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    木犀草素抑制結(jié)直腸癌SW620 細(xì)胞生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)組學(xué)機(jī)制研究

    2025-03-15 00:00:00趙佳威孟波陸澳韓梓星葉子弘趙洋
    分析化學(xué) 2025年2期

    摘要 隨著結(jié)直腸癌發(fā)病率的持續(xù)攀升,患者群體呈年輕化趨勢(shì)?,F(xiàn)有治療方案雖然能延長(zhǎng)生存期,卻不可避免地帶來(lái)嚴(yán)重的副作用,因此,開(kāi)發(fā)新型治療策略勢(shì)在必行。木犀草素(Luteolin, LUT)作為天然草藥活性成分,其廣譜抗腫瘤效應(yīng)在多種癌癥研究中得到了證實(shí),然而其對(duì)結(jié)直腸癌的作用機(jī)制尚未明確。本研究從蛋白質(zhì)組-糖蛋白質(zhì)組協(xié)同調(diào)控角度揭示了LUT 對(duì)結(jié)直腸癌SW620 細(xì)胞的分子作用機(jī)制。采用蛋白質(zhì)組學(xué)分析鑒定出472 個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。功能富集分析顯示,下調(diào)蛋白質(zhì)主要參與氧化應(yīng)激反應(yīng)、mRNA處理、RNA 剪接以及肌動(dòng)蛋白纖維組織等關(guān)鍵生物過(guò)程,并涉及氧化磷酸化和過(guò)氧化物酶體通路;而上調(diào)蛋白質(zhì)則主要參與DNA 復(fù)制、蛋白質(zhì)折疊及rRNA 代謝等過(guò)程,與DNA 復(fù)制和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)加工通路密切相關(guān)。在糖蛋白質(zhì)組學(xué)層面,本研究發(fā)現(xiàn)了231 條差異表達(dá)的完整N-糖肽。對(duì)應(yīng)糖蛋白的功能富集分析表明, LUT 可能通過(guò)調(diào)節(jié)核組織、核膜組織和Fc 受體介導(dǎo)的刺激信號(hào)通路等生物過(guò)程,以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工和N-糖基化生物合成通路發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。關(guān)鍵互作網(wǎng)絡(luò)分析鑒定出5 個(gè)核心靶蛋白,分別為RPS15A、WDR43、FBL、UTP18 和UTP11,這些蛋白缺失已被證實(shí)可抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖和遷移。值得注意的是,溶酶體相關(guān)膜蛋白LAMP1 和LAMP2 的糖基化修飾改變提示LUT 可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞器動(dòng)態(tài)影響腫瘤轉(zhuǎn)移潛能。本研究結(jié)果揭示了LUT 可通過(guò)特異性調(diào)控蛋白表達(dá)網(wǎng)絡(luò)與糖基化修飾模式雙重機(jī)制抑制結(jié)腸癌細(xì)胞惡性表型,為基于天然產(chǎn)物的結(jié)直腸癌精準(zhǔn)治療提供了新型分子靶標(biāo)和理論依據(jù)。

    關(guān)鍵詞 結(jié)直腸癌;木犀草素;蛋白質(zhì)組學(xué);糖蛋白質(zhì)組學(xué)

    根據(jù)2024 年美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)報(bào)告,結(jié)直腸癌在男女新發(fā)癌癥中均居第三位,占新發(fā)癌癥病例的7.64%。結(jié)直腸癌死亡病例數(shù)在男性癌癥死亡病例中排名第三,在女性中排名第四,占所有癌癥相關(guān)死亡人數(shù)的8.67%[1]。值得注意的是, 55 歲以下人群中的發(fā)病率和死亡率正以每年1%~2%的速度上升[1-2]。在中國(guó),結(jié)直腸癌的平均存活率為56.9%,其中早期患者的五年相對(duì)存活率高達(dá)90%,而晚期轉(zhuǎn)移患者僅為14%[2-3]。目前,腸鏡檢查雖為金標(biāo)準(zhǔn),但其侵入性強(qiáng),不適于早期篩查[4],且缺乏可靠的生物標(biāo)志物,導(dǎo)致多數(shù)患者確診時(shí)已出現(xiàn)嚴(yán)重癥狀。盡管手術(shù)聯(lián)合放化療及靶向藥物(如貝伐珠單抗和帕尼圖單抗等)的應(yīng)用改善了患者預(yù)后[5-9],但藥物不良反應(yīng)等問(wèn)題仍亟待解決。

