黑胡椒提取物中抑制PhIP 活性關(guān)鍵化合物的篩選與鑒定

鄢 嫣 焦 葉 曾茂茂 陳 潔 江 艦*

（1 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所 合肥 230031 2 長(zhǎng)沙理工大學(xué)化學(xué)與食品工程學(xué)院 長(zhǎng)沙 410114 3 江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江蘇無(wú)錫 214122）

雜環(huán)胺（HAAs）是一類(lèi)具有致癌和致突變性質(zhì)的雜環(huán)芳香烴類(lèi)化合物，普遍生成于高溫加工肉制品中[1]。2-氨基-1-甲基-6-苯基-咪唑[4，5-b]吡啶（PhIP）是肉制品中最為常見(jiàn)且含量最多的HAAs，高溫長(zhǎng)時(shí)間加熱肉制品會(huì)大量產(chǎn)生PhIP[2]。早期研究發(fā)現(xiàn)，PhIP 能誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體內(nèi)多器官患癌[3-4]。加工肉制品是我國(guó)人民日常飲食中重要的組成部分，人類(lèi)長(zhǎng)期攝入含有PhIP 的食物會(huì)極大程度增加其患癌風(fēng)險(xiǎn)[5-6]。深入探索肉制品中PhIP的抑制方法和機(jī)制，具有很高的研究?jī)r(jià)值。

香辛料是肉類(lèi)加工中常用的調(diào)味品，可賦予肉制品獨(dú)特的風(fēng)味，同時(shí)也被證明可顯著影響HAAs 的形成[7-8]，是最具應(yīng)用價(jià)值的一類(lèi)雜環(huán)胺抑制劑。黑胡椒具有去腥、提味、增香、增鮮、除異味、防腐和抗氧化[9]等作用，在肉制品中使用非常廣泛，如烤肉串、煲湯、熱炒、腌臘醬鹵、香腸火腿、炸雞等。研究發(fā)現(xiàn)，向肉制品中添加胡椒對(duì)HAAs 的形成有顯著的抑制作用[10-11]。例如，Oz 等[12]發(fā)現(xiàn)黑胡椒對(duì)3 種溫度（175，200 ℃和225 ℃）下油炸高脂肉丸中PhIP 的抑制率可達(dá)100%。同時(shí)近期研究也發(fā)現(xiàn)，黑胡椒在一定加工條件下對(duì)HAAs 形成有促進(jìn)作用[13]。在不同加工體系下，添加黑胡椒對(duì)HAAs 形成的影響有顯著差異。這可能與黑胡椒中具有PhIP 抑制活性的組分在不同加工條件下的性質(zhì)變化有關(guān)。據(jù)現(xiàn)有報(bào)道，黑胡椒中含有多種活性成分，如生物堿、有機(jī)酸、烯帖類(lèi)、酚類(lèi)等[14-15]。這些化合物性質(zhì)差異很大，在不同加工條件下，其溶解度、熱敏性等性質(zhì)也有顯著差異。為安全、有效地利用黑胡椒這一天然PhIP 抑制劑，明確黑胡椒對(duì)PhIP 抑制活性影響最顯著的組分，顯得尤為重要。

對(duì)植物源活性成分的鑒定，傳統(tǒng)方法包括試劑萃取、柱分離、制備液相色譜分離、質(zhì)譜分析及核磁共振鑒定等。然而，采用傳統(tǒng)手段從植物復(fù)雜成分中找出一對(duì)或多種具有特定活性的組分，往往需要對(duì)各組分進(jìn)行逐一分離。代謝組學(xué)是研究生物體在外源或內(nèi)源性刺激下體系小分子變化的一種整體性分析策略[16]。目前，借助代謝組學(xué)的研究思路對(duì)復(fù)雜體系中的關(guān)鍵化合物的鑒定已有應(yīng)用[17-18]。研究人員通常采用各種現(xiàn)代儀器方法，建立目標(biāo)體系的特征譜后，運(yùn)用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法建立不同條件下的譜效關(guān)系，并篩選影響這一關(guān)系的關(guān)鍵小分子物質(zhì)。本研究以高溫油炸豬肉為PhIP 抑制效果的供試體系，以具有PhIP 抑制活性的香辛料黑胡椒為研究對(duì)象，通過(guò)構(gòu)建黑胡椒提取物的HPLC 譜與其PhIP 抑制效果，建立譜效關(guān)系，對(duì)黑胡椒中抑制PhIP 活性具有顯著影響的組分進(jìn)行篩選和鑒定。為開(kāi)發(fā)和合理利用黑胡椒這一PhIP 抑制劑提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生鮮豬肉，合肥市永輝超市四里河店；除去肥肉，絞碎后，備用。黑胡椒，合肥當(dāng)?shù)夭耸袌?chǎng)；清洗，粉碎，過(guò)100 目篩后，備用。

