HPLC法測定木鱉子中對羥基苯甲酸含量

邢炎華，曲倩柔，高婉娜

(1.陜西國際商貿(mào)學院醫(yī)藥學院，陜西 咸陽 712046；2.陜西省中藥綠色制造技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 咸陽 712046)

木鱉子為葫蘆科木鱉Momordicacochinchinensis(Lour.) Spreng.的干燥成熟種子，味苦，微甘、涼，有毒，具有散結(jié)消腫和攻毒療瘡的功效，常用于治療瘡瘍腫毒、乳癰、瘰疬、痔漏、干癬和禿瘡等[1-2]。目前關(guān)于木鱉子的研究雖然較多，但與化學成分相關(guān)的報道較少。李曉波團隊[3]和巢志茂團隊[4]對木鱉子脂溶性部分進行了分離，得到部分物質(zhì)并對這些物質(zhì)進行了鑒定與確認，其中李曉波團隊從木鱉子脂溶性部分分離得到對羥基苯甲酸。作者參照文獻[5-7]，采用HPLC法對木鱉子中對羥基苯甲酸進行確認，并對其含量進行測定。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

木鱉子藥材(批號:150601)，購于陜西康盛堂藥業(yè)有限公司，經(jīng)陜西國際商貿(mào)學院醫(yī)藥學院中藥教研室鑒定為葫蘆科植物木鱉Momodicacochinchinensis(Lour.) Spreng.的干燥成熟種子。

甲醇，冰乙酸，石油醚(60～90 ℃)，對羥基苯甲酸(分析純)。

Waters e2695型高效液相色譜儀、Waters 2489型紫外檢測器，Waters；BT125D型分析天平，賽多利斯；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；KH5200DE型超聲清洗器，杭州法蘭特超聲波科技有限公司。

1.2 對羥基苯甲酸對照溶液的制備

精密稱取對羥基苯甲酸0.20 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，得20 μg·mL-1對羥基苯甲酸對照儲備溶液。精密量取上述溶液1 mL，置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，得2 μg·mL-1對羥基苯甲酸對照溶液。

1.3 樣品溶液的制備

取20 g木鱉子藥材(去殼)粗粉，置于卷好的濾紙筒中；將密封好的濾紙筒裝入索氏提取器中，用10倍量的石油醚(60～90 ℃)脫脂；脫脂后的藥材揮干石油醚，加入10倍量的甲醇回流1.5 h；回流液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收甲醇，剩余殘渣再用10 mL甲醇溶解，過濾；濾液置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，得樣品溶液。

1.4 色譜條件

Agela Venusil XBP C18保護柱及色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相:甲醇(A)-0.1%冰乙酸(B)，梯度洗脫：0～10 min，10%A；10～30 min，10%～30%A；30～31 min，70%A；31～40 min，70%～10%A；40～45 min，10%A；檢測波長254 nm；流速1 mL·min-1。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC圖譜

對羥基苯甲酸對照溶液和樣品溶液的HPLC圖譜如圖1所示。

圖1 對羥基苯甲酸對照溶液(a)和樣品溶液(b)的HPLC圖譜Fig.1 HPLC spectra of p-hydroxybenzoic acid control solution(a) and sampel solution(b)

2.2 分析方法的評價

2.2.1 方法適應性

取樣品溶液20 μL，按色譜條件進行分離。結(jié)果顯示，HPLC法能夠很好地分離樣品溶液中的對羥基苯甲酸，拖尾因子為0.967，分離度為1.75，理論塔板數(shù)為126 964。

2.2.2 線性關(guān)系考察

分別取對羥基苯甲酸對照溶液5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL，按色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標、對羥基苯甲酸質(zhì)量為橫坐標繪制標準曲線，進行線性回歸，得回歸方程為y=1000000x-81274，R2=0.9997。表明，對羥基苯甲酸質(zhì)量在0.100～0.485 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.2.3 精密度實驗

取對羥基苯甲酸對照溶液10 μL，按色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。測得峰面積的RSD為1.92%，表明儀器的精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性實驗

分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、24 h取樣品溶液20 μL，按色譜條件進樣測定。測得6個時間段對羥基苯甲酸含量的RSD為1.69%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性。

2.2.5 重復性實驗

取3份同一批的木鱉子藥材(去殼)粗粉分別制成樣品溶液，按色譜條件連續(xù)進樣2次，每次20 μL。測得對羥基苯甲酸含量的RSD為4.44%，表明該方法的重復性滿足要求。

2.2.6 加標回收率實驗

取3份同一批的木鱉子藥材(去殼)粗粉分別制成樣品溶液，各取600 μL置于1 mL容量瓶中，精密加入300 μL 2 μg·mL-1對羥基苯甲酸對照溶液，用甲醇定容至刻度，按色譜條件連續(xù)進樣2次，每次10 μL，計算加標回收率，結(jié)果見表1。

表1 加標回收率

Tab.1 Adding standard recovery

由表1可知，平均加標回收率為107.5%，RSD為2.25%，表明該方法回收率良好。

2.3 含量測定

取3份木鱉子藥材(去殼)粗粉分別制成樣品溶液，按色譜條件進樣測定，進樣量為20 μL。測得3份木鱉子藥材中對羥基苯甲酸含量分別為4.775 μg·g-1、5.200 μg·g-1、4.850 μg·g-1，平均含量為4.942 μg·g-1。

2.4 討論

對羥基苯甲酸是一種廣泛應用的有機化合物，是合成尼泊金類防腐劑的重要原料，在有機合成中具有重要地位。近年來，研究[8-9]發(fā)現(xiàn)對羥基苯甲酸具有降低植物根部細胞氧自由基活性的作用；Wang等[10]研究表明，對羥基苯甲酸能夠降低阿霉素治療乳腺癌的耐藥性；張丹等[11]研究表明，木鱉子提取物具有抗氧化活性。這些研究結(jié)果提示對羥基苯甲酸可能是木鱉子提取物抗氧化作用的潛在物質(zhì)之一；在木鱉子抗腫瘤方面，對羥基苯甲酸也可能有潛在的間接作用。

3 結(jié)論

采用HPLC法測定木鱉子中對羥基苯甲酸含量。色譜條件為：Agela Venusil XBP C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，甲醇-0.1%乙酸為流動相進行梯度洗脫，檢測波長254 nm，流速 1 mL·min-1。結(jié)果表明，木鱉子中對羥基苯甲酸分離良好，分離度為1.75，理論塔板數(shù)為126 964；對羥基苯甲酸質(zhì)量(x)在0.100～0.485 μg之間與峰面積(y)線性關(guān)系良好，線性方程為y=1000000x-81274(R2=0.9997)；平均加標回收率為107.5%；木鱉子藥材中對羥基苯甲酸含量為4.942 μg·g-1。木鱉子中對羥基苯甲酸的確認豐富了木鱉子中已知的化學成分，為后續(xù)的物質(zhì)基礎研究提供了一定的基礎。