    植物源化合物因其獨(dú)特的生物活性在癌癥治療中展現(xiàn)出巨大的潛力[10-13],尤其在增強(qiáng)化療敏感性方面表現(xiàn)良好[14]。木犀草素(Luteolin, LUT)作為一種廣泛存在的黃酮類物質(zhì)[15],已被證實(shí)可通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和血管生成發(fā)揮抗癌作用[16-17]。Gao 等[18]研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)LUT 處理48 h 后,口腔癌細(xì)胞(Oral carcinoma 3, OC3)增殖受到顯著抑制;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示, LUT 處理組S 期細(xì)胞比例降至10%(對(duì)照組25%, DMSO 組20%),同時(shí)細(xì)胞遷移能力降低50%(細(xì)胞遷移數(shù)40% vs 80%),證實(shí)其通過(guò)阻滯細(xì)胞周期和抑制遷移發(fā)揮抗癌作用。Huang 等[19]研究發(fā)現(xiàn), LUT 以劑量依賴的方式有效抑制了乳腺癌細(xì)胞系(MDA-MB-231)的增殖和S 期細(xì)胞周期的劑量依賴性停滯。上述研究表明, LUT 對(duì)口腔癌和乳腺癌表現(xiàn)出抗癌特性,但對(duì)結(jié)直腸癌的治療效果的相關(guān)研究較少。

    本研究采用定量蛋白質(zhì)組學(xué)和糖蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),系統(tǒng)分析了LUT 處理對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620 的分子調(diào)控機(jī)制。結(jié)果表明, LUT 處理誘導(dǎo)了顯著的蛋白質(zhì)組重塑和N-糖基化修飾改變?;诨虮倔w論(Gene ontology, GO)和京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)功能富集分析,發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)蛋白質(zhì)和N-糖肽主要富集于細(xì)胞周期調(diào)控等關(guān)鍵通路。本研究為解析LUT抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的分子機(jī)制提供了新的理論依據(jù),同時(shí)揭示了其在癌癥治療中的應(yīng)用潛力。

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 儀器與試劑

    CKX53 細(xì)胞培養(yǎng)倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司);DHP-9052 電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司);Concentrator plus 濃縮儀和ThermoMixer C 金屬?。ǖ聡?guó)Eppendorf 公司);JY92-IIN 超聲波細(xì)胞破碎儀(寧波新芝生物科技公司);HVE50 高壓滅菌鍋(日本Hirayama 公司);Snail Girl LC-4006G 低速離心機(jī)(美國(guó)labyeah 公司);HERACELL 150i 二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱、Multiskan SkyHigh 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀、NanoDrop OneC 微量紫外分光光度計(jì)、Orbitrap Fusion Lumos 三合一高分辨質(zhì)譜儀和Easy nLC1200 納升級(jí)液相色譜儀(美國(guó)賽默飛科技公司)。

    結(jié)直腸癌SW620 細(xì)胞系(北京北納生物公司);DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清(Fetal bovine serum,F(xiàn)BS)(美國(guó)Gibco 公司);磷酸鹽緩沖液(PBS)和0.25%胰蛋白酶溶液(美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司);臺(tái)盼藍(lán)溶液(普諾賽公司);Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒(武漢百瑞極公司);T25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)96 孔板和100 mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿(無(wú)錫NEST 公司);30 kDa 超濾管(美國(guó)Pall Corporation 公司);尿素(≥99%)、二硫蘇糖醇(≥98%)、碘乙酰胺(≥99%)和碳酸氫銨(≥99%)(美國(guó)Sigma Aldrich公司);測(cè)序級(jí)胰蛋白酶(質(zhì)譜純,北京酶知源生物科技有限公司);HILIC 填料(天津博納艾杰爾公司);三氟乙酸(≥99%)、甲酸(gt;99%)、乙腈(質(zhì)譜純)和氨水(≥99%)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司);SDB-RPS 固相萃取盤片(色譜純,美國(guó)3M 公司)。

