色譜樹脂法分離純化兩性霉素B方法研究

郭月玲，王崔巖，李 敏，仲偉潭*，趙 輝，張雪霞

(1．微生物藥物國(guó)家工程研究中心，河北省工業(yè)微生物代謝工程技術(shù)研究中心，華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司，河北 石家莊 050015；2．華北制藥集團(tuán)華勝有限公司,河北 石家莊 052160)

兩性霉素B屬于多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗真菌抗生素,其作用機(jī)制主要是通過與敏感真菌細(xì)胞膜上的固醇相結(jié)合,損傷細(xì)胞膜的通透性,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)重要物質(zhì)如鉀離子、核苷酸和氨基酸等外漏,破壞細(xì)胞的正常代謝從而抑制其生長(zhǎng)。臨床上適用于全身性的真菌感染治療，特別對(duì)隱球菌、白色念珠菌等引起的腦膜炎、心內(nèi)膜炎、敗血癥、肺部及尿路感染等具有良好療效[1]。

工業(yè)生產(chǎn)上，兩性霉素B粗品需經(jīng)反復(fù)結(jié)晶洗滌方能得到合格精品，溶劑消耗量大，成本高。如何在提高兩性霉素B產(chǎn)品安全性的同時(shí)簡(jiǎn)化工藝，降低成本，獲得更高純度結(jié)晶粉，提高產(chǎn)品同行業(yè)競(jìng)爭(zhēng)力，一直是技術(shù)人員著力解決的問題[2]。作者采用色譜樹脂法對(duì)兩性霉素B粗品進(jìn)行色譜柱層析分離，層析液再結(jié)晶、干燥，得到了高純度的兩性霉素B精粉，對(duì)分離純化工藝進(jìn)行了優(yōu)化，以期為規(guī)模化工業(yè)生產(chǎn)提供指導(dǎo)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

兩性霉素B粗品,華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限公司；兩性霉素B標(biāo)準(zhǔn)品,華北制藥集團(tuán)華勝公司。

乙腈，色譜純，霍尼韋爾公司；二甲基甲酰胺(DMF)，分析純，天津百世化工有限公司；丙酮，分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；工業(yè)乙醇，滄州興隆化工有限公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；去離子水，自制。

色譜三號(hào)、色譜五號(hào)、色譜七號(hào)樹脂，上海華震公司。

中壓層析系統(tǒng)(C-635檢測(cè)器，C-615控制器，C-601泵，C-616收集器)，瑞士Buchi公司； LC-2010A型高效液相色譜儀，島津；磁力攪拌器。

1.2 方法

1.2.1 有關(guān)物質(zhì)HPLC檢測(cè)條件

色譜柱：Phenomenex Luna C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：流動(dòng)相A為乙腈-磷酸(300∶700)溶液(pH值1.0±0.05)，流動(dòng)相B為乙腈-磷酸(500∶500)溶液(pH 1.0±0.05)，按表1進(jìn)行線性梯度洗脫；流速0.8 mL·min-1；柱溫25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：303 nm和383 nm；進(jìn)樣量：100 μL[3]。

