HPLC 法同時(shí)測(cè)定感冒止咳顆粒中10 種成分

何 艷，胡小祥，王 慶?

（1.湘南學(xué)院藥學(xué)院，湖南 郴州 423000；2.郴州市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，湖南 郴州 423000）

感冒止咳顆粒由柴胡、山銀花、葛根、黃芩、青蒿、連翹、桔梗、苦杏仁、薄荷腦9 味藥材組成，可用于外感風(fēng)熱所致感冒，癥見(jiàn)發(fā)熱惡風(fēng)、頭痛鼻塞、咽喉腫痛［1］。方中柴胡、山銀花疏散退熱，共為君藥；葛根解肌退熱，青蒿退虛熱，連翹、黃芩清熱解毒，共為臣藥；桔梗、苦杏仁宣降肺氣以止咳化痰，薄荷腦芳香辛散，共為佐藥，諸藥合用，共奏清熱解表、止咳化痰之功效。感冒止咳顆粒收載于2015 年版《中國(guó)藥典》，但僅以黃芩苷為定量測(cè)定的指標(biāo)成分，而相關(guān)報(bào)道也只主要針對(duì)其中1～3 種成分［2-6］。

中藥復(fù)方制劑組成復(fù)雜，單一成分檢測(cè)難以有效控制其質(zhì)量和療效的穩(wěn)定性，多指標(biāo)成分測(cè)定已成為相關(guān)質(zhì)量評(píng)價(jià)的發(fā)展趨勢(shì)。感冒止咳顆粒中君藥山銀花主要有效成分為有機(jī)酸類，包括綠原酸、異綠原酸、咖啡酸等［7-8］；臣藥葛根主要含有異黃酮類，包括葛根素、大豆苷元等［9］，青蒿所含成分主要為揮發(fā)油類、香豆素類、苯丙酸類，其中綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸為苯丙酸類代表性物質(zhì)［10-11］，連翹主要有效成分為連翹苷、連翹酯苷A［12］，黃芩主要活性化合物有黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素等［13］。本實(shí)驗(yàn)建立HPLC 法同時(shí)測(cè)定感冒止咳顆粒中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、葛根素、連翹酯苷A、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素的含有量，以期為該制劑質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀，配置G1311B 四元泵、G1329B 自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A 柱溫箱、G1315D DAD 檢測(cè)器（美國(guó)Agilent Technologies 公司）；XSE-205 電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-300DE 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q 超純水處理系統(tǒng)（美國(guó)Millipore 公司）。

1.2 試劑與藥物 綠原酸（批號(hào)110753-201716，純度99.3%）、葛根素（批號(hào)110752-201615，純度95.4%）、連翹酯苷A（批號(hào)111810-201606，純度93.4%）、異綠原酸C（批號(hào)111894-201102，純度94.1%）、黃芩苷（批號(hào)110715-201619，純度93.5%）、漢黃芩苷（批號(hào)112002-201702，純度95.9%）、黃芩素（批號(hào)111595-201607，純度98.5%）對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；新綠原酸（批號(hào)18031001，純度99.67%）、隱綠原酸（批號(hào)18032403，純度99.07%）、異綠原酸A（批號(hào)18032601，純度98.82%）對(duì)照品均購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司。小兒解表顆粒（批號(hào)ZBB1916、ZBB1909，云南白藥集團(tuán)股份有限公司），批號(hào)180502 的購(gòu)自江西銅鼓仁和制藥有限公司，批號(hào)1811016 的購(gòu)自太極集團(tuán)四川綿陽(yáng)制藥有限公司。乙腈為色譜純（德國(guó)Merck 公司）；磷酸、甲醇為分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脫（0～20 min，8%～16%A；20～25 min，16%～20%A；25～35 min，20%～30%A；35～50 min，30%～40%A；50～50.1 min，40%～8% A；50.1～55 min，8% A）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)326 nm（0～15.5 min）、250 nm（15.5～20 min）、326 nm（20～35 min）、278 nm（35～55 min）；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取對(duì)照品新綠原酸5.57 mg、綠原酸7.43 mg、隱綠原酸7.03 mg、葛根素8.02 mg、連翹酯苷A 10.17 mg、異綠原酸A 6.37 mg、異綠原酸C 7.36 mg、漢黃芩苷9.14 mg、黃芩素5.67 mg，置于25 mL 量瓶中，70%甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，作為貯備液；精密稱取黃芩苷對(duì)照品3.81 mg，置于25 mL 量瓶中，精密吸取上述貯備液（新綠原酸2 mL、綠原酸2 mL、隱綠原酸3 mL、葛根素4 mL、連翹酯苷A 2 mL、異綠原酸A 1 mL、異綠原酸C 1.5 mL、漢黃芩苷2 mL、黃芩素1 mL）至該量瓶中，振搖，70% 甲醇定容，搖勻，即得（含新綠原酸17.77 μg／mL、綠原酸23.61 μg／mL、隱綠原酸33.43 μg／mL、葛根素48.97 μg／mL、連翹酯苷A 30.40 μg／mL、異綠原酸A 10.07 μg／mL、異綠原酸C 16.62 μg／mL、黃芩苷142.5 μg／mL、漢黃芩苷28.81 μg／mL、黃芩素8.936 μg／mL）。