    1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

    將液氮中凍存的SW620 細(xì)胞于37 ℃水浴中迅速解凍,離心(1000 r/min, 5 min)后棄上清。采用DMEM 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并接種于培養(yǎng)皿,于37 ℃、5% CO2 培養(yǎng)箱中孵育2 h 后更換新鮮培養(yǎng)基。每日觀察細(xì)胞形態(tài),待細(xì)胞密度達(dá)到80%~90%時(shí)進(jìn)行傳代。傳代操作:移除舊培養(yǎng)基后,經(jīng)預(yù)冷PBS 清洗兩次(2 mL/次);加入0.25%胰酶(1 mL)消化3 min,以含血清培養(yǎng)基終止消化反應(yīng);離心收集細(xì)胞沉淀(1000 r/min, 5 min),用DMEM 培養(yǎng)基重懸后按1∶2 比例接種傳代,在37 ℃、5% CO2 條件下培養(yǎng)。

    1.3 CCK8 試驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞增殖情況

    將LUT 采用二甲基亞砜(DMSO)配制成100 mmol/L 的原液,使用DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基將其稀釋至100 μmol/L,于–20 ℃儲(chǔ)存,備用。使用時(shí),用DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基將LUT 稀釋至相應(yīng)的濃度。實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白組、對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組??瞻捉M僅加入DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基,未接種任何細(xì)胞。對(duì)照組:將生長(zhǎng)狀態(tài)良好且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW620 細(xì)胞接種于96 孔板,每孔接種1×104 個(gè)細(xì)胞,培養(yǎng)基為DMEM,按照實(shí)驗(yàn)組的時(shí)間同步更換新的DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)組:將生長(zhǎng)狀態(tài)良好且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW620 細(xì)胞接種于96 孔板,每孔接種1×104 個(gè)細(xì)胞,采用DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)至SW620 細(xì)胞貼壁后,更換培養(yǎng)基為含有不同濃度LUT(0、6.25、12.5、25、50、75 和100 μmol/L)的DMEM 培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,然后每孔加入10 μL CCK-8 溶液,繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h。使用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)量各孔在490 nm 處的光密度(OD)。計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(IC):IC(%)=(OD490 nm對(duì)照細(xì)胞–OD490 nm 處理細(xì)胞)/OD490 nm對(duì)照細(xì)胞×100。半數(shù)最大抑制濃度(IC50)為與對(duì)照細(xì)胞培養(yǎng)相比LUT 產(chǎn)生50%抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的濃度。各實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。

    1.4 LUT 處理SW620 細(xì)胞

    對(duì)照組(Control)的SW620 細(xì)胞在DMEM 養(yǎng)基中培養(yǎng), LUT 組的SW620 細(xì)胞用含有28.20 μmol/LLUT 的DMEM 基培養(yǎng)。Control 組和LUT 組均接種相同密度的SW620 細(xì)胞,加入無(wú)藥物的DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中,在5% CO2 的條件下培養(yǎng)過(guò)夜。然后,將LUT 組的培養(yǎng)基更換為含有28.20 μmol/L LUT 的DMEM 培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48 h。Control 組更換新的DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48 h。為了確保DMSO 不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響,始終保持培養(yǎng)基中DMSO 的濃度在0.1% (V/V)以下。