雜環(huán)胺2-氨基-1-甲基-6 苯基咪唑并[4，5-b]吡啶（PhIP），美國(guó)Santa Cruz Biotechnology 公司；內(nèi)標(biāo)1，3，7-三甲基-1H-嘌呤-2，6-二酮（Caffieine）、標(biāo)準(zhǔn)品：丁子香酚、槲皮素，上海百靈威試劑公司；Oasis MCX 固相萃取用小柱（60 mg，3 mL），美國(guó)Waters 公司；乙腈（色譜純），美國(guó)Thermo-Fisher Scientific 公 司；乙 酸 銨、鹽 酸（HCl）、甲醇、氨水（25%）均為分析純級(jí)，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters Acquity 超高效液相色譜系統(tǒng)（UPLC）、串聯(lián)Waters Acquity 三重四極桿質(zhì)譜檢測(cè)器或飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)器（ESI 源）、配備Waters Acquity UPLC BEH C18柱（50×2.1 mm i.d.，1.7 μm）、Alliance 高效液相色譜系統(tǒng)、串聯(lián)Waters 2487 紫外檢測(cè)器、配備Xbridge C18柱（150×2.1 mm i.d.，3.5 μm），美國(guó)Waters 公司；Rational AG電子烤箱，德國(guó)National 公司；SPE-01 Ⅱ八通道全自動(dòng)固相萃取儀，加拿大博朗科技有限公司；3K15 冷凍離心機(jī)，美國(guó)Sigma 公司；T25 高速分散機(jī)，德國(guó)IKA 公司；純水凈化系統(tǒng)，美國(guó)Millipore公司；QGC-12T 氮吹儀，上海泉島公司；PTC 系列超聲波清洗機(jī)，湖北鼎泰生化科技設(shè)備制造有限公司；EYELA N-1100D-W（WD）旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，日本東京理化器械株式會(huì)社；FD-ICE 冷凍干燥劑，北京德天佑科技發(fā)展有限公司；HH-6 高精度數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海邦西儀器科技有限公司；料理機(jī)，九陽(yáng)股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黑胡椒提取物的制備

1）黑胡椒乙醇提取物和水提取物的制備 取粉碎好并過(guò)篩的黑胡椒粉末，以料液比1∶20 加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇（80%，100%）或超純水后，采用不同提取方式（超聲、水浴）在不同的提取溫度（50，60，70 ℃）下提取一定時(shí)間（30，60，90 min），冷卻至室溫后，離心20 min（離心力5 000 g），取上清液濃縮至少量后，凍干，備用。

2）黑胡椒揮發(fā)油的制備 參考文獻(xiàn)[19]制備黑胡椒揮發(fā)油。取粉碎好并過(guò)篩的黑胡椒粉末，以料液比1∶10 加入超純水后，浸泡12 h。采用水蒸氣蒸餾5 h 后。冷卻至室溫，凍干，備用。

1.3.2 黑胡椒乙醇提取物HPLC 圖譜的建立 采用高效液相色譜對(duì)上述所得的黑胡椒乙醇提取物進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定條件：色譜柱，Xbridge C18柱（150×2.1 mm i.d.，3.5 μm）；流動(dòng)相，（A）0.1%甲酸，（B）乙腈；梯度洗脫程序：0.01～10 min，35%～40%B；10～12 min，40%～48%B；12～60 min，48%～84%B；60～62 min，84%～100%B；62～80 min，100%B；流速0.3 mL/min。

