雪上一枝蒿總生物堿抗關(guān)節(jié)炎作用機(jī)制研究*

羅成月，陳曉蘭，楊敬洪，楊曉梅

(貴陽中醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，貴州 貴陽 550002)

雪上一枝蒿是毛茛科植物短柄烏頭AconitumbrachypodumDiels、鐵棒錘A.pendulumBusch及宣威烏頭A.subrosullatumH. -M.的干燥塊根[1]，為云南、貴州等地民間習(xí)用治療風(fēng)濕疼痛、關(guān)節(jié)炎、跌打損傷的要藥之一，藥理實驗已證明其具有鎮(zhèn)痛、抗炎作用[2]。但是在治療關(guān)節(jié)炎方面并未見報道。本實驗從抗炎角度，成功建立了大鼠足腫脹動物模型，通過觀察大鼠后足的紅腫情況，并檢測前列腺素、環(huán)氧合酶的含量，探討雪上一枝蒿總生物堿抗關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制，為其臨床治療關(guān)節(jié)炎癥提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

SD雄性大鼠，SPF級，體重量200±20g；購買于重慶騰鑫生物科技有限公司，合格證號：SCXK-(軍)2012-0011。

1.2 藥品與試劑

復(fù)方地塞米松軟膏(國藥集團(tuán)三益藥業(yè)有限公司，批號：H34020304) 雪上一枝蒿總生物堿(自制，純度61%)；角叉菜膠(Sigma公司，批號：G1013-05G)；乙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20160425)；ELISA試劑盒(上?？屏丈镉邢薰?

2 方法

2.1 對關(guān)節(jié)炎大鼠足腫脹度的影響

選取SD雄性大鼠，體重為180～220 g，隨機(jī)分為6組，分別為空白對照組，陽性對照組，模型組，雪上一枝蒿總堿溶液高劑量組、中劑量組、低劑量組，每組10只。適應(yīng)一星期以后，采用先給藥在造模的方法，空白組不給藥也不致炎，模型組不給藥，陽性組大鼠于左后足跖處涂擦復(fù)方地塞米松，大鼠給藥量為0.18～0.4 cm/d，雪上一枝蒿總堿溶液高劑量組、中劑量組、低劑量組大鼠于左后足跖分別涂擦質(zhì)量濃度為151 mg/mL、75.7 mg/mL、37.75 mg/mL的雪上一枝蒿總堿乙醇溶液；給藥量為每只0.2 mL，每天兩次，連續(xù)給藥7天，末次給藥1 h后用1%的角叉菜膠于大鼠左后足跖中心進(jìn)行皮下注射致炎，同時再給藥一次，用游標(biāo)卡尺分別測定給藥后1 h、2 h、4 h、6 h的足爪厚度，腫脹程度用造模后容積-造模前容積的差(mL)表示，計算足腫脹度。

2.2 對大鼠關(guān)節(jié)炎前列腺素E2(PGE-2)含量的影響

按2.1.1方法建模測定足腫脹度以后，處死大鼠，切下左后足趾，用10%甲醛溶液低溫浸泡，剪碎，離心，取組織液酶免疫測定法(EIA)測定炎足足跖部的滲出液前列腺素E2(PGE-2)的含量。

2.3 對大鼠關(guān)節(jié)炎足爪組織環(huán)氧合酶-2(COX-2)的影響

按2.1.1方法建模測定足腫脹度以后，處死大鼠，切下足趾，用10%的甲醛溶液低溫浸泡，免疫組織化學(xué)法(IHC)檢測角叉菜膠致炎大鼠足爪組織環(huán)氧合酶-2(COX-2)的表達(dá)情況。用IPP圖片處理軟件分析陽性顆粒的表達(dá)情況，用平均光密度表示(MOD)。