    1.5 蛋白提取及濃度測(cè)定

    收集細(xì)胞置于無(wú)菌EP 管中,加入540 μL 蛋白裂解液(8 mol/L 尿素),置于超聲細(xì)胞破碎儀中超聲5 min。超聲細(xì)胞破碎儀的程序設(shè)置為:工作2 s,停2 s,功率為25%。超聲完成后,采用超高速離心機(jī),在4 ℃下以14000 r/min(16000 g)離心15 min,收集上清,即為細(xì)胞全蛋白。利用Bradford 法[20]測(cè)定細(xì)胞全蛋白濃度。

    1.6 蛋白的酶切、分餾和完整糖肽的富集

    采用過(guò)濾器輔助樣品制備方案(Filter-aided sample preparation, FASP)[21]酶切樣品蛋白。(1)稱取500 μg 蛋白加入30 kDa 超濾管中,離心,棄去濾液;(2)加入裂解緩沖液(8 mol/L 尿素, 100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.5)離心洗滌;(3)加入10 mmol/L 二硫蘇糖醇(DTT),于37 ℃孵育4 h;(4)離心,棄去上清液,加入50 mmol/L 碘乙酰胺(IAM),室溫下于暗處避光孵育0.5 h;(5)離心,棄去上清液,加入10 mmol/LDTT 室溫避光放置15 min, 離心,棄去上清液;(6)分別加入尿素溶液和50 mmol/L 碳酸氫銨(ABC)洗滌3 次,更換新套管,加入50 mmol/L ABC 溶解的20 μg 胰蛋白酶, 37 ℃孵育16 h;(7)反應(yīng)結(jié)束后離心,收集肽段,依次加入ddH2O 和50 mmol/L ABC 洗滌超濾管,離心收集洗脫液;(8)用SpeedVac 真空干燥離心機(jī)(Eppendorf)干燥肽段;(9)肽段使用0.1%甲酸(FA)/ddH2O 溶解,采用NanoDrop 測(cè)定其濃度,取50 μg肽段使用SpeedVac真空干燥離心機(jī)干燥,于–80 ℃凍存。

    采用SDB-RPS 進(jìn)行分餾。首先,取5 層SDB-RPS 膜加入Tip 柱中;然后,將50 μg 上述凍存的肽段用0.2% TFA 溶解,并加至SDB-RPS-Tip 柱中;接著加入0.2% TFA 洗滌一次;依次用100 mmol/L 甲酸銨/40%ACN/0.5%FA、150 mmol/L 甲酸銨/60%ACN/0.5%FA 和80%ACN/5%NH3H2O 洗脫。洗脫的肽段溶液在真空離心濃縮儀中45 ℃、V-HV 模式下熱干回收,隨后在–80 ℃儲(chǔ)存,用于后續(xù)LC-MS/MS 分析。HILIC 富集完整糖肽的實(shí)驗(yàn)方案如下:利用0.1% TFA 溶液活化HILIC 填料(5 μm, 100 ?),重復(fù)3 次;然后,使用80% ACN/0.2% TFA 溶液平衡填料,重復(fù)3 次;將熱干的肽段用80% ACN/0.2% TFA 溶液復(fù)溶,加入已平衡好的HILIC 填料,置于室溫旋轉(zhuǎn)混合儀上孵育2 h;將混合物轉(zhuǎn)移到填充有一層C8 膜的Tip 柱中,并利用80% ACN/0.2% TFA 溶液洗滌除去未結(jié)合肽段;更換新離心管,加入0.1% TFA 溶液洗脫收集糖肽,重復(fù)洗脫操作3 次并合并收集液。使用SpeedVac 真空干燥離心機(jī)熱干糖肽,在–80 ℃儲(chǔ)存,待LC-MS/MS 分析。

    1.7 液相色譜及質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置

    使用由EASY-nLC 1200 液相色譜系統(tǒng)和Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 質(zhì)譜儀組成的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)系統(tǒng)進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析。液相色譜流動(dòng)相A 為0.1% FA, B 為80% ACN/0.1% FA。分析柱為實(shí)驗(yàn)室自制C18 柱(30 cm(L)×100 μm(o.d.)×360 μm(i.d.)),填料粒徑為1.9 μm(ReproSil-Pur C18-AQ; Dr. Maisch)。