1.3.3 添加黑胡椒提取物的焙烤豬肉模擬體系的構(gòu)建 向上述黑胡椒提取物凍干粉末中加入超純水，制備成提取物溶液或懸濁液，加入40 g 絞碎的豬肉，用料理機(jī)充分?jǐn)嚢杈鶆?，提取物的添加量?%。用直徑6 cm 的表面皿將肉糜壓制成肉餅后，置于烤箱225 ℃焙烤20 min（每10 min 翻面1次）。冷卻后，將烤肉餅粉碎成粉末，待測(cè)。

1.3.4 豬肉體系中PhIP UPLC-MS/MS 測(cè)定方法的建立 采用乙腈提取法[20]結(jié)合UPLC-MS/MS 對(duì)上述烤肉模擬體系中的PhIP 進(jìn)行測(cè)定。具體方法：取4 g 上述烤肉粉末，加入25 mL 乙腈均質(zhì)后超聲提取15 min。冷凍離心（11 363×g，10 min，4℃）后，收集上清液。上述提取步驟重復(fù)2 次后，合并上清液，定容至50 mL，進(jìn)行固相萃?。⊿olid phase extraction，SPE），對(duì)雜環(huán)胺進(jìn)行凈化和富集。

在使用前，先對(duì)Oasis MCX 固相萃取小柱進(jìn)行活化。活化試劑先后分別為6 mL 甲醇、6 mL 超純水、3 mL 乙腈活化。用濾紙將上述樣品提取液過(guò)濾后，上樣，再先后用6 mL 0.1 mol/L HCl 和6 mL 甲醇淋洗，除去未吸附的極性和非極性雜質(zhì)。最后，采用6 mL 甲醇∶氨水（95∶5，體積比）洗脫吸附在柱上的PhIP。用氮?dú)庠?5 ℃下將上述洗脫液吹干后，加入400 μL 甲醇復(fù)溶，并采用0.22 μm尼龍針孔濾器過(guò)濾。加入內(nèi)標(biāo)Caffeine 后，進(jìn)行UPLC-MS/MS 檢測(cè)。

UPLC-MS/MS 測(cè)定方法：采用Waters Acquity UPLC BEH C18柱（100×2.1mm i.d.，1.7 μm）進(jìn)行分離，流動(dòng)相為（A）10 mmol/L 乙酸銨水溶液（pH 6.8），（B）乙腈，梯度洗脫程序：0～0.1 min，10%B；0.1～18 min，10%～30% B；18～20 min，30%～100%B；20～20.1 min，回到初始濃度；流速設(shè)定為0.3 mL/min。三重四極桿質(zhì)譜條件為：質(zhì)譜電離源，電噴霧電離源（ESI 源），ESI+，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM模式）；源溫：120 ℃；毛細(xì)管電壓：3.5 V；脫溶劑溫度：350 ℃；脫溶劑氣（純度99.0%氮?dú)猓┝魉伲?50 L/h；碰撞氣（純度99.9%氬氣）流速：0.13 mL/min；錐孔氣（純度99.0%氮?dú)猓┝魉伲?0 L/h。PhIP 的MRM 模式下的參數(shù)（母離子、定性離子、定量離子、錐孔電壓、碰撞能量）由儀器自帶的Intellstart功能自動(dòng)優(yōu)化得到，優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)表1。

1.3.5 方法學(xué)考察 分別從線(xiàn)性范圍、最低檢測(cè)限（LODs）、最低定量限（LOQs）、方法回收率、精密度等方面對(duì)PhIP 的測(cè)定方法進(jìn)行了考察。具體方法如下：

1）線(xiàn)性范圍 向豬肉空白樣品中加入9 種個(gè)濃度梯度的PhIP 標(biāo)準(zhǔn)品，并加以測(cè)定。分別以加入標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，以HAAs 與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)，繪制線(xiàn)性曲線(xiàn)，并進(jìn)行線(xiàn)性回歸分析。

2）LODs 和LOQs 稀釋PhIP 標(biāo)準(zhǔn)品分別記錄當(dāng)HAAs 信噪比達(dá)到3 和10 時(shí)的質(zhì)量濃度，即為各目標(biāo)物的LODs 和LOQs，單位為μg/L。

3）回收率 向豬肉樣品中加入一定量的PhIP 標(biāo)準(zhǔn)品后，采用1.3.4 節(jié)所述預(yù)處理方法提取和凈化后，測(cè)定PhIP 含量。以如下公式計(jì)算回收率：