表1 流動(dòng)相A、B不同時(shí)間配比

Tab.1 The proportion of mobile phase A and B at different time

時(shí)間/min流動(dòng)相A/%流動(dòng)相B/%01000502080511000601000

1.2.2 樹脂型號(hào)的篩選

取色譜三號(hào)、色譜五號(hào)、色譜七號(hào)樹脂各100 g，分別用乙醇浸泡2～4 h，并不時(shí)攪動(dòng)，使樹脂充分溶脹。將已充分溶脹的樹脂裝柱，以2 BV·h-1流速、用5～8 BV的乙醇淋洗，直至流出液在試管中用水稀釋不渾濁為止，再用去離子水洗滌至乙醇濃度小于1%。用DMF-75%乙醇(1∶4 )混合溶液(pH值3.5～4.5)平衡中壓層析系統(tǒng)。取0.5 g兩性霉素B粗品，加入DMF分散，再加入一定量的乙酸調(diào)節(jié)溶液pH值為3.5～4.5，溶解，加入珍珠巖助濾，過濾得清液，加入4 BV75%乙醇，得到兩性霉素B粗品DMF-乙醇溶液。加樣于層析柱上，動(dòng)態(tài)過柱[4]，過柱速度5 mL·min-1，收集層析液，HPLC檢測(cè)有關(guān)物質(zhì)去除效果，以色譜樹脂對(duì)兩性霉素B的總雜質(zhì)及最大單雜的去除效果和結(jié)晶收率進(jìn)行篩選。

1.2.3 層析柱高徑比的選擇

取兩性霉素B粗品DMF-乙醇溶液，加樣于高徑比分別為5、7、9、11的層析柱上，過柱速度5 mL·min-1，收集層析液，HPLC檢測(cè)有關(guān)物質(zhì)去除效果，以高徑比對(duì)兩性霉素B的總雜質(zhì)及最大單雜的去除效果進(jìn)行篩選。

1.2.4 上樣量的選擇

采用色譜三號(hào)樹脂為填料，分別按照每100 g填料加載兩性霉素B粗品1.0 g、1.5 g、2.0 g、2.5 g、3.0 g的上樣量加樣于層析柱上，過柱速度5 mL·min-1，收集層析液，HPLC檢測(cè)有關(guān)物質(zhì)去除效果，以上樣量對(duì)兩性霉素B的總雜質(zhì)及最大單雜的去除效果進(jìn)行篩選。

1.2.5 過柱速度的選擇

取兩性霉素B粗品DMF-乙醇溶液，加樣于層析柱上，過柱速度分別為3 mL·min-1、5 mL·min-1、6 mL·min-1和7 mL·min-1，收集層析液，HPLC檢測(cè)有關(guān)物質(zhì)去除效果，以過柱速度對(duì)兩性霉素B的總雜質(zhì)及最大單雜的去除效果進(jìn)行篩選。

1.2.6 結(jié)晶

取兩性霉素B層析液，加入適量甘油，調(diào)溶液pH值5.3～5.6，攪拌2 h，結(jié)晶，抽濾，繼而用乙醇、丙酮分別挖洗抽濾，40 ℃減壓干燥得到兩性霉素B精粉。HPLC檢測(cè)精粉有關(guān)物質(zhì)含量，計(jì)算結(jié)晶收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 樹脂型號(hào)的確定(表2)

由表2可知，色譜三號(hào)樹脂對(duì)雜質(zhì)的去除效果[5]最好,層析液結(jié)晶后有關(guān)物質(zhì)含量最低，結(jié)晶收率也較高，且結(jié)晶產(chǎn)品中單個(gè)有關(guān)物質(zhì)最高含量不超過1.5%，遠(yuǎn)低于藥典標(biāo)準(zhǔn)。因此，選擇色譜三號(hào)樹脂作為填料。

2.2 層析柱高徑比的確定(圖1)

表2 色譜樹脂型號(hào)對(duì)去除雜質(zhì)效果的影響/%

Tab.2 The effect of type of chromatographic resin on impurity removal/%

注：ω總為結(jié)晶產(chǎn)品中總的有關(guān)物質(zhì)含量;ω單大為單個(gè)有關(guān)物質(zhì)最高含量，下同。

圖1 高徑比對(duì)去除雜質(zhì)效果的影響Fig.1 The effect of ratio of height to diameter on impurity removal

從圖1可知，高徑比越大，對(duì)雜質(zhì)的去除效果越好。但是考慮到實(shí)際操作，并不是高徑比越大越好，一般只要能達(dá)到分離效果就可以了。因?yàn)楦邚奖仍酱?，柱壓就越高，?duì)附屬設(shè)備要求增加，如需要高壓泵、耐壓管路等。因此，選擇層析柱高徑比為7。

