熒光法測定人血液和尿液中的美托拉宗和纈沙坦：從零階校正到二階校正的比較

摘要 提出了一種二階校正輔助的三維熒光方法，對人血清和尿液中的兩種抗高血壓藥物美托拉宗（MET）和纈沙坦（VAL）同時進行定性和定量分析，并與零階和一階校正方法所獲得的定量結(jié)果進行比較。結(jié)果表明，基于零階和一階校正方法不適用于光譜嚴重重疊和未知干擾共存條件下目標物的精準定量分析。然而，基于交替歸一加權(quán)殘差（ANWE）算法的二階校正方法具有強大的“數(shù)學分離”功能，即使在目標分析物和未知干擾物熒光光譜嚴重重疊的情況下，仍然能夠獲得令人滿意的結(jié)果，利用其分析MET 和VAL 的相關(guān)系數(shù)均大于0.99， MET 和VAL 在血清中的平均回收率分別為104.9%±5.7%和107.8%±9.2%，在尿液中的平均回收率分別為103.7%±8.9%和94.7%±3.8%。考察了本方法的靈敏度（SEN）、選擇性（SEL）、檢出限（LOD）、定量限（LOQ）、重復性和再現(xiàn)性，結(jié)果表明，本方法能夠?qū)崿F(xiàn)人體液中MET 和VAL 的同時準確定量分析，并有望應用于兩種藥物的臨床分析。

關(guān)鍵詞 化學計量學；交替歸一加權(quán)殘差算法；三維熒光光譜；美托拉宗；纈沙坦

高血壓是全球過早死亡的主要原因之一，有“無聲殺手”之稱[1]。因此，預防和控制高血壓是公共衛(wèi)生系統(tǒng)中的一個重要挑戰(zhàn)[2]。由于人口增長和老齡化問題，高血壓患者人數(shù)僅在幾十年間就增加了兩億多[3]。目前，使用單一藥物常常難以控制血壓，多數(shù)情況下需要聯(lián)合2 種或3 種藥物。利尿劑和血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑是目前有效的組合之一[4]。血管緊張素Ⅱ是造成高血壓的一種重要激素，受體拮抗劑能夠阻斷其以達到降血壓的效果[5]；噻嗪類利尿劑通過作用于遠端小管發(fā)揮其主要作用[6]。纈沙坦（Valsartan， VAL）是一種口服的強活性、特異性血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑，適用于治療單純高血壓、單純收縮期高血壓和心力衰竭。美托拉宗（Metolazone， MET）是一種可抑制遠端小管中鈉離子重吸收的噻嗪類利尿劑，可以促進鈉和水的排泄[7]。MET和VAL聯(lián)合用藥已被證明是一種治療高血壓的有效手段[8]，二者的結(jié)構(gòu)式見圖1。

目前，有關(guān)MET 的分析方法主要有同步熒光光譜法[9]和色譜法[10]，不同基質(zhì)中VAL 的分析方法主要有分光光度法[11]、熒光光譜法[12]和色譜法[13]。然而，目前報道的可同時對MET 和VAL 進行分析研究的方法僅有液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[8]和同步熒光光譜法[4]。色譜分離與質(zhì)譜檢測方法費時費力，通常需要消耗大量的有機溶劑，并且色譜條件的優(yōu)化也比較繁瑣[14]。同步熒光光譜法中Δλ的優(yōu)化也十分耗時；同時，背景基質(zhì)的變化會影響Δλ的選擇，直接影響到熒光光譜的形狀、帶寬和信號強度。因此，開發(fā)一種簡單、快速以及適用性強的分析方法用于MET 和VAL 的同時定性和定量分析十分必要。近年來，隨著化學計量學的飛速發(fā)展，二階校正與三維熒光光譜相結(jié)合的方法已廣泛應用于醫(yī)藥[15]、食品[16]和環(huán)境[17]等多個領(lǐng)域。二階校正算法憑借其“二階優(yōu)勢”[18]實現(xiàn)了在有熒光干擾物共存和嚴重光譜重疊的情況下對目標分析物同時進行定性和定量分析。然而， MET 和VAL 兩種化合物都具有內(nèi)源性熒光，但VAL 的熒光強度比MET 弱很多，這使得在復雜基質(zhì)中對二者濃度進行同時測量的難度增加。