[（加標(biāo)樣品中目標(biāo)物含量-空白不加標(biāo)樣品中目標(biāo)物含量）/加入標(biāo)準(zhǔn)品量]×100%。

4）精密度 在測(cè)定加標(biāo)回收率時(shí)，在同一天內(nèi)測(cè)定向空白豬肉加入低濃度標(biāo)品后的加標(biāo)回收率數(shù)據(jù)，計(jì)算所得的RSD 值，即為日內(nèi)精密度。根據(jù)連續(xù)3 d 測(cè)定所得的高濃度加標(biāo)回收率數(shù)據(jù)，計(jì)算RSD 值，即為日間精密度。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理 采用Masslynx 4.1 SCN 805 軟件對(duì)UHPLC-MS/MS 所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行采集和積分。采用Statistics 9.0 軟件程序中的一般線(xiàn)性模型對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和顯著性分析（P＜0.05）。采用SIMCA 13 軟件對(duì)黑胡椒提取物HPLC 各峰面積及提取物的PhIP 抑制率進(jìn)行主成分分析（PCA），用以明確黑胡椒乙醇提取物中對(duì)其PhIP抑制效果有顯著影響的化合物。

2 結(jié)果與分析

2.1 焙烤豬肉體系中PhIP 的測(cè)定結(jié)果

采用乙腈提取法結(jié)合UPLC-MS/MS 對(duì)各焙烤豬肉模擬體系中PhIP 含量進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)測(cè)定的方法學(xué)參數(shù)進(jìn)行考察。采用該P(yáng)hIP 測(cè)定方法，所得的烤肉樣品中PhIP 的MRM 譜圖，如圖1 所示，方法學(xué)數(shù)據(jù)如表1 所示。結(jié)果表明，本研究所采用的測(cè)定方法使得PhIP 在一個(gè)相對(duì)寬的范圍（2.30～147.50 ng/mL）內(nèi)具有良好的線(xiàn)性，相關(guān)系數(shù)為0.9965。樣品加標(biāo)后測(cè)得方法的LODs 和LOQs 分別為0.104，0.311 ng/g，滿(mǎn)足對(duì)于痕量PhIP 檢測(cè)要求。方法回收率達(dá)76.4%以上，相較于現(xiàn)行傳統(tǒng)方法所得測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠[21-22]。方法日間精密度達(dá)9.36%以下，說(shuō)明該方法結(jié)果穩(wěn)定，重現(xiàn)性良好。

圖1 烤肉樣品中PhIP 的MRM 譜圖Fig.1 MRM chromatograms of PhIP in roasted pork samples

表1 PhIP 三重四極桿質(zhì)譜MRM 及測(cè)定方法學(xué)參數(shù)Table 1 MRM parameters of triple quadruple detector and the methodological parameters

2.2 不同試劑提取的黑胡椒提取物對(duì)PhIP 形成的影響

采用超純水在不同提取溫度（50，60，70 ℃）和提取時(shí)間（30，60，90 min）下對(duì)黑胡椒進(jìn)行提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加所得的黑胡椒水提物對(duì)PhIP 的形成均無(wú)抑制作用，其中70 ℃下提取90 min 的水提物對(duì)PhIP 的促進(jìn)率最低。

同時(shí)，比較了70 ℃下提取90 min 的水提物與相同條件下的乙醇提取物以及揮發(fā)油的添加對(duì)焙烤豬肉體系中PhIP 形成的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖2），添加水提物對(duì)PhIP 有一定的促進(jìn)作用。反之，黑胡椒的乙醇提取物以及揮發(fā)油對(duì)PhIP 有較為顯著的抑制作用，抑制率分別為51.5%和74.6%。由此可見(jiàn)，3 種提取物中，乙醇提取物的抑制效果最好。

根據(jù)上述結(jié)果可知，黑胡椒中具有PhIP 抑制活性的是一種或多種可溶解于乙醇的化合物。而黑胡椒中的親水類(lèi)化合物不具備抑制活性，甚至對(duì)PhIP 的形成有一定的促進(jìn)作用。因此，黑胡椒更適合應(yīng)用在含油的加工體系（如油炸肉制品）中。早期研究表明，含油加工體系中PhIP 的形成量會(huì)大大增加[23-24]，因此，黑胡椒在這一體系中的應(yīng)用就顯得尤為必要。同時(shí)，明確黑胡椒乙醇提取物中對(duì)PhIP 有顯著抑制作用的成分，可為其在加工過(guò)程中的合理應(yīng)用提供理論支持。

