黃瓜耐低氮相關(guān)基因的克隆及表達(dá)分析

薛存寶+范蓮雪+張鉛+王悅+郭冬雪++秦智偉++武濤

摘要：從黃瓜葉片中分離獲得1個(gè)丙二烯氧化物環(huán)化酶基因，命名為[WTBX][STBX]CsAOC3[WTBZ][STBZ]。該基因cDNA全長(zhǎng)為753 bp，編碼250個(gè)氨基酸，與甜瓜的丙二烯氧化物環(huán)化酶（AOC）序列同源性最高。通過(guò)熒光定量PCR（qRT-PCR）分析發(fā)現(xiàn)，[WTBX][STBX]CsAOC3[WTBZ][STBZ]在低氮脅迫條件下只有在耐低氮黃瓜品系D0328中的表達(dá)量明顯上調(diào)，在耐低氮能力弱的黃瓜品系D0422中的表達(dá)量并無(wú)明顯變化。研究結(jié)果可為黃瓜耐低氮的基因功能研究提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：黃瓜；耐低氮；基因；克隆；表達(dá)分析

中圖分類號(hào)：Q786 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）04-0026-04

氮素由于在植物生長(zhǎng)發(fā)育中有著不可或缺的作用，因此一直被廣泛關(guān)注和研究。黃瓜（Cucumis sativus L.）作為一種喜硝態(tài)氮的蔬菜作物，對(duì)于氮素的需求也是毋庸置疑的。近幾年來(lái)，生產(chǎn)者在盲目追求黃瓜產(chǎn)量的同時(shí)，過(guò)度施用氮肥的現(xiàn)象十分嚴(yán)重，造成的環(huán)境污染、黃瓜產(chǎn)品質(zhì)量下降等后果也十分嚴(yán)峻[1-2]。因此，有效提高黃瓜耐低氮能力、培育耐低氮黃瓜品種對(duì)于創(chuàng)造綠色農(nóng)業(yè)、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)具有重要意義。隨著黃瓜基因的測(cè)序完成，許多研究已經(jīng)發(fā)展到了分子水平，鑒于其他模式植物如擬南芥等的研究，通過(guò)挖掘氮素相關(guān)基因，利用基因工程手段提高植物的氮素代謝能力是研究黃瓜耐低氮的重要手段之一[3]。何紅梅等對(duì)低氮脅迫下黃瓜鈣依賴蛋白激酶基因CsCDPK進(jìn)行了克隆、表達(dá)分析及遺傳轉(zhuǎn)化，也對(duì)谷氨酰胺合酶基因[WTBX][STBX]GS1[WTBZ][STBZ]和黃瓜硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因[WTBX][STBX]CsNRT1.5[WTBZ][STBZ]等進(jìn)行了克隆與表達(dá)分析[4-6]，證明通過(guò)轉(zhuǎn)錄水平找到黃瓜耐低氮相關(guān)基因是可行的。丙二烯氧化物環(huán)化酶（allene oxide cyclase，AOC）基因是茉莉酸合成的重要酶基因，目前已經(jīng)在多種作物中被克隆，如番茄[7]、擬南芥[8]、大豆[9]等。盡管這些AOC基因來(lái)自不同的植物，但是它們都對(duì)生物、非生物脅迫具有類似的響應(yīng)。例如，麻瘋樹(shù)JcAOC可響應(yīng)鹽脅迫、低溫脅迫[10]；喜樹(shù)AOC基因的過(guò)表達(dá)可提高煙草對(duì)鹽脅迫、低溫脅迫的耐受性[11]；將大豆[WTBX][STBX]GmAO[WTBZ][STBZ]基因?qū)霟煵菘商岣咿D(zhuǎn)基因植株的抗氧化脅迫能力，而[WTBX][STBX]GmAOC1[WTBZ][STBZ]則提高了煙草的耐鹽性[9]。但是，關(guān)于黃瓜[WTBX][STBX]CsAOC3[WTBZ][STBZ]基因?qū)Φ偷{迫的響應(yīng)還未見(jiàn)報(bào)道。

