可見(jiàn)分光光度法測(cè)定α-淀粉酶活力

張雪嬌，田 歡，劉春葉，尤 靜

(西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，陜西 西安 710021)

在人體的正常生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，淀粉是非常重要的供能物質(zhì)。α-淀粉酶是人體內(nèi)專一性分解淀粉糖苷鍵的一類生物活性酶。攝入人體的淀粉在淀粉酶的作用下水解成易于吸收的葡萄糖，葡萄糖進(jìn)入血液后再與氧氣作用產(chǎn)生熱量為人體的各個(gè)器官活動(dòng)提供能量，從而保證機(jī)體的正常運(yùn)行。探討準(zhǔn)確度高、靈敏度好的α-淀粉酶活力的測(cè)定方法，不但在臨床醫(yī)學(xué)的生理學(xué)研究中有重要的意義[1-2]，而且在生產(chǎn)實(shí)踐中也有一定的應(yīng)用價(jià)值[3-4]。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

碘化鉀、碘，AR，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；鹽酸，GR，開封東大化工(集團(tuán))有限公司；檸檬酸，AR，無(wú)錫第二制藥廠；磷酸氫二鈉，AR，成都新區(qū)木蘭鎮(zhèn)工業(yè)開發(fā)區(qū)；氯化銅，AR，北京東風(fēng)化學(xué)試劑有限公司；可溶性淀粉，AR，天津風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司；α-淀粉酶，AR，邢臺(tái)萬(wàn)達(dá)生物化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

UV-757型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海尤尼柯有限公司；ALC-210.4型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；AnkeTGL-16C型離心機(jī)，上海安亭儀器廠；PB-10型酸度計(jì)，德國(guó)Acculab公司；DZKW-6-9型電熱恒溫水浴鍋，北京永光明醫(yī)療廠。

1.2 溶液的配制

碘液：精密稱取1.002 1 g碘化鉀和0.401 4 g碘，用少量的蒸餾水完全溶解，定容至100 mL，搖勻，貯于棕色瓶中。實(shí)驗(yàn)前精確移取該溶液3.00 mL，再用蒸餾水稀釋至100 mL，貯于棕色瓶中，備用。

磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液(pH值6.5)：分別配制0.2 mol·L-1的磷酸氫二鈉溶液和0.1 mol·L-1的檸檬酸溶液，借助pH計(jì)配制不同pH值的緩沖溶液，備用。

酶解反應(yīng)終止液[8]：精密稱取氯化銅1.003 2 g，用蒸餾水定容至10 mL；量取37% 鹽酸9 mL，用蒸餾水稀釋至90 mL，將二者混合即為終止液，備用。

0.01 g·mL-1淀粉溶液：精密稱取1.000 9 g烘干之后的可溶性淀粉，先加一定量的緩沖溶液，加熱溶解至透明，冷卻后再用緩沖溶液定容至100 mL，常溫保存，備用。實(shí)驗(yàn)前根據(jù)濃度需要用緩沖溶液稀釋。

0.01 g·mL-1α-淀粉酶母液：精密稱取α-淀粉酶1.001 8 g，用緩沖溶液溶解后定容至100 mL，置于4 ℃冰箱保存，備用。實(shí)驗(yàn)前根據(jù)濃度需要用緩沖溶液稀釋。

1.3 方法

1.3.1 吸收波長(zhǎng)的確定

分別配制一定濃度的碘溶液、淀粉溶液和碘-淀粉絡(luò)合物溶液，分別以相應(yīng)試劑空白作參比，在400～800 nm區(qū)間進(jìn)行掃描，以確定碘-淀粉絡(luò)合物溶液的最大吸收波長(zhǎng)。

1.3.2 淀粉測(cè)定濃度的確定

在一系列比色管中分別加入5.00 mL不同濃度的淀粉溶液，置于37 ℃水浴中恒溫10 min，依次加入同溫度預(yù)熱的pH值6.5緩沖溶液及終止液各1.00 mL。搖勻后冷卻至室溫，分別取0.2 mL于試管中，再分別加入7 mL碘液，充分搖勻后立即在580 nm處測(cè)定吸光度，以確定淀粉的最佳濃度測(cè)定范圍。

1.3.3 α-淀粉酶活力的測(cè)定

樣品管：在一系列比色管中分別加入1.00 mL不同濃度的α-淀粉酶溶液；標(biāo)準(zhǔn)管：用1.00 mL的緩沖溶液代替酶液。將所有試管置于37 ℃水浴中恒溫2 min后，依次加入同溫度預(yù)熱的0.008 g·mL-1淀粉溶液5.00 mL，立即混勻。37 ℃反應(yīng)10 min后，立即加入1.00 mL終止液。搖勻后冷卻至室溫，分別取0.2 mL于試管中，再分別加入7 mL碘液，充分搖勻后立即在580 nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)相同濃度淀粉在加入不同量α-淀粉酶前后吸光度的變化測(cè)定α-淀粉酶活力。

1.3.4 方法學(xué)考察

2 結(jié)果與討論

2.1 吸收光譜及測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

碘溶液、淀粉溶液和碘-淀粉絡(luò)合物溶液的吸收光譜如圖1所示。

圖1 吸收光譜Fig.1 Absorption spectra

由圖1可以看出，在580 nm處碘溶液和淀粉溶液均無(wú)明顯吸收，而碘-淀粉絡(luò)合物溶液有一較強(qiáng)的吸收峰。說(shuō)明碘與淀粉所形成的絡(luò)合物在580 nm處產(chǎn)生了特征吸收。因此，選擇580 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.2 淀粉測(cè)定濃度的確定