本研究提出了一種激發(fā)發(fā)射矩陣熒光結(jié)合二階校正的方法，對人血清和尿液中MET 和VAL 的含量進行同時、快速和準確的測定，并將其與零階和一階校正方法的定量結(jié)果進行了比較。在已有文獻方法的基礎(chǔ)上[4]，通過加入0.1 mol/L 乙酸增強VAL 的熒光強度。在未進行復雜預處理的情況下，將交替歸一加權(quán)殘差（ANWE）算法與三維熒光光譜數(shù)據(jù)相結(jié)合，利用“數(shù)學分離”代替?zhèn)鹘y(tǒng)的“物理或化學分離”，實現(xiàn)了復雜基質(zhì)中抗高血壓藥物MET 和VAL 的定性和定量分析。具體的實驗流程如圖2 所示。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

所有的激發(fā)發(fā)射矩陣熒光均采用配有150 W 氙燈的F-7000 熒光分光光度計（日本日立公司）進行測量，熒光儀器參數(shù)設置如下：激發(fā)和發(fā)射波長分別為200～450 nm 和250～550 nm（間隔均為2 nm）；檢測電壓為700 V；掃描速度為12000 nm/min；激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm。對于零階校正， MET 的激發(fā)和發(fā)射波長分別選擇245 和437 nm， VAL 的激發(fā)和發(fā)射波長分別選擇260 和375 nm。對于一階校正，MET 和VAL 的激發(fā)波長均選擇240 nm，發(fā)射波長范圍選擇380～500 nm。

美托拉宗（MET， 98.5%）和纈沙坦（VAL，≥99%）標準品購于湖南康合益生物科技有限公司；乙酸（99.7%）購于麥克林生化有限公司；甲醇（色譜級）和人血清購于瑞典Oceanpak 化學公司；人尿樣取自健康的志愿者。分別將血清和尿液中加入一定體積比（ 1∶3）的甲醇進行去蛋白操作，在4000 r/min 條件下離心15 min，上清液過0.45 μm 尼龍濾膜，待用。

1.2 實驗設計

分別稱取1.09 mg MET 和1.17 mg VAL，用甲醇溶解并定容，配制MET 和VAL 儲備液，于4 ℃密封保存。MET 和VAL 工作液用0.1 mol/L 乙酸稀釋至所需濃度，現(xiàn)配現(xiàn)用，濃度線性范圍分別選擇50～500 ng/mL 和30～300 ng/mL，具體濃度設計見表1。

此外，設計了血清加標預測集（S01～S04）和尿液加標預測集（U01～U04），分別配制低、中、高不同濃度的4種混合液，每個目標分析物的加標濃度均在校準線性范圍內(nèi)。血清和尿液分別稀釋300和3000倍，并分別加入10 和100 μL 的尿液和血清至對應的樣本中。制備兩組真實樣本用于評估方法的檢出限（LOD）和定量限（LOQ），即血清真實樣本（S001～S003）和尿液真實樣本（U001～U003）。實驗前、中、后共掃描3 次空白溶劑（0.1 mol/L 乙酸溶液），用于扣除背景。

1.3 偏最小二乘回歸（PLSR）

PLSR 是一種經(jīng)典的一階校正算法，不同于主成分回歸法的主要之處在于PLSR 不但對混合物量測矩陣Y 進行正交分解，還選取其中的主成分進行回歸分析，而且在分解Y 的同時將濃度矩陣C 也進行正交分解，因此，濃度矩陣的主成分也被分離出來。在分解Y 矩陣時考慮C 矩陣的因素，在分解C 矩陣時考慮Y 矩陣的因素，加強雙方回歸對應計算的關(guān)系，以求獲得最佳回歸預測的效果。

1.4 三線性成分模型

采用熒光分光光度計對單個樣本進行分析時，每個樣本都可以產(chǎn)生一個I×J 大小的二維熒光數(shù)據(jù)矩陣， I 和J 分別代表激發(fā)波長和發(fā)射波長的數(shù)量。將校正樣和預測樣共獲得的K 個二維樣本沿著樣本維度依次進行堆疊構(gòu)成一個大小為I×J×K 的三維數(shù)據(jù)陣列X。當此模型存在內(nèi)在的三線性結(jié)構(gòu)時，每個元素XI×J×K 均可以被表示為：

其中， xijk 代表的是第k 個樣本在第i 個激發(fā)波長下和第j 個發(fā)射波長下的熒光響應強度。N 代表所有有熒光響應的組分數(shù)量，當N 被適當給定后， 3 個有化學意義的信息矩陣（AI×N、BJ×N 和CK×N）能夠從被三線性模型分解的XI×J×K 中獲取。ain 和bjn 分別代表歸一化激發(fā)光譜矩陣AI×N 和歸一化發(fā)射光譜矩陣BJ×N 中的元素， ckn 代表相對濃度矩陣CK×N 中的元素。三維殘差矩陣EI×J×K 中的元素采用eijk 表示。