本研究對(duì)黃瓜[WTBX][STBX]CsAOC3[WTBZ][STBZ]基因進(jìn)行分離，獲得該基因的全長(zhǎng)cDNA序列，并闡述該基因的蛋白結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)進(jìn)化情況，同時(shí)研究該基因在耐低氮能力不同的2個(gè)黃瓜品系中的表達(dá)模式。

1材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)材料為前期篩選出的2份黃瓜品系：耐低氮能力強(qiáng)的D0328、耐低氮能力弱的D0422[12]，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院黃瓜課題組提供。

1.2菌株與試劑

大腸桿菌DH5α菌株、pEASY-T1克隆載體、DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒和Taq DNA聚合酶，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)（TransGen Biotech）有限公司；TRIzol，購(gòu)自Invitrogen公司；SYBR Green PCR Master Mix熒光定量試劑盒、cDNA第1鏈合成試劑盒，購(gòu)自東洋紡（上海）生物科技有限公司（TOYOBO）；其他生化試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品?；驕y(cè)序由金唯智生物科技（北京）有限公司完成。

1.3方法

1.3.1植物培養(yǎng)將D0328、D0422種子浸種催芽后，在人工氣候室中進(jìn)行播種培養(yǎng)，光—暗周期16 h—8 h，晝—夜溫度26 ℃—18 ℃，空氣相對(duì)濕度保持在65%～70%之間，使用全蛭石為基質(zhì)，澆灌營(yíng)養(yǎng)液栽培。待其子葉展平時(shí)，分別用含低氮（3 mmol/L NO3-）、正常氮（14 mmol/L NO3-）的營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行處理，基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)液配方：1.512 mmol/L NaH2PO4·2H2O，0.257 mmol/L Na2HPO4·12H2O，1.5 mmol/L MgSO4·7H2O，4 mmol/L Ca（NO3）2·4H2O，6 mmol/L KNO3，8.6 μmol/L C10H12FeN2NaO8·3H2O，10.3 μmol/L MnSO4，1 μmol/L CuSO4·5H2O，30 μmol/L H3BO3，24 nmol/L Na6Mo7O24·4H2O，130 nmol/L CoCl2·6H2O[13]。用KCl、KNO3調(diào)整營(yíng)養(yǎng)液中的K+、Ca2+平衡，每隔1 d澆灌營(yíng)養(yǎng)液1次。在播種后37 d分別取根、莖、葉，液氮速凍后，存放于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2總RNA提取及cDNA第1鏈合成采用TRIzol法提取各部位總RNA，用分光光度計(jì)檢測(cè)吸光度及濃度；cDNA第1鏈的合成參照TOYOBO公司的ReverTra Ace qPCR RT Kit說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3.3引物設(shè)計(jì)與合成以黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中序列號(hào)為Csa5M366670.1的基因編碼序列為模板，利用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行克隆引物、qRT-PCR引物設(shè)計(jì)

1.3.4黃瓜[WTBX][STBX]CsAOC3[WTBZ][STBZ]基因的克隆與序列分析以D0328葉片cDNA為模板，利用PCR技術(shù)進(jìn)行CsAOC的克隆，20 μL反應(yīng)體系：2 μL 10×Taq Buffer，2 μL dNTP Mix，各0.5 μL CsAOC-F（10 μmol/L）、CsAOC-R（10 μmol/L），0.2 μL 5 U/μL Taq DNA聚合酶，2 μL 200 ng/μL模板cDNA，12.8 μL ddH2O。反應(yīng)條件：96 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，25次循環(huán)；72 ℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并進(jìn)行目的條帶的回收，與pEASY-T1克隆載體連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，將菌液鋪平板，于37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑斑，搖菌，然后進(jìn)行質(zhì)粒提取，酶切鑒定后送陽(yáng)性樣本測(cè)序。

