HPLC測定血復生片中黃芪甲苷的含量

張岑玥，王國香，全姬善*

（1.延邊大學，延吉133000；2.吉林京輝藥業(yè)股份有限公司，通化134000））

血復生片由黃芪、當歸、熟地黃、白芍等十六味藥材加工而成，方中除山藥和茯苓為生粉入藥外，其余幾味為提取后入藥[1]。衛(wèi)生部標準無含量測定[2]，國家食品藥品監(jiān)督管理總局國家藥品標準WS3-B-2688-97-3，采用薄層色譜掃描法[3]測定黃芪甲苷的含量，該方法操作繁瑣，重復性差，準確度不好。本次采用HPLC法-蒸發(fā)光散射檢測血復生片中黃芪甲苷的含量，經(jīng)方法學考察，方法簡單快速可行、準確可靠、重現(xiàn)性好。

1 儀器與試劑

Waters Acquity Arc高效液相色譜儀；Alltech ES2000蒸發(fā)光散射檢測器；Sartorius CP225D電子天平；Sartorius BSA224S-CW電子天平；甲醇（色譜純，天津市康科德科技有限公司）；乙腈 （色譜純，美國TEDIA公司）；重蒸水；其它試劑為分析純；黃芪甲苷對照品（批號：110781-201717，純度96.9%，中國食品藥品檢定研究院）；血復生片樣品（吉林京輝藥業(yè)股份有限公司20190101,20190102,20190103）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性實驗

色譜柱 ：Waters色譜柱 SunFire C18（4.6×250mm 5μm）；流動相：以乙腈-水（32:68）為流動相；用蒸發(fā)光散射檢測器檢測；流速：1.0ml·min-1；漂移管溫度：105℃，氣體流速：3.0L·min-1；柱溫：30℃；對照品進樣量為 3μL、10μL， 樣品進樣量為20μL； 分析時間：15分鐘，理論板數(shù)按黃芪甲苷峰計算應不低于4000。

2.2 對照品溶液的制備

取黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，加80%甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取本品30片，除去包衣，精密稱定，研細，取約3g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入含4%濃氨試液的80%甲醇溶液 （取濃氨試液4ml，加80%甲醇至100ml，搖勻）50ml，密塞，稱定重量，加熱回流 1 小時，放冷，再稱定重量，用含4%濃氨試液的80%甲醇溶液補足減失的重量，搖勻，離心（5000轉）5分鐘，取上清液，精密量取25ml，蒸干，殘渣用80%甲醇溶解，轉移至10ml量瓶中，加80%甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.4 測定法

分別精密吸取對照品溶液3μl、10μl，供試品溶液20μl，注入液相色譜儀，測定，以外標兩點法對數(shù)方程計算，即得。

2.5 方法學考察

2.5.1 專屬性實驗

分別按工藝方法制備缺黃芪的陰性供試品，并按供試品制備方法提取，制成陰性供試品溶液。精密吸取對照品溶液，供試品溶液及陰性供試品溶液各20ul，分別注入液相色譜儀，繪制色譜圖。從圖上可見，在與對照品色譜峰相應的位置上，供試品溶液具有相同保留時間的色譜峰，而陰性液在此峰處無干擾。 詳見下圖 1、2、3。

圖1 血復生片陰性樣色譜圖

圖2 血復生片對照品色譜圖

圖3 血復生片供試品色譜圖

2.5.2 線性關系的考察

精密稱取黃芪甲苷對照品（110781-201717，純度為96.9%）13.87mg，置25mL量瓶中，加80%甲醇稀釋至刻度，作為對照品溶液。精密吸取對照品溶液1、3、5、10、20、30μL注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定峰面積值。以進樣量的對數(shù)為橫座標（X），色譜峰面積的對數(shù)為縱座標（Y），繪制標準曲線，得回歸方程y=1.5916 x+5.3686，r=0.9996。測定結果表明，進樣量在0.5376～16.1280μg范圍內線性關系良好，結果見表5。

表5 線性范圍考察實驗結果

2.5.3 精密度實驗

取批號20190101的供試品，按供試品溶液制備方法實驗，精密吸取供試品溶液20μl，注入液相色譜儀中，連續(xù)進樣6次，測定色譜峰面積，結果見表6，結果表明精密度良好。

表6 精密度實驗結果

2.5.4 穩(wěn)定性實驗

取批號20190101的供試品，按供試品溶液制備方法實驗，分別于配制后 0，2，4，12，13 小時，依法測定,結果表明,供試品溶液在13小時內穩(wěn)定，結果見表7。

表7 穩(wěn)定性實驗結果

2.5.5 重復性實驗

取批號20190101的樣品，按供試品溶液制備方法實驗，取約3g，精密稱定，共取6份,按含量測定方法操作，注入液相色譜儀中，測定色譜峰面積，計算含量，結果見表8，表明該方法重復性良好。

表8 重復性實驗結果

2.5.6 加樣回收率實驗

采用加樣回收法。精密稱取已知準確含量（0.5845mg/g）的同一批樣品(批號 201901701)6 份，各1.5g，分別精密加入對照品溶液各2mL（0.3901mg/ml），按照供試品溶液制備的方法操作，測定加標樣品中黃芪甲苷的含量，計算回收率，結果見表9。

表9 回收率實驗結果

2.5.7 樣品含量測定

按正文【含量測定】項下方法操作，制備供試品溶液，測定3批血復生片的含量，結果見表10。

表10 含量測定結果（n=3）

3 討論

3.1 流動相比例的考察

參照《中國藥典》2015年版一部黃芪【含量測定】項下以乙腈-水為流動相，考察了乙腈-水（32∶68）[1]，乙腈-水（35∶65）兩種流動相的比例，結果供試品在乙腈-水（35∶65）時分析時間短，分離良好，因此選擇乙腈-水（35∶65）為測定用流動相。

3.2 色譜柱的考察

實驗中考察了不同品牌的色譜柱對樣品分離的影響，結果顯示不同品牌的色譜柱均能夠有效分離。

3.3 供試品提取方法的考察

分別采用超聲處理40分鐘、60分鐘，回流提取40分鐘、60分鐘，實驗結果表明加熱回流比超聲處理提取率高，回流1小時已經(jīng)基本提取完全，因此提取方法確定為回流提取1小時。

3.4 供試品提取溶劑的考察

采用4%濃氨試液的50%甲醇溶液、4%濃氨試液的80%甲醇溶液、4%濃氨試液的甲醇各50ml，分別回流提取1小時。結果80%甲醇溶液提取率最高，甲醇在溶解殘渣時比較困難，因此選擇80%甲醇為提取用溶劑。

3.5 供試品取樣量的考察

取供試品四份，分別為 2，3，4，5g 進行實驗，結果表明2g樣品與3g樣品提取較完全，為減少稱量和測量誤差，確定取樣量選擇3g。

3.6 供試品提取堿性條件的影響考察

取供試品三份，分別精密加入2%、4%、8%濃氨試液的80%甲醇溶液各50ml，進行實驗，結果考察的氨水濃度對結果基本沒有影響，考慮濃氨的揮發(fā)性為保證測試效果，最終選定4%濃氨試液。