    1.7.1 蛋白質(zhì)組分析

    將肽段溶于0.1% FA/ddH2O 中,用NanoDrop 測(cè)定其濃度。取1 μg 肽段經(jīng)過(guò)液相加載到分析柱中,采用梯度洗脫:0~5 min, 4%~10% B;5~48 min, 10%~22% B;48~66 min, 22%~35% B;66~76 min,35%~90% B;76%~78 min, 90% B。流速為600 nL/min。

    質(zhì)譜參數(shù)如下:Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 質(zhì)譜儀采用OT(Obitrap)-OT 模式;一級(jí)質(zhì)譜掃描的自動(dòng)增益控制(Automatic Gain Control, AGC)目標(biāo)值為400000;掃描范圍為m/z 350~1550;分辨率為120000;離子最大注入時(shí)間(Maximum injection time, MaxIT)為50 ms。二級(jí)質(zhì)譜掃描AGC 目標(biāo)值為50000;分辨率為15000, MaxIT 為30 ms,使用高能碰撞解離(HCD)對(duì)2~7 電荷的母離子進(jìn)行碎裂,碰撞能量為30%;動(dòng)態(tài)排除時(shí)間為18 s,質(zhì)量數(shù)據(jù)由XCalibur 進(jìn)行實(shí)時(shí)采集。

    1.7.2 糖蛋白質(zhì)組分析

    將肽段溶于0.1% FA/ddH2O 中,使用NanoDrop 測(cè)定其濃度。然后,取1 μg 肽段經(jīng)過(guò)液相加載到分析柱中,采用梯度洗脫:0~8 min, 5%~8% B;8~68 min, 8%~22% B;68~82 min, 22%~32% B;82~88 min,32%~90% B;88~90 min, 90% B。流速為600 nL/min。

    質(zhì)譜參數(shù)如下:Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 質(zhì)譜儀采用OT(Orbitrap)-OT 模式;一級(jí)質(zhì)譜掃描的AGC 目標(biāo)值為400000;掃描范圍m/z 800~2000;分辨率為120000;MaxIT 為100 ms。二級(jí)質(zhì)譜掃描AGC 目標(biāo)值為50000;分辨率為15000, MaxIT 為250 ms,使用HCD 對(duì)2~6 電荷的母離子進(jìn)行碎裂,階梯碰撞能量為20%、30%和40%;動(dòng)態(tài)排除時(shí)間為15 s,質(zhì)量數(shù)據(jù)由XCalibur 進(jìn)行實(shí)時(shí)采集。

    1.8 數(shù)據(jù)處理

    使用MaxQuant(2.0.3.0)軟件[22]解析蛋白質(zhì)組的原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)。用于檢索的數(shù)據(jù)庫(kù)為2023年6月1日從Uniprot[23]下載的Swiss-Prot蛋白庫(kù),包含20422種蛋白質(zhì)。設(shè)定參數(shù)如下:蛋白水解酶為Trypsin/P,最大漏切位點(diǎn)為2;母離子質(zhì)量偏差為20 ppm(10–6),子離子質(zhì)量偏差為4.5 ppm;固定修飾設(shè)定半胱氨酸碘乙酰胺化(Carbamidomethy/+57.021 Da),可變修飾選擇甲硫氨酸氧化(Oxidation/+15.995 Da)和N-乙?;ˋcetyl/+42.011 Da);蛋白和多肽定性假陽(yáng)性率(FDR)為1%,定量方法選擇非標(biāo)定量(Lable free),其它參數(shù)為默認(rèn)參數(shù)。使用pGlyco3[24]解析糖蛋白質(zhì)組質(zhì)譜原始數(shù)據(jù),用于檢索的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)與上述蛋白質(zhì)組質(zhì)譜數(shù)據(jù)檢索使用的一致。設(shè)定參數(shù)如下:固定修飾設(shè)定為半胱氨酸碘乙酰胺化(Carbamidomethy/+57.021 Da),可變修飾選擇甲硫氨酸氧化(Oxidation/+15.995 Da)和N-乙?;ˋcetyl/+42.011 Da)。母離子質(zhì)量偏差(Mass tolerance)為±4 ppm,子離子質(zhì)量偏差(Peptide tolerance)為±20 ppm,允許兩個(gè)漏切位點(diǎn)。完整糖肽鑒定的質(zhì)量控制方法設(shè)置為FDR 小于1%,其它參數(shù)設(shè)置選擇默認(rèn)值。