1.5 交替歸一加權(quán)殘差算法

ANWE 算法由Xia 等[19]于2008 年首次提出，該算法基于三線性成分模型，是迭代二階校正算法之一，通過交替最小二乘原理使以下3 個目標函數(shù)最小化：

通過固定相對激發(fā)光譜矩陣A 和相對發(fā)射矩陣B 使S（C）最小化，固定B 和C 使S（A）最小化，固定A 和C 使S（B）最小化，得到的輪廓矩陣A、B 和C 的解為：

當DA=diag（sqrt（1./diagm（A+（AT）+）））、DB=diag（sqrt（1./diagm（B+（BT）+）））、DC=diag（sqrt（1./diagm（C+（CT）+）））時，基于三線性分解的唯一性，目標分析物相對應的列能夠在迭代收斂之后從矩陣A、B 和C 中獲取。通過將每種分析物的相對濃度與實際濃度進行線性回歸，從而估計未知樣品的濃度。

1.6 二階校正方法的分析品質(zhì)因子

考察了二階校正方法的分析品質(zhì)因子，包括靈敏度（SEN）、選擇性（SEL）、檢出限（LOD）和定量限（LOQ）。SEN 是單位濃度分析物的凈分析信號，而SEL 則是靈敏度與總信號的比值。對于二階校正，各分析物的SEN 和SEL 可通過以下的公式計算：

其中，“nn”表示選擇第n 個分析物對應的第（n，n）個元素；上標–1 表示求矩陣的逆；sn 是單位濃度下組分n 的總信號；符號*表示矩陣的Hadamard 積。Aexp 和Bexp 是目標分析物在各個維度的光譜矩陣；Pa， unx = I – AunxAu+nx， Pb， unx = I – BunxBu+nx，其中， Aunx和Bunx是未知干擾成分在各維度的光譜矩陣， I表示同維度的單位陣，+表示求矩陣的廣義逆。

LOD 和LOQ 可分別通過式（10）和式（11）進行計算：

LOD = 3. 3s（c） （10）

LOQ = 10s（c） （11）

其中， s（c）是預測濃度的標準差，可通過公式（12）計算：

其中， h 是零分析物濃度的樣品杠桿， sC2是校正濃度的方差， sX2是儀器信號的方差。

2 結(jié)果與討論

2.1 光譜性質(zhì)

在所測量的激發(fā)和發(fā)射波長范圍內(nèi)，存在的輕微拉曼散射和嚴重的瑞利散射均影響目標分析物的信號。使用ANWE 算法的前提是數(shù)據(jù)必須具備嚴格的三線性結(jié)構(gòu)，而散射信號的存在通常會使激發(fā)發(fā)射矩陣（EEM）熒光數(shù)據(jù)的三線性結(jié)構(gòu)遭到破壞。因此，在使用二階校正算法對EEM 熒光數(shù)據(jù)進行分析之前，需要對數(shù)據(jù)進行預處理。通常采用扣除3 個空白背景信號的平均值去除低強度的拉曼散射，再使用插值的方法消除瑞利散射。數(shù)據(jù)扣除和擬合的具體過程如圖3 所示。

圖4 分別為MET、VAL、校正樣本C06 和加標血清樣本（S03）的熒光光譜圖。由圖4A 可見， MET的最大激發(fā)波長約在245 nm 處，在280 和340 nm 左右還存在相對較弱的激發(fā)峰，最大發(fā)射波長約為437 nm。由圖4B 可見， VAL 的最大激發(fā)和發(fā)射波長分別在260 和375 nm 左右。此外，由圖4C 和圖4D可明顯看出， MET 和VAL 二者的激發(fā)和發(fā)射光譜嚴重重疊，并且與血清的內(nèi)源性熒光干擾物也存在重疊。

為了獲得最佳預測結(jié)果，分別對零階、一階和二階校正方法進行考察。對于零階校正方法而言，為了盡可能避開干擾物的影響，選擇MET 的激發(fā)和發(fā)射波長分別為245 和437 nm， VAL 的激發(fā)和發(fā)射波長分別為260 和375 nm，并采用標準曲線法對濃度進行線性回歸?；谝浑A校正方法， MET 和VAL 均選取240 nm 激發(fā)波長下的380～500 nm 的發(fā)射波長范圍，將兩個目標分析物所得到的預測濃度與真實濃度進行回歸。在二階校正方法中，選擇激發(fā)波長和發(fā)射波長范圍分別為200～450 nm 和250～550 nm，通過ANWE 算法對MET 和VAL 進行定量分析。