2.3 不同條件下提取的黑胡椒乙醇提取物對(duì)PhIP 形成的影響

圖2 添加黑胡椒提取物后烤肉中PhIP 含量的比較Fig.2 Comparison of the PhIP levels in roasted pork added with black pepper extracts

采用不同提取方式（超聲、水?。煌掖俭w積分?jǐn)?shù)（80%和100%），不同提取溫度（50，60，70℃）以及不同提取時(shí)間（30，60，90 min）對(duì)黑胡椒進(jìn)行提取，制備24 個(gè)黑胡椒乙醇提取物，并比較了上述乙醇提取物的PhIP 抑制率。結(jié)果可見(jiàn)，采用不同提取參數(shù)所得的提取物對(duì)烤肉餅體系中PhIP的抑制率差異較大（表3）。采用100%乙醇，超聲提取60 min 后，所得的乙醇提取物對(duì)PhIP 的抑制效果最好，抑制率可達(dá)99.4%。

對(duì)上述24 個(gè)黑胡椒乙醇提取分別進(jìn)行HPLC分析，所得HPLC 圖譜如圖3 所示。通過(guò)比對(duì)24個(gè)提取物的HPLC 圖譜，共找出17 個(gè)共有峰。將共有峰進(jìn)行積分處理，所得的峰面積數(shù)據(jù)用于后續(xù)PCA 建模分析。

2.4 黑胡椒乙醇提取物中對(duì)PhIP 的形成有顯著影響的關(guān)鍵化合物

為明確黑胡椒乙醇提取物中影響其抑制PhIP形成活性的化合物，采用主成分分析法對(duì)上述乙醇提取物的共有峰面積和PhIP 抑制率進(jìn)行分析。將上述所得的24 個(gè)黑胡椒提取物的PhIP 抑制率分為3 組，分別為a 組＜50%，b 組50%～80%和c組＞80%。采用主成分分析法，對(duì)黑胡椒提取物HPLC 譜圖中17 個(gè)共有峰的峰面積進(jìn)行降維，建立提取物PhIP 抑制率及其組分之間的關(guān)系，所得主成分散點(diǎn)圖，如圖4 所示。分析結(jié)果可見(jiàn)，主成分分析建模結(jié)果能良好的代表數(shù)據(jù)組真實(shí)性（累計(jì)R2X＞0.737，數(shù)據(jù)交互系數(shù)＞0.451）。24 個(gè)樣本在PCA 圖譜中分散分布，且來(lái)自于不同樣本組的樣本在PC1 方向上明顯分離。可見(jiàn)具有不同PhIP 抑制率的提取物中的共有峰的峰面積存在顯著差異。

表3 不同提取條件所得黑胡椒乙醇提取物PhIP 抑制率的比較Table 3 PhIP inhibitory efficiency comparison of the black pepper ethanol extracts obtained under different extracting conditions

圖3 黑胡椒乙醇提取物HPLC 圖譜Fig.3 HPLC chromatogram of black pepper ethanol extracts

通過(guò)分析PCA 樣本載荷圖（圖5）可以看出，各共有峰對(duì)主成分的貢獻(xiàn)度差異很大，其中峰5、峰10（圖5 中紅色圓圈圈內(nèi)樣本點(diǎn)）對(duì)樣本的分離有最為突出的貢獻(xiàn)。其所代表的化合物含量對(duì)黑胡椒提取物的PhIP 抑制活性影響最顯著。峰5、峰10 是決定黑胡椒提取物PhIP 抑制活性的關(guān)鍵峰。

2.5 關(guān)鍵化合物的鑒定

采用HPLC-TOF-MS 法對(duì)峰5 和峰10 進(jìn)行質(zhì)譜分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黑胡椒乙醇提取物中峰5 和峰10 的質(zhì)譜圖譜與丁子香酚和槲皮素的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜圖基本一致，且分子離子峰、碎片離子峰的組成和比例也大致相同，其化合物分子結(jié)構(gòu)式和黑胡椒提取物中質(zhì)譜譜圖見(jiàn)圖6。同時(shí)，將黑胡椒提取物的HPLC 圖譜與丁子香酚和槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC 圖譜進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)提取物中峰5、峰10 的保留時(shí)間分別為24.308，28.430 min，與標(biāo)準(zhǔn)品譜圖（圖7）一致，可進(jìn)一步鑒定出關(guān)鍵峰：峰5 為丁子香酚，峰10 為槲皮素。