    蛋白質(zhì)組和糖蛋白質(zhì)組的數(shù)據(jù)使用Perseus 軟件[25]完成數(shù)據(jù)篩選和缺失值填充等差異分析前處理工作。數(shù)據(jù)篩選的條件為至少在一個(gè)實(shí)驗(yàn)組中被鑒定頻率≥3 的蛋白質(zhì)組。缺失值填充的方法:采用Perseus 軟件內(nèi)置的正態(tài)分布法進(jìn)行填補(bǔ),設(shè)置Width 為0.3, Down shift 為1.8,每列分別處理(Mode 為Separately for each column)。蛋白質(zhì)組和糖蛋白質(zhì)組的差異分析均使用Limma[26]R 包完成,選擇p(BH)lt;0.05 和| log2(Fold Change)|≥1.2 為顯著差異表達(dá)蛋白或糖肽。差異基因或差異糖肽對(duì)應(yīng)的基因的GO和KEGG 富集分析使用clusterProfiler 4.0 軟件[27]完成,選擇p(BH)lt;0.05 為顯著富集條目。GO 富集結(jié)果包括細(xì)胞組分(Cellular component, CC)、分子功能(Molecular function, MF)和生物過(guò)程(Biological process,BP)。差異基因或差異糖肽對(duì)應(yīng)的基因使用String 軟件[28]進(jìn)行蛋白互作分析(PPI), Network type 設(shè)置為full STRING network, meaning of network edges 設(shè)置為confidence, minimum required interaction score設(shè)置為0.900(蛋白質(zhì)組)/0.400(糖蛋白質(zhì)組),其它參數(shù)為默認(rèn)值。PPI 網(wǎng)絡(luò)使用Cytoscape 軟件[29]優(yōu)化。關(guān)鍵基因使用cytoHubba 插件[30]篩選。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 LUT 抑制SW620 細(xì)胞的增殖

    設(shè)置空白組、對(duì)照組(Control)和處理組(LUT),系統(tǒng)評(píng)估LUT(圖1A)對(duì)結(jié)直腸癌SW620 細(xì)胞系的抗增殖效應(yīng)。結(jié)果表明,其對(duì)結(jié)直腸癌SW620 細(xì)胞系的抗增殖效應(yīng)呈顯著的劑量依賴性,由LUT 濃度與細(xì)胞存活率之間的劑量-效應(yīng)曲線(圖1B),計(jì)算出LUT 的半抑制濃度(IC50)為28.20 μmol/L。由圖1C的顯微鏡觀察結(jié)果可知,相較于Control 組, LUT 組(28.20 μmol/L)呈現(xiàn)劑量依賴性細(xì)胞數(shù)量減少。對(duì)細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì),發(fā)現(xiàn)Control 組的細(xì)胞數(shù)量明顯多于LUT 組,并且兩組之間的細(xì)胞數(shù)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1D)。

    2.2 Control 組和LUT 組SW620 細(xì)胞的蛋白質(zhì)組及糖蛋白質(zhì)組測(cè)序結(jié)果統(tǒng)計(jì)

    收集Control 與LUT 處理48 h 的SW620 細(xì)胞,每組6 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。FASP 酶解獲得的肽段分成兩份,一份使用SDB-RPS-Tip 分離(50 μg)用于蛋白質(zhì)組分析,另一份使用HILIC 富集(100 μg)用于完整N-糖肽分析。

