炮仗花類胡蘿卜素含量測(cè)定及抗炎活性研究

林啟凰，林聰煒，張 娜，紀(jì)美茹，陳仲巍，張 崗*

(1.廈門醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，福建 廈門 361000；2.廈門弘愛醫(yī)院，福建 廈門 361000)

炮仗花(Pyrostegiavenusta(Ker Gawl.))，別名黃鱔藤，為紫葳科炮仗藤屬藤本植物，廣泛分布于我國(guó)的華南和西南地區(qū)[1]，常用于庭院垂直綠化[2]。在民間，炮仗花的葉子和花被用于治療白斑病[3]，并用于防治支氣管炎、肺結(jié)核、咳嗽、流感等呼吸系統(tǒng)感染[4-5]。研究[6-7]證明，炮仗花提取物具有抗氧化、抗菌和愈合傷口等活性?；瘜W(xué)成分研究表明，炮仗花橙色素主要組成為胡蘿卜素、葉黃素等類胡蘿卜素類物質(zhì)[8]，是其花瓣呈橙紅色的主要色素。

類胡蘿卜素是由8個(gè)異戊二烯單元構(gòu)成的長(zhǎng)鏈萜烯化合物[9]，是公認(rèn)的安全性食品補(bǔ)充劑和食用色素，對(duì)癌癥、心血管病等疾病具有干預(yù)治療作用[10]。由于長(zhǎng)共軛體系的存在，大多數(shù)類胡蘿卜素的紫外光譜在400～500 nm間有最大吸收峰[11]；而在此波長(zhǎng)范圍內(nèi)，植物中的其它成分幾乎無吸收峰。因此，可以采用分光光度法測(cè)定植物中類胡蘿卜素含量[12]。目前，國(guó)內(nèi)未有炮仗花類胡蘿卜素含量測(cè)定的相關(guān)報(bào)道。鑒于此，作者采用超聲波輔助法提取炮仗花類胡蘿卜素，采用分光光度法測(cè)定其含量，通過紅外光譜對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，并利用脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞(RAW264.7)炎癥模型評(píng)價(jià)其抗炎活性，以期對(duì)炮仗花色素的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

炮仗花，于2019年3月采自福建省廈門市，經(jīng)鑒定為紫葳科炮仗藤屬植物炮仗花(Pyrostegiavenusta(Ker Gawl.))的花。

無水乙醇(分析純)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；2,6-二叔丁基-4-甲氧基苯酚(BHT)(分析純)，西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司；β-胡蘿卜素對(duì)照品(批號(hào)：H-02-180914)，成都瑞芬思生物科技有限公司。

Alpha型紅外分光光度計(jì)，德國(guó)布魯克；Shimadzu UV-1800型紫外分光光度計(jì)，日本島津公司；PA225D型十萬分之一分析天平,賽多利斯；N-2100X型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，日本Eyela公司；DHG-9140型鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒有限公司；KQ-300DE型超聲波清洗儀，昆山超聲儀器有限公司；Tecan Infinite M1000 PRO型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀,Tecan公司。

1.2 方法

1.2.1 對(duì)照溶液的配制

精密稱取β-胡蘿卜素對(duì)照品4.98 mg，用無水乙醇(含0.01%BHT，下同)溶解并定容至50 mL棕色容量瓶中，配制成母液。精密移取母液5 mL，用無水乙醇稀釋并定容至50 mL容量瓶中，作為儲(chǔ)備液，備用。

1.2.2 供試溶液的制備

60 ℃烘干的炮仗花用粉碎機(jī)粉碎，過4號(hào)篩，備用。精密稱取炮仗花粉末10 mg，置于100 mL棕色具塞三角燒瓶中，精密加入無水乙醇20 mL，稱重，超聲波(功率500 W)輔助提取20 min，放冷，再稱重，用無水乙醇補(bǔ)足，過濾，取續(xù)濾液用于分析。