利用美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（網(wǎng)址：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/，簡(jiǎn)稱NCBI）在線Blast工具和DNAMAN、DNAStar進(jìn)行序列比對(duì)、分析；利用在線軟件Expasy、TMHMM等進(jìn)行氨基酸組成、穩(wěn)定系數(shù)、親水系數(shù)等分析；利用MEGA 5.10軟件，采用鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.3.5低氮脅迫條件下的表達(dá)分析以低氮、正常氮處理植株的根、莖、葉cDNA為模板，進(jìn)行qRT-PCR，20 μL反應(yīng)體系：10 μL SYBR Green PCR Master Mix，各0.5 μL [WTBX][STBX]CsAOC3[WTBZ][STBZ]-qF（10 μmol/L）、[WTBX][STBX]CsAOC3[WTBZ][STBZ]-qR（10 μmol/L），1 μL 150 ng/μL cDNA，8 μL ddH2O。反應(yīng)條件：96 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，56 ℃ 15 s，72 ℃ 45 s，45次循環(huán)。以本試驗(yàn)中的[WTBX][STBX]CsEF1α[WTBZ][STBZ]作為參照基因。

2結(jié)果與分析

2.1克隆

以低氮處理的黃瓜葉片cDNA為模板，以[WTBX][STBX]CsAOC3[WTBZ][STBZ]-F、[WTBX][STBX]CsAOC3[WTBZ][STBZ]-R為引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增出1條約750 bp的亮帶（圖1）。回收目標(biāo)條帶，并與pEASY-T1克隆載體連接，經(jīng)陽(yáng)性菌液酶切檢測(cè)后，送交金唯智生物科技（北京）有限公司測(cè)序得到堿基序列，全長(zhǎng)為753 bp，該序列與黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)[WTBX][STBX]Csa5M366670.1[WTBZ][STBZ]基因編碼區(qū)序列完全一致，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA，表明成功獲得全長(zhǎng)目的基因。

2.2序列分析

利用DNAMAN 8.0軟件翻譯該序列，發(fā)現(xiàn)該序列共編碼250個(gè)氨基酸（圖2）。通過(guò)NCBI對(duì)該基因的氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，其蛋白屬于丙二烯氧化物環(huán)化酶超家族

（allene oxide cyclase superfamily）（圖3）。通過(guò)在線軟件Expasy-ProtParam（http：//www.expasy.org/）分析該基因所編碼蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)果表明，CsAOC3蛋白的分子量為27.17 ku，理論等電點(diǎn)為8.93，不穩(wěn)定系數(shù)為 51.92，平均親水系數(shù)為-0.155，因此該蛋白屬于不穩(wěn)定型的疏水蛋白。利用TMHMM Server v 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)預(yù)測(cè)表明，CsAOC3蛋白不具有跨膜蛋白結(jié)構(gòu)。用TargetP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）分析表明，該蛋白無(wú)信號(hào)肽，此外亞細(xì)胞定位顯示，該蛋白最可能定位于葉綠體。

2.3系統(tǒng)進(jìn)化分析

將DNAMAN 8.0軟件翻譯獲得的[WTBX][STBX]CsAOC3[WTBZ][STBZ]編碼的氨基酸序列在NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該蛋白與甜瓜、菜豆、胡楊等16種植物的AOC蛋白有65%～94%的同源性，其中與甜瓜的蛋白同源性最高，為94%。將CsAOC3與這十余條AOC蛋白序列進(jìn)行多重比較并用MEGA 5.10軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，可以看出，這17條蛋白序列明顯地聚為2類：CsAOC3與甜瓜、大豆、擬南芥、煙草等為第1類，其中黃瓜與同屬葫蘆科作物的甜瓜親緣關(guān)系非常接近；菜豆、葡萄則為第2類。