2.2.1 淀粉濃度與吸光度的關(guān)系

根據(jù)Lambert-Beer定律，采用紫外可見(jiàn)分光光度法對(duì)物質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定時(shí)，吸光度應(yīng)控制在0.2～0.8之間[9]，一般不宜超過(guò)1.0，否則測(cè)定結(jié)果將會(huì)產(chǎn)生較大偏差。故而在本實(shí)驗(yàn)中，參照1.3.2項(xiàng)下方法，分別配制不同濃度的淀粉溶液，與過(guò)量的碘液充分顯色后測(cè)定其吸光度，結(jié)果如圖2所示。

圖2 淀粉濃度與吸光度的關(guān)系Fig.2 Relationship between concentration of starch and absorbance

由圖2可以看出，當(dāng)?shù)矸蹪舛仍?.001～0.008 g·mL-1時(shí)，淀粉與碘所形成的絡(luò)合物在580 nm處所產(chǎn)生的特征吸收與淀粉濃度呈正相關(guān)性。以淀粉濃度(c)為橫坐標(biāo)、吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A=129.49c+0.0097，R2=0.9962，線性關(guān)系良好。表明淀粉濃度在0.001～0.008 g·mL-1范圍內(nèi)，可以利用碘與淀粉的顯色反應(yīng)對(duì)淀粉含量進(jìn)行測(cè)定。

2.2.2 方法學(xué)考察

為確定2.2.1中方法的可靠性，分別對(duì)上述方法的穩(wěn)定性、精密度、重現(xiàn)性及加樣回收率進(jìn)行考察。結(jié)果表明，使用該方法測(cè)定淀粉含量，其結(jié)果在3 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，測(cè)定結(jié)果的重現(xiàn)性和精密度RSD值分別為0.3%和0.2%，加樣回收率在104.7%～114.5%之間，符合《中華人民共和國(guó)藥典》所規(guī)定的90%～120%范圍內(nèi)。說(shuō)明采用該法對(duì)淀粉含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果準(zhǔn)確，方法可靠。

2.3 α-淀粉酶活力的測(cè)定

2.3.1 酶活力的計(jì)算方法

以每分鐘降解1 mg淀粉所消耗的酶量定義為一個(gè)酶活力單位(U)。每毫克α-淀粉酶中所含有的酶活力單位數(shù)定義為比活力(U·mg-1)。

前期研究發(fā)現(xiàn)，淀粉與碘所形成的絡(luò)合物在580 nm處能夠產(chǎn)生特征吸收，并且在一定范圍內(nèi)，所測(cè)得的吸光度值與淀粉濃度呈良好的線性相關(guān)，故而可以利用可見(jiàn)分光光度法考察在其它條件相同時(shí)，對(duì)比添加α-淀粉酶和不添加α-淀粉酶時(shí)發(fā)生水解之后的淀粉剩余量，并根據(jù)該剩余量計(jì)算酶活力。

參照1.3.3項(xiàng)下的方法，設(shè)酶的質(zhì)量用me表示，樣品管中淀粉量和吸光度分別用mx和Ax表示，標(biāo)準(zhǔn)管中淀粉量和吸光度分別用ms和As表示，則有：

(1)

(2)

根據(jù)1.3.3項(xiàng)下方法，樣品管和標(biāo)準(zhǔn)管中淀粉量均為5 mL 0.8%的淀粉，即40 mg，則樣品管中淀粉降解量為(40-mx)mg，該樣品管內(nèi)的酶活力為：

(3)

(4)

2.3.2 酶活力的測(cè)定

參照1.3.3項(xiàng)下的方法進(jìn)行操作，計(jì)算酶活力和比活力，結(jié)果如表1所示。

表1 酶量與酶活力的關(guān)系

Tab.1 Relationship between enzyme amount and enzyme activity

試管編號(hào)酶加入量/mg吸光度酶活力/U比活力/(U·mg-1)標(biāo)準(zhǔn)管00.991900樣品管10.010.89040.41 40.9 樣品管20.020.78630.83 41.5 樣品管30.030.67951.26 42.0 樣品管40.040.57691.67 41.8 樣品管50.050.49112.02 40.4 樣品管60.060.38832.43 40.6 樣品管70.070.30652.76 39.5 樣品管80.080.21533.13 39.1

根據(jù)表中的數(shù)據(jù)，將酶濃度與酶活力進(jìn)行線性擬合，結(jié)果如圖3所示。

從圖3可以看出，當(dāng)α-淀粉酶濃度在0.001～0.008 mg·mL-1之間時(shí)，酶活力(y)與α-淀粉酶濃度(x)線性關(guān)系良好，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=375.75x+0.1208，R2=0.9939。表明α-淀粉酶濃度在0.001～0.008 mg·mL-1范圍內(nèi)，可以利用碘與淀粉的顯色反應(yīng)對(duì)酶活力進(jìn)行測(cè)定。

圖3 酶活力隨酶濃度的變化曲線Fig.3 The curve of enzyme activity with the change of enzyme concentration

2.3.3 方法學(xué)考察

為確定1.3.3中方法的可靠性，分別對(duì)上述方法的穩(wěn)定性、精密度、重現(xiàn)性進(jìn)行考察。結(jié)果表明，使用該方法測(cè)定α-淀粉酶活力在3 h以內(nèi)穩(wěn)定性良好，測(cè)定結(jié)果的重現(xiàn)性和精密度RSD值分別為3.8% 和2.6%。說(shuō)明采用該法在一定的濃度范圍內(nèi)可對(duì)α-淀粉酶活力進(jìn)行測(cè)定。

3 結(jié)論

該法操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件也比較容易控制，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，且重現(xiàn)性好。受可見(jiàn)分光光度法測(cè)定方法的限制，當(dāng)?shù)矸蹪舛容^大時(shí)可考慮稀釋后采用此方法進(jìn)行測(cè)定。