1.2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

分別取β-胡蘿卜素對(duì)照品和炮仗花提取物適量，加入適量無水乙醇，超聲提取，過濾，濾液進(jìn)行全波長(zhǎng)紫外可見吸收光譜掃描，掃描范圍200～600 nm。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精密量取β-胡蘿卜素對(duì)照儲(chǔ)備液1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL、3.5 mL，置于10 mL 棕色容量瓶中，用無水乙醇定容，搖勻；以無水乙醇為空白溶液，于450 nm處測(cè)定吸光度。以β-胡蘿卜素濃度(x,μg·mL-1) 為橫坐標(biāo)、吸光度(y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 炮仗花類胡蘿卜素的結(jié)構(gòu)表征

取炮仗花粉末適量，置于100 mL棕色具塞三角燒瓶中，加入適量無水乙醇超聲波(功率500 W)輔助提取20 min，過濾；濾液低溫蒸干，加入適量水混懸，用正己烷萃取3次，合并萃取液；無水Na2SO4干燥后，低溫蒸干，得紅棕色炮仗花提取物。檢測(cè)前將提取物置于干燥器內(nèi)干燥過夜，紅外燈下以KBr壓片，測(cè)定紅外光譜。

1.2.6 抗炎活性評(píng)價(jià)

1.2.6.1 炮仗花提取物的制備

精密稱取炮仗花粉末0.501 2 g，加入20 mL無水乙醇，超聲波輔助提取20 min，過濾，濾液濃縮蒸干成浸膏，備用。

1.2.6.2 炮仗花提取物中類胡蘿卜素含量的測(cè)定

精密稱取炮仗花提取物15.51 mg，用無水乙醇溶解并定容至100 mL容量瓶中，于450 nm處測(cè)定其吸光度。

1.2.6.3 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)[13]

向含有一定濃度的小牛血清、青霉素以及鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)入事先復(fù)蘇的RAW264.7細(xì)胞，在CO2培養(yǎng)箱中37 ℃下培養(yǎng)細(xì)胞至對(duì)數(shù)期，以EDTA-2Na和胰酶作為消化液進(jìn)行消化。將以上處理好的細(xì)胞懸浮液加入不同濃度的炮仗花提取物溶液，繼續(xù)培養(yǎng)過夜，加入MTT溶液及DMSO，搖床振蕩。采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于450 nm處測(cè)定吸光度，并根據(jù)下式計(jì)算細(xì)胞存活率：

細(xì)胞存活率=A樣品/A空白×100%

1.2.6.4 NO抑制實(shí)驗(yàn)

采用Griess法[14]檢測(cè)炮仗花提取物的NO含量。按1.2.6.3方法培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞，每孔加入不同濃度的炮仗花提取物溶液孵育1 h，加入1 μg·mL-1LPS溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞上清液，并按照NO試劑盒操作說明測(cè)定NO含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

β-胡蘿卜素對(duì)照品和炮仗花提取物的紫外可見吸收光譜見圖1。

從圖1可以看出，β-胡蘿卜素對(duì)照品和炮仗花提取物均在450 nm處有最大吸收。因此，選擇450 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 β-胡蘿卜素對(duì)照品(a)和炮仗花提取物(b)的紫外可見吸收光譜Fig.1 UV-Vis absorption spectra of β-carotene reference substance(a) and Pyrostegia venusta extract(b)

2.2 炮仗花類胡蘿卜素的結(jié)構(gòu)表征

炮仗花提取物的紅外光譜見圖2。

從圖2可以看出，炮仗花提取物在3 375 cm-1附近顯示了強(qiáng)且寬的吸收帶，為典型的-OH伸縮振動(dòng)信號(hào)；3 010 cm-1處為烯烴=CH伸縮振動(dòng)峰；1 641 cm-1、1 631 cm-1、1 612 cm-1處為共軛多烯中C=C伸縮振動(dòng)峰；1 061 cm-1處為=CH面外彎曲振動(dòng)峰，說明分子中含有共軛多烯結(jié)構(gòu)；2 925 cm-1、2 854 cm-1處為-CH3、-CH2伸縮振動(dòng)峰；1 462 cm-1、1 444 cm-1處為-CH3、-CH2面內(nèi)彎曲振動(dòng)信號(hào)。以上信息與類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)相符[15-16]。此外，炮仗花提取物在1 738 cm-1、1 727 cm-1附近顯示了C=O特征伸縮振動(dòng)吸收峰，在1 260 cm-1、1 154 cm-1附近顯示了C-O伸縮振動(dòng)吸收峰，吸收強(qiáng)度均為中等，說明炮仗花提取物中部分化合物含有羰基或酯鍵官能團(tuán)，炮仗花中類胡蘿卜素極性較大。