圖4 黑胡椒乙醇提取物共有峰面積-抑制率主成分分析散點(diǎn)分布圖Fig.4 PCA score scatter plot of common peak areas in black pepper ethanol extracts with different PhIP inhibitory efficiencies

圖5 主成分分析載荷圖Fig.5 PCA Loading plot of the common peak

圖6 黑胡椒提取物中峰5（a）和峰10（b）的質(zhì)譜譜圖Fig.6 MS spectras of peak 5（a）and peak 10（b）in black pepper ethanol extracts

圖7 關(guān)鍵峰丁子香酚（a）和槲皮素（b）標(biāo)準(zhǔn)品HPLC 譜圖Fig.7 Key peak HPLC chromatrograms of eugenol（a）and quercetin（b）standards

本研究在建立一系列黑胡椒乙醇提取物HPLC 譜圖的基礎(chǔ)上，通過(guò)建立譜峰面積和提取物PhIP 抑制率的主成分分析模型，篩選并鑒定出提取物中對(duì)PhIP 抑制率影響最為顯著的關(guān)鍵物質(zhì)為槲皮素和丁子香酚。其中，槲皮素對(duì)于雜環(huán)胺的抑制作用早有報(bào)道，研究認(rèn)為槲皮素可通過(guò)與PhIP 形成中間體加合產(chǎn)生新化合物，從而抑制PhIP 的形成[25]。黑胡椒中存在一定量的槲皮素[26]，而本研究的結(jié)果表明，槲皮素具有抑制PhIP 活性的作用，并且可進(jìn)一步說(shuō)明黑胡椒中的槲皮素含量對(duì)抑制PhIP 活性有顯著影響。丁子香酚作為黑胡椒中重要的香氣成分[27]是黑胡椒中多酚類(lèi)化合物的一種。前期研究表明，多種植物中的多酚類(lèi)化合物均對(duì)雜環(huán)胺有一定的抑制作用[28-29]，而丁子香酚對(duì)雜環(huán)胺的抑制作用，直至目前尚未明確。因此，本研究認(rèn)為黑胡椒中丁子香酚是影響其抑制PhIP 活性的關(guān)鍵化合物，此結(jié)論可為進(jìn)一步研究黑胡椒中丁子香酚對(duì)PhIP 的抑制途徑和規(guī)律提供理論依據(jù)。

3 結(jié)論

本研究在準(zhǔn)確測(cè)定烤肉中PhIP 含量的基礎(chǔ)上，分別比較了黑胡椒水提物、乙醇提取物和揮發(fā)油對(duì)PhIP 抑制率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3 種提取物中，乙醇提取物的抑制效果最好，抑制率可達(dá)74.6%。由此可推測(cè)，黑胡椒中具有PhIP 抑制活性的是一種或多種可溶于乙醇的化合物。

改變提取方式、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和提取時(shí)間，分別制備了24 種黑胡椒乙醇提取物，通過(guò)測(cè)定其PhIP 抑制率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)體積分?jǐn)?shù)100%的乙醇超聲萃取60 min 所得的提取物抑制率最高。采用主成分分析法對(duì)上述24 個(gè)黑胡椒乙醇提取物HPLC 譜峰面積及其PhIP 抑制率進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)24 個(gè)樣本中來(lái)自不同抑制率組的樣本在PCA 圖譜PC1 方向上明顯分離，其中峰5、峰10 樣本對(duì)分離貢獻(xiàn)最大，是決定黑胡椒提取物PhIP 抑制活性的關(guān)鍵峰。經(jīng)UPLC-TOF-MS 分析結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比、鑒定出2 個(gè)關(guān)鍵峰分別為丁子香酚和槲皮素，說(shuō)明這兩種物質(zhì)是黑胡椒乙醇提取物中影響其抑制PhIP 活性的關(guān)鍵化合物。