杜仲內(nèi)生真菌SX2018-06發(fā)酵產(chǎn)松酯醇二葡萄糖苷工藝條件的優(yōu)化

程 浩，王曉麗，董小婧，周志文

(江蘇省腫瘤醫(yī)院，江蘇省腫瘤防治研究所，南京醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，江蘇 南京 210009)

杜仲(EucommiaulmoidesOliv.)為杜仲科杜仲屬僅存的孑遺植物，是我國(guó)國(guó)家二類(lèi)保護(hù)植物[1]。杜仲是傳統(tǒng)中藥材，《神農(nóng)本草經(jīng)》記載“主治腰膝痛，補(bǔ)中，益精氣，堅(jiān)筋骨，除陰下癢濕，小便余瀝。久服，輕身耐老。”[2]杜仲中含有幾十種藥理活性物質(zhì)，主要有木質(zhì)素類(lèi)、苯丙素類(lèi)、環(huán)烯醚萜類(lèi)以及其它萜類(lèi)化合物等[3-5]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，杜仲在降低血壓方面有很好的療效，進(jìn)一步研究證實(shí)杜仲中木脂素類(lèi)化合物松脂醇二葡萄糖苷(PDG)是降壓的主要成分[6-8]。杜仲既可以使高血壓病人血壓降低又可以使低血壓病人血壓上升，并且調(diào)節(jié)血壓持久無(wú)任何其它不利影響[9]。杜仲資源珍貴稀少，生長(zhǎng)緩慢，僅僅依靠提取手段很難滿足日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需要[10-11]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，寄生于植物體內(nèi)的內(nèi)生真菌和寄主植物協(xié)同進(jìn)化，內(nèi)生真菌可以在生命活動(dòng)過(guò)程中合成某些藥用植物所具有的相同或相似的物質(zhì)[12-13]。本課題組從徐州市選取10年樹(shù)齡的杜仲樹(shù)樹(shù)皮，分離出能產(chǎn)生PDG的內(nèi)生真菌8株，通過(guò)篩選獲得一株產(chǎn)量較高的擬莖點(diǎn)霉屬內(nèi)生真菌SX2018-06，PDG產(chǎn)量可達(dá)18.63 mg·L-1。

作者以擬莖點(diǎn)霉屬SX2018-06為研究對(duì)象，進(jìn)行發(fā)酵工藝條件優(yōu)化，以提高PDG產(chǎn)量，為工業(yè)化生產(chǎn)PDG提供理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌種、試劑與培養(yǎng)基

1.1.1 菌種

擬莖點(diǎn)霉屬(Phomopsissp.)SX2018-06，實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

1.1.2 試劑

可溶性淀粉，天津鼎盛鑫化工有限公司；玉米漿，安琪酵母股份有限公司；葡萄糖、麥芽糖、乳糖，分析純，上海埃彼化學(xué)有限公司；酵母膏、蛋白胨，分析純，青島青藥生物工程有限公司；MgSO4·7H2O、NaNO3、(NH4)2SO4、K2HPO4、KCl、CuSO4、NaOH、FeSO4，分析純，廣東予能實(shí)驗(yàn)室設(shè)備科技有限公司；瓊脂粉，分析純，北京天馬華信化工有限公司；消泡劑，食品級(jí)，上海廣銳生物科技有限公司；馬鈴薯，市售。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g·L-1)[14]：馬鈴薯200.0，葡萄糖20.0，瓊脂粉18.0，pH值 7.0～7.2。121 ℃高壓滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基(g·L-1)[15]：NaNO33.0，KH2PO41.0，MgSO4·7H2O 0.5，KCl 0.5，F(xiàn)eSO40.01，蔗糖 30.0，消泡劑0.1，pH值 7.0～7.2。121 ℃高壓滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1)[16]：可溶性淀粉50.0，玉米漿10.0，NaNO32.0，K2HPO40.6，KCl 0.5，MgSO4·7H2O 0.4，消泡劑0.1，pH 值7.0～7.2。121 ℃高壓滅菌20 min。

1.2 儀器

BBS-DDC型臺(tái)式超凈工作臺(tái)，山東博科科學(xué)儀器有限公司；SPX-80A型生化培養(yǎng)箱，上海恒躍醫(yī)療器械有限公司；TS-100C型恒溫?fù)u床，上海善志儀器設(shè)備有限公司；BLBIO-20SJ型機(jī)械攪拌通風(fēng)式發(fā)酵罐，上海百侖生物科技有限公司；TG臺(tái)式高速離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；LDZX-50KBS型高壓滅菌鍋，廈門(mén)森泰儀器儀表有限公司；Agilent1260型高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent Technologies公司。