2.2 零階校正和一階校正的定量結(jié)果

在零階校正過程中，通過對MET 和VAL 的熒光強度和濃度進行線性回歸，得到兩個分析物的濃度與體系熒光強度的關(guān)系曲線（圖5A 和5B）。隨著MET 或VAL 濃度的增加，熒光強度均逐漸增強。在50～500 ng/mL 和30～300 ng/mL 濃度范圍內(nèi)， MET 和VAL 的濃度與熒光強度呈線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)（r）分別為0.9570 和0.9697，這主要是在混標樣本中未能完全避免MET 和VAL 的光譜重疊問題所致。MET 和VAL 在實際樣本中的回收率分別為62.9%～122.2%和107.2%～137.5%，預測均方根誤差（RMSEP）范圍為44.1～85.8 ng/mL，具體結(jié)果見表2。

基于PLSR 對MET 和VAL 的預測濃度與真實濃度進行線性回歸，關(guān)系曲線分別如圖5C 和5D 所示。由表2 可知，在所選濃度范圍內(nèi)，基于PLSR 算法的一階校正方法獲得的線性關(guān)系比零階校正的結(jié)果好，MET 和VAL 獲得的相關(guān)系數(shù)r 分別為0.9935 和0.9947，說明PLSR 適用于無干擾情況下信號重疊的目標成分定量分析。MET 和VAL 在實際樣中的加標回收率分別為86.7%～106.5%和101.5%～122.8%，RMSEP 范圍為18.6～34.9 ng/mL。

加標回收實驗結(jié)果表明，零階校正和一階校正中均存在回收率小于90.0%和大于120.0%的值，并且零階和一階校正方法得到的RMSEP 結(jié)果均不理想。這是因為在實際情況下，通常無法避免存在未知干擾物質(zhì)，如果不進行適當?shù)念A處理將其響應信號完全地與目標分析物分離且去除，基于零階和一階校正的分析方法將不適用或者無法得到令人滿意的解析結(jié)果。

2.3 二階校正方法用于人體液中MET 和VAL 的同時定量分析

能夠?qū)嶋H樣本進行預測的重要前提是具有一個性能良好的校正模型。通過構(gòu)建7 個校正樣本（C01～C07）獲得的統(tǒng)計參數(shù)和平均回收率驗證模型是否存在良好的性能。MET 和VAL 的平均加標回收率分別為102.4%±9.5%和101.9%±7.3%，相關(guān)系數(shù)r 分別為0.9984 和0.9983，均高于0.99，校正均方根誤差（RMSEC）分別為9.1 和5.6 ng/mL。上述結(jié)果表明，兩種分析物均表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，建立的校正模型能對實際樣本進行有效預測。

在使用ANWE 算法分析之前，需要估計組分數(shù)以獲得更合理的解析結(jié)果。首先采用核一致診斷法（CORCONDIA）[20]對最佳組分數(shù)進行估計，最終選取的組分數(shù)為3，表明除MET 和VAL 外，還存在一種熒光干擾物。即使是在分析物與基質(zhì)的光譜嚴重重疊的情況下，使用ANWE 算法仍然可以實現(xiàn)準確的定量分析。圖6 為人血清和尿液中MET 和VAL 的歸一化激發(fā)光譜圖（圖6A1 和6A2）、歸一化發(fā)射光譜圖（圖6B1 和6B2）和相對濃度圖（圖6C1 和6C2），其中，圖6A1、6B1 和6C1 為MET 和VAL 在血清基質(zhì)中的解析結(jié)果，圖6A2、6B2 和6C2 是在尿液基質(zhì)中的解析結(jié)果。雖然兩種目標分析物和干擾物之間的光譜嚴重重疊，但所提出的方法能夠提取出每個目標分析物的純激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，并且解析光譜（實線）與真實光譜（虛線）幾乎完全重合，表明二階校正算法獲得的結(jié)果可信，能夠?qū)崿F(xiàn)復雜基質(zhì)中目標分析物MET 和VAL 的精準定量分析。