在低氮脅迫條件下的表達(dá)分析

在播種37 d后對(duì)低氮處理、正常氮處理的2個(gè)黃瓜品系D0328、D0422的第3張葉片進(jìn)行取材，提取總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)CsAOC3在低氮脅迫條件下2個(gè)耐低氮能力不同的黃瓜品系葉片中的表達(dá)情況進(jìn)行分析。圖5表明，在耐低氮強(qiáng)的黃瓜品系D0328中，與正常氮處理相比，CsAOC3在低氮脅迫條件下的表達(dá)量明顯上調(diào)，提高了11倍多；在耐低氮能力弱的黃瓜品系D0422中，低氮脅迫條件與正常氮條件下的CsAOC3表達(dá)量并沒(méi)有明顯變化。

3討論與結(jié)論

本研究首先利用PCR技術(shù)，從黃瓜葉片中擴(kuò)增獲得丙二烯氧化物環(huán)化酶基因的cDNA全長(zhǎng)。通過(guò)保守結(jié)構(gòu)域分析表明，該基因編碼植物丙二烯氧化物環(huán)化酶超家族蛋白；其氨基酸序列與其他植物AOC基因編碼的氨基酸序列同源性較高，其中與同屬葫蘆科的甜瓜同源性最高。而且進(jìn)化分析表明，該蛋白與多數(shù)作物親緣關(guān)系較近，符合植物進(jìn)化規(guī)律。

丙二烯氧化物環(huán)化酶（AOC，E 5.3.99.6）可以將不穩(wěn)定的丙二烯氧化物衍生物轉(zhuǎn)變?yōu)?2-氧-植物二烯酸還原酶（12-oxo-phytodienoic acid，簡(jiǎn)稱OPDA），進(jìn)而促進(jìn)茉莉酸基本結(jié)構(gòu)的形成[7，9]，因此AOC被視為茉莉酸合成中極其重要的酶。許多研究已經(jīng)證明，茉莉酸是一種植物適應(yīng)多種逆境的重要激素之一[14-17]。因此涉及茉莉酸合成和信號(hào)的基因也逐漸被研究，如擬南芥、番茄、水稻、玉米等[16-19]。

目前，盡管AOC基因在不同作物中已有較為廣泛的研究，但是關(guān)于該基因?qū)Φ偷憫?yīng)的研究尚不明確。現(xiàn)有研究表明，茉莉酸、乙烯能夠調(diào)控硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AtNFP7.2、AtNPF7.3，從而影響和調(diào)節(jié)植物的氮素吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)[20]。本研究對(duì)[WTBX][STBX]CsAOC3[WTBZ][STBZ]在低氮脅迫條件下的表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該基因在低氮條件下的耐低氮黃瓜品系中的表達(dá)量顯著上調(diào)，而在耐低氮弱的黃瓜品系中表達(dá)量幾乎不變，說(shuō)明該基因是在耐低氮品系中特異上調(diào)表達(dá)的基因，暗示2個(gè)黃瓜品系之所以有耐低氮能力差異，可能是由于二者在低氮脅迫時(shí)，對(duì)于氮素吸收的能力有明顯差異引起的，也就是說(shuō)，對(duì)于耐低氮品系D0328來(lái)說(shuō)，低氮脅迫會(huì)激發(fā)它通過(guò)的迅速上調(diào)表達(dá)來(lái)促進(jìn)茉莉酸合成，從而增強(qiáng)氮素的吸收能力；而耐低氮弱品系STBZ]則沒(méi)有作出相應(yīng)反應(yīng)。Wang等最近研究發(fā)現(xiàn)，陸地棉基因過(guò)表達(dá)可增強(qiáng)擬南芥對(duì)銅的耐受性[21]，因此該基因可能會(huì)對(duì)植物營(yíng)養(yǎng)脅迫作出響應(yīng)。

目前，關(guān)于黃瓜耐低氮相關(guān)基因的報(bào)道較少。本研究通過(guò)克隆獲得了并對(duì)它在低氮脅迫下的響應(yīng)作了初步檢測(cè)，證明該基因是耐低氮黃瓜品系中特異上調(diào)表達(dá)基因，這一結(jié)論將為后續(xù)研究黃瓜耐低氮生理及分子機(jī)制提供思路和線索，也為下一步利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高黃瓜耐低氮能力奠定了基礎(chǔ)。

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