1.3 方法

1.3.1 種子液的制備

將保藏的SX2018-06菌種轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基，30 ℃活化培養(yǎng)168 h。取2 cm3的SX2018-06生長(zhǎng)旺盛的菌塊，接種到250 mL含有100 mL種子培養(yǎng)基的三角燒瓶中，28 ℃、200 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)70 h，即為種子液。

1.3.2 單因素實(shí)驗(yàn)

取種子液接入發(fā)酵罐，接種量為10%，設(shè)定初始pH值為6.0、發(fā)酵溫度為28 ℃、通氣量為5.0 L·min-1，連續(xù)發(fā)酵190 h。考察發(fā)酵溫度、初始pH值、通氣量、接種量等因素對(duì)SX2018-06產(chǎn)PDG的影響。

1.3.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以PDG產(chǎn)量(Y)為響應(yīng)值，以發(fā)酵溫度(X1)、初始pH值(X2)、通氣量(X3)、接種量(X4)為考察因子，采用Box-Behnken進(jìn)行4因素3水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[17-19]，SX2018-06產(chǎn)PDG發(fā)酵條件優(yōu)化Box-Behnken實(shí)驗(yàn)的因子與水平見(jiàn)表1。

表1 SX2018-06產(chǎn)PDG發(fā)酵條件優(yōu)化Box-Behnken實(shí)驗(yàn)的因子與水平

Tab.1 Factors and levels of Box-Behnken experiment for optimization of fermentation conditions of PDG produced by SX2018-06

1.3.4 PDG含量的測(cè)定

PDG含量測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[20-22]。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)[23-24]進(jìn)行線性回歸和方差分析，通過(guò)SPSS軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 發(fā)酵溫度對(duì)SX2018-06產(chǎn)PDG的影響(圖1)

圖1 發(fā)酵溫度對(duì)SX2018-06產(chǎn)PDG的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on production of PDG by SX2018-06

從圖1可看出，PDG產(chǎn)量隨發(fā)酵溫度的升高，呈現(xiàn)出先增加后下降的倒“U”型形狀；在溫度為28 ℃時(shí)，PDG產(chǎn)量最大，達(dá)到42.24 mg·L-1。分析原因可能是，SX2018-06通過(guò)代謝合成PDG過(guò)程需要一系列酶的催化，酶催化活性受溫度調(diào)控。只有溫度達(dá)到某一值時(shí)，酶的催化活性最大，低于或高于這個(gè)值催化活性都會(huì)降低。所以，SX2018-06產(chǎn)PDG的最適發(fā)酵溫度為28 ℃。

2.1.2 初始pH值對(duì)SX2018-06產(chǎn)PDG的影響(圖2)

圖2 初始pH值對(duì)SX2018-06產(chǎn)PDG的影響Fig.2 Effect of initial pH value on production of PDG by SX2018-06

由圖2可看出，初始pH值從5.0升高到7.5的過(guò)程中，PDG產(chǎn)量逐漸增加，當(dāng)pH值達(dá)到6.5時(shí)，PDG產(chǎn)量達(dá)到最高；當(dāng)pH值大于6.5之后，PDG產(chǎn)量逐漸下降。分析原因可能是，SX2018-06合成PDG的酶系在初始pH值為6.5時(shí)，有最大的催化活性。所以，SX2018-06產(chǎn)PDG最適初始pH值為6.5。

2.1.3 通氣量對(duì)SX2018-06產(chǎn)PDG的影響(圖3)

由圖3可看出，通氣量從3.0 L·min-1增加到8.0 L·min-1的過(guò)程中，PDG產(chǎn)量呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)；當(dāng)通氣量為7.0 L·min-1時(shí)，PDG產(chǎn)量最大，達(dá)到42.71 mg·L-1。分析原因可能是，SX2018-06是好氧真菌，在代謝過(guò)程中代謝的速率會(huì)隨著環(huán)境中氧氣的含量變化而變化。所以，SX2018-06產(chǎn)PDG最適通氣量為7.0 L·min-1。

圖3 通氣量對(duì)SX2018-06產(chǎn)PDG的影響Fig.3 Effect of ventilation amount on production of PDG by SX2018-06

2.1.4 接種量對(duì)SX2018-06產(chǎn)PDG的影響(圖4)