2.3 提取方法的優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑

精密稱取炮仗花粉末10 mg，共7份，分別加入無水乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯、石油醚(60～90 ℃)、丙酮和正己烷各20 mL，超聲輔助提取30 min，450 nm處測(cè)定其吸光度，考察提取溶劑對(duì)炮仗花類胡蘿卜素提取率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 提取溶劑對(duì)提取率的影響Fig.3 Effect of extraction solvent on extraction rate

從圖3可以看出，以無水乙醇為提取溶劑時(shí)，吸光度最大。故確定提取溶劑為無水乙醇。

2.3.2 提取溶劑用量

精密稱取炮仗花粉末10 mg，共6份，分別加入無水乙醇5 mL、10 mL、15 mL、20 mL、25 mL、30 mL，超聲輔助提取30 min，450 nm處測(cè)定其吸光度,考察提取溶劑用量對(duì)炮仗花類胡蘿卜素提取率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 提取溶劑用量對(duì)提取率的影響Fig.4 Effect of extraction solvent dosage on extraction rate

從圖4可以看出，隨著提取溶劑用量的增加，類胡蘿卜素提取率逐漸升高，當(dāng)無水乙醇用量為20 mL時(shí)，提取率最高；之后隨著提取溶劑用量繼續(xù)增加，提取率趨于穩(wěn)定。故確定無水乙醇用量為20 mL。

2.3.3 提取時(shí)間

精密稱取炮仗花粉末10 mg，共9份，加入等量無水乙醇溶液，超聲輔助提取時(shí)間分別為5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、40 min、50 min、60 min，450 nm處測(cè)定其吸光度，考察提取時(shí)間對(duì)炮仗花類胡蘿卜素提取率的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響Fig.5 Effect of extraction time on extraction rate

從圖5可以看出，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，類胡蘿卜素提取率先升高后降低，20 min時(shí)達(dá)到最高。故確定提取時(shí)間為20 min。

2.4 β-胡蘿卜素的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖6)

根據(jù)β-胡蘿卜素對(duì)照品濃度(x，μg·mL-1)和相應(yīng)的吸光度(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得β-胡蘿卜素線性回歸方程為y=0.1461x-0.0207(R2=0.9999)，β-胡蘿卜素濃度在0.996～3.486 μg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度具有良好線性關(guān)系。

圖6 β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve of β-carotene

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度實(shí)驗(yàn)

精密移取同一β-胡蘿卜素對(duì)照溶液6份，于450 nm處測(cè)定吸光度。測(cè)得6份對(duì)照溶液吸光度的RSD為0.19%，表明紫外分光光度計(jì)的精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密稱取炮仗花粉末約10 mg，制備供試溶液，分別在0 min、5 min、10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min于450 nm處測(cè)定吸光度。測(cè)得60 min內(nèi)RSD 為0.59%，表明炮仗花類胡蘿卜素在60 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密稱取炮仗花粉末6份，每份約10 mg，制備供試溶液，于450 nm處測(cè)定吸光度。測(cè)得吸光度的RSD為0.74%(n=6)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.4 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取炮仗花粉末9份，每份約10 mg，分別置于100 mL 棕色具塞三角燒瓶中，分為3組，每份樣品中精密加入一定量β-胡蘿卜素對(duì)照品，制備供試品溶液，在450 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

從表1可以看出，平均加樣回收率為100.08%，RSD為1.46%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.6 含量測(cè)定