通過ANWE 解析獲得的MET 和VAL 的最大激發(fā)波長分別為245 和260 nm，最大發(fā)射波長分別為437 和380 nm。將解析的相對濃度矩陣C 與目標分析物的真實濃度進行線性回歸，得到MET 和VAL 的定量分析結(jié)果。表3 為基于ANWE 算法得到的人血清和尿液實際樣本中MET 和VAL 的預測結(jié)果。在血清加標樣本中， MET 和VAL 的平均回收率分別為104.9%±5.7%和107.8%±9.2%， RMSEP 為12.0 和7.3 ng/mL。對于尿液加標樣本， MET 和VAL 的平均回收率分別為103.7%±8.9%和94.7%±3.8%，RMSEP 為9.3 和15.7 ng/mL。平均回收率均接近100%，考慮到光譜的重疊以及基質(zhì)的復雜性，預測結(jié)果完全可以接受。因此，三維熒光結(jié)合ANWE 算法可用于復雜體系中MET 和VAL 的同時、快速、準確的定量分析。

盡管本研究已選擇了較合適的激發(fā)和發(fā)射波長（零階校正）或特定激發(fā)波長下的發(fā)射波長范圍（一階校正），但都無法完全避免背景干擾和光譜重疊問題，導致RMSEP 不太令人滿意。零階校正方法只適用于無干擾存在的單個組分的分析。一階校正雖然一次能夠?qū)崿F(xiàn)多種成分的同時分析，但在干擾存在的情況下也不能獲得滿意的定量分析結(jié)果。所以，使用零階和一階校正方法之前通常都要對分析體系進行預處理（分離或掩蔽等），對于零階校正要獲得各分析物完全選擇性信號，而對于一階校正要保證各分析物信號不受未知干擾信號的影響。然而，基于ANWE 算法的二階校正方法憑借其“二階優(yōu)勢”，能夠通過“數(shù)學分離”解決上述問題。即使在未知干擾存在的情況下， ANWE 算法也能夠準確解析出混合熒光信號中每種響應物質(zhì)的純信號，實現(xiàn)對MET 和VAL 的同時且準確的定量分析。因此，可將二階校正輔助三維熒光法作為同時定量分析人體液中MET 和VAL 的推薦方法。但是，零階校正方法和一階校正方法所需要的數(shù)據(jù)類型更簡單，對儀器要求更低。

2.4 品質(zhì)因子分析和日內(nèi)日間精密度

為了評估所提方法的定量性能，計算了有關(guān)品質(zhì)因子（Figures of merits， FOMs）[21]，包括SEN、SEL、LOD 和LOQ。由表4 可知， MET 和VAL 在血清中的靈敏度均高于尿液，這可能與目標分析物和干擾物之間的光譜重疊程度有關(guān)。VAL 的SEN 和SEL 都低于MET，主要與單位濃度下VAL 的熒光響應信號低于MET 有關(guān)。兩個分析物的LOD 均不高于1.23 ng/mL， LOQ 不超過3.74 ng/mL，所有結(jié)果都滿足分析要求。通過FOMs 驗證，結(jié)果表明，基于ANWE 算法能夠同時檢測人血清和尿液中的MET 和VAL。

日內(nèi)精密度和日間精密度常用于驗證方法的重復性和再現(xiàn)性。制備了不同濃度加標樣品（S01～S04、U01～U04），在1 d 內(nèi)測量同一個預測樣本3 次以計算日內(nèi)精密度；采用相同的方法連續(xù)3 d 測量同一個樣本，計算日間精密度，結(jié)果見表4。在血清基質(zhì)中， MET 和VAL 的日內(nèi)精密度分別為2.58%和3.28%，日間精密度分別為4.48%和5.45%。對于尿液基質(zhì)， MET 和VAL 的日內(nèi)和日間精密度均不高于5.23%。上述研究結(jié)果表明，使用ANWE 算法對人血清和尿液中的MET 和VAL 進行定量分析具有良好的重復性和再現(xiàn)性。

3 結(jié)論

建立了一種基于ANWE 算法的三維熒光二階校正法，實現(xiàn)了人血清和尿液中MET 和VAL 的同時準確定量分析，并將本方法與零階和一階校正方法所獲得的定量結(jié)果進行了比較。結(jié)果表明，零階校正方法只適用于無干擾存在下的單個成分的定量分析；一階校正雖然一次能夠?qū)崿F(xiàn)多個成分的同時定量分析，但也不適用于實際樣中存在未知干擾信號重疊的情況；二階校正方法具有“二階優(yōu)勢”，即使目標分析物與未知干擾物的熒光光譜存在嚴重重疊，也能夠獲得令人滿意的定性和定量結(jié)果。本方法簡化了分析過程，同時具有高靈敏度、低檢出限、低成本和“綠色環(huán)?！钡葍?yōu)勢，有望應用于臨床診斷，為高血壓患者血清和尿液中MET 和VAL 的快速、準確監(jiān)測提供了可能。

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國家自然科學基金項目（Nos. 22174036， 22204049， 21775039）資助。