圖4 接種量對(duì)SX2018-06產(chǎn)PDG的影響Fig.4 Effect of inoculation rate on production of PDG by SX2018-06

從圖4可看出，當(dāng)接種量從8%增加到13%的過(guò)程中，PDG產(chǎn)量呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)；當(dāng)接種量為12%時(shí)，PDG產(chǎn)量最大，達(dá)到43.15 mg·L-1。分析原因可能是，接種量小時(shí)，達(dá)不到發(fā)酵的菌濃，PDG產(chǎn)量較?。坏钱?dāng)接種量過(guò)大時(shí)，發(fā)酵罐內(nèi)的菌濃過(guò)大，會(huì)造成菌種之間對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和發(fā)酵條件的過(guò)度競(jìng)爭(zhēng)，從而降低PDG產(chǎn)量。所以，SX2018-06產(chǎn)PDG最適接種量為12%。

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 回歸模型的建立

SX2018-06產(chǎn)PDG發(fā)酵條件優(yōu)化Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

用統(tǒng)計(jì)軟件Design Expert 8.0.6對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，二次多項(xiàng)式回歸方程為：

表2 SX2018-06產(chǎn)PDG發(fā)酵條件優(yōu)化Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.2 Results of Box-Behnken experiment for optimization of fermentation conditions of PDG produced by SX2018-06

2.2.2 回歸模型的方差分析

SX2018-06產(chǎn)PDG發(fā)酵條件優(yōu)化回歸模型方差分析見(jiàn)表3。

表3 SX2018-06產(chǎn)PDG發(fā)酵條件優(yōu)化回歸模型方差分析

Tab.3 Variance analysis of regression model for optimization offermentation conditions of PDG produced by SX2018-06

注：*表示對(duì)結(jié)果影響顯著(P<0.05)；**表示對(duì)結(jié)果影響極顯著(P<0.01)。

由表3可知，模型極顯著(P<0.01)，失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05)，表明回歸模型的擬合度較好。

2.2.3 響應(yīng)面圖的分析

發(fā)酵溫度、初始pH值、通氣量和接種量4個(gè)影響因子兩兩交互作用對(duì)SX2018-06產(chǎn)PDG的影響的響應(yīng)面及等高線見(jiàn)圖5。

圖5 不同因子交互影響PDG產(chǎn)量的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface maps of PDG production influenced by different factors

從圖5可看出，A圖、B圖、C圖和F圖，響應(yīng)面圖形呈現(xiàn)出拋物面形狀，說(shuō)明4對(duì)交互因子(X1X2、X1X3、X1X4、X3X4)在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，響應(yīng)值均有極大值。等高線均呈現(xiàn)橢圓形，也說(shuō)明4對(duì)交互因子對(duì)結(jié)果影響顯著，與前面方差分析的結(jié)果是一致的。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

二次多項(xiàng)式回歸方程采用Design Expert 8.0.6軟件求解， SX2018-06產(chǎn)PDG最優(yōu)的發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度27.69 ℃、初始pH值5.85、通氣量6.26 L·min-1、接種量為12.32%，預(yù)測(cè)PDG產(chǎn)量為42.68 mg·L-1。根據(jù)方程的求解和實(shí)際發(fā)酵情況，確定優(yōu)化的發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度28.0 ℃、初始pH值6.0、通氣量6.5 L·min-1、接種量12.5%。根據(jù)優(yōu)化的發(fā)酵條件，連續(xù)做3個(gè)重復(fù)，平均PDG產(chǎn)量為43.28 mg·L-1，和預(yù)測(cè)值非常接近。所以，回歸模型和實(shí)際情況擬合度較好。PDG產(chǎn)量比優(yōu)化前提高了132.31%。

3 結(jié)論

對(duì)實(shí)驗(yàn)室篩選的產(chǎn)PDG的杜仲內(nèi)生真菌SX2018-06進(jìn)行發(fā)酵工藝條件優(yōu)化，通過(guò)相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到優(yōu)化的發(fā)酵工藝條件為：發(fā)酵溫度28.0 ℃、初始pH值6.0、通氣量6.5 L·min-1、接種量12.5%，在此優(yōu)化條件下，PDG產(chǎn)量達(dá)到43.28 mg·L-1，較優(yōu)化前提高了132.31%。本研究所構(gòu)模型可顯著提高杜仲內(nèi)生真菌SX2018-06發(fā)酵產(chǎn)PDG產(chǎn)量，為規(guī)?；a(chǎn)提供了理論和實(shí)踐的基礎(chǔ)。