2.2.2 供試品溶液 取顆粒適量，研細(xì)，取粉末約1.0 g，精密稱定，置于錐形瓶中，精密加入50 mL 70%甲醇，稱定質(zhì)量，超聲（功率300 W、頻率40 kHz）處理30 min，放冷，70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，濾液過(guò)0.45 μm 微孔濾膜，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按處方工藝，分別制備缺山銀花和青蒿、缺葛根、缺連翹、缺黃芩的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3 專屬性試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液各10 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。由此可知，各成分分離效果良好，分離度均大于1.5，陰性無(wú)干擾，表明該方法專屬性良好。

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液1、2、4、6、8、10 mL，置于10 mL 量瓶中，70%甲醇定容，各精密吸取10 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液10 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、葛根素、連翹酯苷A、異綠原酸A、異綠原酸C、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素峰面積RSD 分別為1.08%、0.44%、0.46%、0.27%、0.65%、0.15%、0.20%、0.65%、0.13%、0.73%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液（批號(hào)1811016），于0、4、8、16、24、36 h 在“2.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣10 μL 測(cè)定，測(cè)得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、葛根素、連翹酯苷A、異綠原酸A、異綠原酸C、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素峰面積RSD 分別為1.67%、1.22%、0.67%、0.69%、1.34%、1.13%、0.54%、0.37%、0.93%、1.76%，表明溶液在36 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品6 份（批號(hào)1811016），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣10 μL 測(cè)定，測(cè)得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、葛根素、連翹酯苷A、異綠原酸A、異綠原酸C、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素含有量RSD 分別為1.25%、0.55%、0.43、0.32%、2.23%、1.80%、1.04%、0.67%、0.37%、2.12%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取各成分含有量已知的同一批顆粒（批號(hào)1811016），研細(xì)，取粉末約0.5 g，精密稱定，共6 份，精密加入對(duì)照品溶液（0.153 1 mg／mL 新綠原酸2 mL、0.206 9 mg／mL綠原酸2 mL、0.250 8 mg／mL 隱綠原酸2 mL、0.301 1 mg／mL 葛根素2 mL、0.190 0 mg／mL 連翹酯苷A 1 mL、0.150 6 mg／mL 異綠原酸A 1 mL、0.312 4 mg／mL 異綠原酸C 1 mL、0.219 9 mg／mL黃芩苷10 mL、0.199 2 mg／mL 漢黃芩苷2 mL、0.088 62 mg／mL 黃芩素1 mL），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣10 μL 測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、葛根素、連翹酯苷A、異綠原酸A、異綠原酸C、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素平均加樣回收率分別為99.54%、101.25%、99.89%、98.05%、99.69%、99.51%、99.07%、101.75%、101.95%、101.09%，RSD 分別為2.05%、1.07%、1.10%、0.45%、1.85%、2.07%、1.87%、1.65%、1.41%、2.28%。

2.9 樣品含有量測(cè)定 精密稱取4 批顆粒，每批3 份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣10 μL 測(cè)定，計(jì)算含有量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各成分含有量測(cè)定結(jié)果（mg／g，n＝3）Tab.2 Results of content determination of various constituents（mg／g，n＝3）

3 討論

3.1 指標(biāo)成分選擇 本實(shí)驗(yàn)曾考察了感冒止咳顆粒另一君藥柴胡中柴胡皂苷a［14］，發(fā)現(xiàn)其含有量較低，甚至有些樣品未檢出，故未予以考慮。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，連翹中連翹苷含有量低，均勻性差，故選擇另一指標(biāo)性成分連翹酯苷A。最終，選擇新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、葛根素、連翹酯苷A、異綠原酸A、異綠原酸C、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素作為指標(biāo)成分，涵蓋了感冒止咳顆粒君藥、臣藥，能較全面地反映其質(zhì)量。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇 本實(shí)驗(yàn)采用DAD 檢測(cè)器在200～400 nm 范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，并采集光譜圖。結(jié)果，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、連翹酯苷A 在326 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收，葛根素在250 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收，黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素278 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收，故選擇326 nm 作為新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、連翹酯苷A 檢測(cè)波長(zhǎng)，250 nm 作為葛根素檢測(cè)波長(zhǎng)，278 nm 作為黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 色譜條件優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)首先考察了Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）、Waters Symmetry-C18色譜柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）、Thermo Hypersil Gold-C18色譜柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），發(fā)現(xiàn)以 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱分離效果最好，色譜峰對(duì)稱性理想。再考察了流動(dòng)相乙腈-水、乙腈-0.1% 乙酸、乙腈-0.1%磷酸、甲醇-0.2% 磷酸［15-16］，發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.1%磷酸洗脫時(shí)各成分達(dá)到了理想的分離效果，色譜峰對(duì)稱性良好，故選擇其作為流動(dòng)相。

3.4 含有量分析 表3 顯示，感冒止咳顆粒（批號(hào)180502）中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、葛根素、連翹酯苷A 含有量較低，故為了保證產(chǎn)品質(zhì)量、臨床療效穩(wěn)定性，建議將山銀花、葛根、連翹指標(biāo)性成分納入該制劑定量測(cè)定中。