腸消化后新生成的抗氧化成分。由此可知，胃腸消化使蘋果多酚提取物中主要酚類物質(zhì)發(fā)生降解或轉(zhuǎn)化，同時(shí)產(chǎn)生新的抗氧化成分，這些新的抗氧化成分有待于進(jìn)一步探討。

3 結(jié)論

蘋果多酚是膳食中抗氧化劑的主要成分，本研究采用體外消化模型探討蘋果多酚提取物在胃腸消化過程中總酚含量、主要酚類物質(zhì)含量、DPPH和ABTS自由基清除能力、鐵離子還原能力以及氧自由基吸收能力。結(jié)果表明，胃消化液中總酚含量隨著消化時(shí)間延長而增加，腸消化液中總酚含量隨著消化時(shí)間延長先增加后減少，但均低于消化前樣品中的含量；胃消化液中可檢測(cè)的主要酚類物質(zhì)按照含量由高到低依次為綠原酸、表兒茶素、咖啡酸、兒茶素；腸消化液中可檢測(cè)的主要酚類物質(zhì)為綠原酸；胃腸消化使主要酚類物質(zhì)發(fā)生降解或轉(zhuǎn)化；胃腸消化增強(qiáng)了蘋果多酚提取物對(duì)DPPH自由基和ABTS自由基清除能力、鐵離子還原能力以及氧自由基吸收能力；相關(guān)性分析表明，總酚含量與以DPPH、ABTS、ORAC法測(cè)定的抗氧化活性之間高度相關(guān)，與以FRAP法測(cè)定的抗氧化活性相關(guān)性不高。

植物多酚是植物次級(jí)代謝產(chǎn)物中的一大類物質(zhì)，具有8 000多種化合物[28]，由于品種類型、存在部位、含量高低、提取方法、檢測(cè)方法、操作技術(shù)等的不同，在分析檢測(cè)時(shí)僅僅依據(jù)現(xiàn)有的幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。此外，在胃腸消化時(shí)，由于酸堿穩(wěn)定性、與消化酶的相互作用及食品基質(zhì)的影響，酚類物質(zhì)的存在形式及其生物活性可能發(fā)生很大變化?？寡趸钚詸z測(cè)方法包括DPPH、ORAC、FRAP、ABTS及細(xì)胞培養(yǎng)法，其方法和原理不同，所反應(yīng)的抗氧化機(jī)理有著本質(zhì)上的差異，僅靠一種方法評(píng)價(jià)多酚類物質(zhì)的抗氧化活性是不全面的。因此，有關(guān)蘋果多酚類物質(zhì)的酚類組成、胃腸消化對(duì)其成分的影響及其抗氧化活性評(píng)價(jià)，還有待于深入研究。