精密稱定炮仗花粉末約10 mg，共3 份，制備供試溶液，450 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算炮仗花類胡蘿卜素含量，結(jié)果見表 2。

表1 加樣回收率結(jié)果(n=9)

Tab.1 Results of adding standard recovery(n=9)

表2 含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

Tab.2 Determination results of content

從表2可以看出，炮仗花類胡蘿卜素平均含量為31.77 μg·mg-1，RSD為0.66%。

2.7 抗炎活性研究

炮仗花類胡蘿卜素的抗炎活性見圖7。

從圖7a可以看出，炮仗花提取物在10～200 μg·mL-1范圍內(nèi)顯示出弱細(xì)胞毒性，濃度為50 μg·mL-1時(shí)，細(xì)胞存活率最低；之后隨著濃度增加，細(xì)胞存活率略微升高。從圖7 b可以看出，LPS組NO含量遠(yuǎn)高于空白對(duì)照組(P<0.001)，提示抗炎模型構(gòu)建成功；用炮仗花提取物預(yù)處理RAW264.7巨噬細(xì)胞后，LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生NO受到抑制，其抑制能力呈劑量依賴性。以上結(jié)果表明，炮仗花提取物具有一定的抗炎活性，有關(guān)其抗炎機(jī)理及活性成分組成，有待于進(jìn)一步研究。

**:P<0.01,與LPS處理組比較;***:P<0.001,與LPS處理組比較

2.8 討論

2.8.1 影響因素

類胡蘿卜素易氧化降解，并光、熱、酸敏感，容易變質(zhì)。在實(shí)驗(yàn)過程中，提取溶劑中加入少量BHT可延緩類胡蘿卜素氧化降解。同時(shí)，應(yīng)避光、低溫操作，以減少實(shí)驗(yàn)誤差。

2.8.2 類胡蘿卜素含量測(cè)定

含量測(cè)定結(jié)果顯示，炮仗花類胡蘿卜素含量為31.77 μg·mg-1，說明炮仗花中含有一定量的類胡蘿卜素，可以作為天然類胡蘿卜素資源加以開發(fā)利用。另外分光光度法測(cè)定炮仗花類胡蘿卜素含量操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，可以作為評(píng)價(jià)炮仗花橙色素質(zhì)量的檢測(cè)方法。

2.8.2 炮仗花干燥溫度的考察

考察了冷凍干燥和烘干兩種方式，以及烘干溫度(40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃)對(duì)炮仗花中類胡蘿卜素含量的影響。結(jié)果表明，60 ℃烘干得到的炮仗花樣品測(cè)得的類胡蘿卜素含量最高。冷凍干燥法所得樣品為鮮艷的橙黃色，但在保存條件下會(huì)慢慢退去，推測(cè)可能發(fā)生酶解反應(yīng)，使得其內(nèi)色素發(fā)生降解。

3 結(jié)論

采用超聲波輔助法提取炮仗花類胡蘿卜素，采用分光光度法測(cè)定炮仗花類胡蘿卜素含量，并通過紅外光譜對(duì)炮仗花類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。利用脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞(RAW264.7)炎癥模型評(píng)價(jià)提取物抗炎活性。結(jié)果表明，最佳提取方法為：以20 mL無水乙醇為提取溶劑，超聲波輔助提取20 min。β-胡蘿卜素濃度(x)在0.996～3.486 μg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度(y)線性關(guān)系良好，其線性回歸方程為y=0.1461x-0.0207，R2=0.9999(n=6)，精密度RSD為0.19%，穩(wěn)定性RSD為0.59%，重復(fù)性RSD為0.74%，平均加樣回收率為100.08%，RSD為1.46%(n=9)，測(cè)得炮仗花類胡蘿卜素含量為31.77 μg·mg-1?？寡谆钚詫?shí)驗(yàn)表明，炮仗花類胡蘿卜素在高濃度時(shí)呈一定細(xì)胞毒性，且濃度依賴性抑制NO生成，具有一定的抗炎活性。