3 結(jié)果

3.1 對大鼠關(guān)節(jié)炎足腫脹度的影響

本實驗成功建立角叉菜膠致炎模型，采取先給藥再造模的方式，造模后再給藥治療一次。實驗前每組大鼠足爪正常無紅腫現(xiàn)象，實驗期間空白組大鼠的行動性、反應(yīng)性、毛發(fā)色澤均正常。致炎后模型組，復(fù)方地塞米松陽性組，雪上一枝蒿總堿高、中、低劑量組左后足開始出現(xiàn)紅腫現(xiàn)象，行動緩慢，給藥后左后足足爪在1～4 h內(nèi)紅腫明顯，6 h時除空白組外各組大鼠紅腫開始明顯減弱。

圖1 大鼠足腫脹特征Fig. 1 Characteristics of rat paw swelling

由表1可知，與空白組比較，各組大鼠造模并給藥后足爪都出現(xiàn)紅腫；與模型組對照，陽性組足趾厚度顯著低于模型組，雪上一枝蒿總堿高、中劑量組在1 h內(nèi)足腫脹也顯著性降低；4 h時雪上一枝蒿總堿中、低劑量組足趾厚度顯著降低，高劑量組也降低，但降低不明顯；6 h時，雪上一枝蒿總生物堿中劑量組足趾厚度顯著降低，高、低劑量組也有降低，但降低不明顯。

表1 對足腫脹度的影響

注：與空白組比較#p值<0.05；與模型組比較*p值<0.05。

3.2 對大鼠關(guān)節(jié)炎前列腺素E2的影響

由表2可知，與空白組比較，其余各組足爪組織中的前列腺素E2的含量顯著增加；與模型組比較，各組的前列腺素E2的含量均顯著降低。

表2 雪上一枝蒿總堿對大鼠前列腺素E2(PGE2)含量的影響

注：與模型組比較*P值<0.05；與空白組比較#P值<0.05。

3.3 對大鼠關(guān)節(jié)炎環(huán)氧合酶的影響

本實驗采用酶免疫法測定環(huán)氧合酶COX-2的表達(dá)情況，大鼠踝關(guān)節(jié)中COX-2的表達(dá)情況見圖2。

由圖2可知，各組大鼠足爪組織中環(huán)氧合酶的表達(dá)，其中模型組有大量的棕色染色細(xì)胞的表達(dá)，與模型組比較，陽性組和雪上一枝蒿總堿高、中、低3個給藥劑量組的棕色染色細(xì)胞明顯減少。由表3可知，與模型組比較，其他各組的平均光密度明顯降低，與空白組比較，陽性組與高劑量組的平均光密度值沒有顯著性差異，模型組，中、低劑量組的平均光密度值顯著升高。

表3 對大鼠環(huán)氧合酶的影響

注：與模型組比較*P值<0.05；與空白組比較#P值<0.05。

圖2 大鼠踝關(guān)節(jié)中COX-2的表達(dá)情況Fig. 2 Expression of COX-2 in the ankle joint of rats

4 討論

雪上一枝蒿總生物堿具有確切的抗炎、鎮(zhèn)痛作用，本文結(jié)果表明，雪上一枝蒿總生物堿能明顯抑制角叉菜膠所引起的大鼠足腫脹程度，與模型組對比，高、低劑量組在6 h時足腫脹有較少的降低，可能是由于實驗動物的差異造成的，在治療后6 h時陽性

組與中劑量給藥組的足腫脹顯著性降低，其中陽性組比模型組降低了1.95倍，中劑量組比模型組降低了1.77倍，陽性組、中劑量組的抗炎效果較佳。雪上一枝蒿總生物堿能顯著性抑制環(huán)氧合酶-2(COX-2)在炎癥中的表達(dá)，能顯著抑制前列腺素E2(PGE-2)的合成，其中，陽性組PGE-2的含量比模型組降低了2.15倍，高劑量組PGE-2的含量比模型組降低了1.78倍，中、低劑量組PGE-2的含量降低沒有陽性組和高劑量組明顯。說明雪上一枝蒿總生物堿抗關(guān)節(jié)炎作用機(jī)制可能與抑制環(huán)氧合酶-2的表達(dá)，減少PGE-2的合成有關(guān)。