2.3 上樣量的確定(表3)

表3 上樣量對(duì)去除雜質(zhì)效果的影響

Tab.3 The effect of sample amount on impurity removal

上樣量/[g·(100 g填料)-1]溶液體積mL結(jié)晶產(chǎn)品中有關(guān)物質(zhì)含量/%ω總ω單大1.002.41.21.5752.41.22.01002.51.32.51253.31.63.01504.22.3

從表3可知，隨著上樣量的增加，樹脂對(duì)雜質(zhì)的去除效果逐漸降低。綜合考慮，在保證有關(guān)物質(zhì)去除效果的前提下，選擇上樣量較大數(shù)值即1.5 g·(100 g填料)-1，無論總雜質(zhì)還是單個(gè)雜質(zhì)含量都最低。

2.4 過柱速度的確定(圖2)

從圖2可知，過柱速度越快，對(duì)雜質(zhì)的去除效果越

圖2 過柱速度對(duì)去除雜質(zhì)效果的影響Fig.2 The effect of sample speed on impurity removal

差。這是因?yàn)?，過柱速度過快，雜質(zhì)尚未進(jìn)入樹脂顆粒內(nèi)部被吸附，就已經(jīng)流走。因此，過柱速度應(yīng)適當(dāng)減慢，有利于雜質(zhì)吸附，但也并非越慢越好，過柱速度過慢會(huì)延長(zhǎng)產(chǎn)品的生產(chǎn)周期，造成產(chǎn)品降解及不必要的人工及動(dòng)力消耗，提高生產(chǎn)運(yùn)營(yíng)成本。綜合考慮，選擇過柱速度為5 mL·min-1。

2.5 結(jié)晶甘油加入量的確定(表4)

表4 甘油加入量對(duì)去除雜質(zhì)效果的影響

Tab.4 The effect of additive amount of glycerol on impurity removal

甘油加入量‰過濾時(shí)間min結(jié)晶收率%結(jié)晶產(chǎn)品中有關(guān)物質(zhì)含量/%ω總ω單大04089.12.51.30.33890.42.01.00.63591.81.70.81.03092.21.40.61.52992.31.40.62.02992.21.40.6

在結(jié)晶過程中，加入一定比例甘油，可以有效控制結(jié)晶速率，增大占有較大比例的有效物質(zhì)的結(jié)合概率，從而有效避開相關(guān)雜質(zhì)，進(jìn)而結(jié)合而形成結(jié)晶，造成可結(jié)晶雜質(zhì)濃度過低留在母液中，從而達(dá)到雜質(zhì)的有效去除。由表4可知，隨著甘油加入量的增加，結(jié)晶產(chǎn)品中雜質(zhì)含量越來越低，但達(dá)到一定程度后不再降低。因此，選擇甘油加入量為1.0‰，所得兩性霉素B純度大于98.5%，總收率大于77%。兩性霉素B精粉HPLC圖譜見圖3。

3 結(jié)論

采用色譜三號(hào)樹脂為填料，加載兩性霉素B粗品DMF-乙醇溶液于層析柱上，層析柱高徑比為7，過柱速度為5 mL·min-1，上樣量為1.5 g·(100 g填料)-1，

圖3 兩性霉素B精粉的HPLC圖譜Fig.3 HPLC spectrum of Amphotericin B refined powder

所得層析液加入1.0‰甘油，并調(diào)溶液pH值5.3～5.6，結(jié)晶，過濾，乙醇、丙酮分別挖洗抽濾，干燥得到純度大于98.5%的兩性霉素B精粉，總收率大于77%。該分離純化工藝穩(wěn)定，流程簡(jiǎn)單，提高了產(chǎn)品收率，質(zhì)量穩(wěn)定可控，適于工業(yè)化生產(chǎn)。