    在蛋白質(zhì)組分析中,從Control 組中平均鑒定出4825 個(gè)蛋白質(zhì)(4720~4894),顯著高于LUT 組的4613 個(gè)(4519~4695)(圖2A 和2C)。兩組共同鑒定的蛋白質(zhì)有5201 個(gè),占總數(shù)的90.99%;Control 組特有的蛋白質(zhì)為362 個(gè),占6.33%;而LUT 組特有的蛋白質(zhì)為153 個(gè),占2.68%(圖2C)。在肽段層面,兩組樣本鑒定出的肽段數(shù)量基本一致(圖2B)。在糖蛋白質(zhì)組分析中共鑒定出4647 條完整N-糖肽, Control組平均鑒定出1694 條(1550~1829), LUT 組為1632 條(1349~1852)(圖2D 和2E)。兩組共有的糖肽僅占41.87%(2729 條),而Control 與LUT 組特有糖肽分別為1918 條(29.43%)和1871 條(28.71%),表明LUT處理顯著改變了SW620 細(xì)胞的糖基化修飾譜。通過(guò)糖蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組分析結(jié)果的交叉比對(duì)發(fā)現(xiàn),有32.70%的糖蛋白在蛋白質(zhì)組測(cè)序中未被檢測(cè)到(圖2F),凸顯了糖蛋白質(zhì)組學(xué)在全面解析蛋白質(zhì)修飾中的獨(dú)特價(jià)值,同時(shí)也說(shuō)明糖蛋白質(zhì)組測(cè)序?yàn)榈鞍踪|(zhì)組學(xué)分析提供了重要的補(bǔ)充信息。

    2.3 Control 組和LUT 組差異蛋白質(zhì)組分析

    差異蛋白質(zhì)組分析發(fā)現(xiàn)顯著差異表達(dá)上調(diào)蛋白212 個(gè),下調(diào)蛋白260 個(gè)(圖3A)。主成分分析(Principal component analysis, PCA)顯示, Control 組和LUT 組獲得SW620 細(xì)胞的蛋白質(zhì)組有顯著分離,表明LUT 處理顯著改變了SW620 細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)譜(圖3B)。聚類分析進(jìn)一步證實(shí)了兩組樣本的顯著區(qū)分性(圖3C)。

    使用clusterProfile 軟件包對(duì)差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行了GO 和KEGG 富集分析。如圖3D 所示,表達(dá)下調(diào)的蛋白質(zhì)主要參與了mRNA 處理(mRNA processing)、DNA 代謝過(guò)程的調(diào)控(Regulation of DNA metabolicprocess)、RNA 剪接(RNA splicing)和對(duì)氧化應(yīng)激的響應(yīng)(Response to oxidative stress)等生物過(guò)程;分子功能包括DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(DNA-binding transcription factor binding)、轉(zhuǎn)錄共調(diào)控子活性(Transcriptioncoregulator activity)、肌動(dòng)蛋白結(jié)合(Actin binding)和鈣黏蛋白結(jié)合(Cadherin binding)等;主要定位于細(xì)胞-細(xì)胞連接(Cell-cell junction)、線粒體基質(zhì)(Mitochondrial matrix)、肌動(dòng)蛋白骨架(Actincytoskeleton)和細(xì)胞-基質(zhì)連接(Cell-substrate junction)等。如圖3E 所示,表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)主要參與ncRNA 處理(ncRNA processing)、DNA 復(fù)制(DNA replication)、核糖核蛋白復(fù)合體生物生成(Ribonucleoproteincomplex biogenesis)、蛋白質(zhì)折疊(Protein folding)和rRNA 代謝過(guò)程(rRNA metabolic process)等;分子功能涉及作用于RNA 的催化活性(Catalytic activity, acting on RNA)、鈣黏蛋白結(jié)合(Cadherin binding)、ATP 水解活性(ATP hydrolysis activity)和解旋酶活性(Helicase activity)等;定位于核膜(Nuclearenvelope)、線粒體基質(zhì)(Mitochondrial matrix)、染色體區(qū)域(Chromosomal region)、核糖體(Ribosome)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白復(fù)合體(Endoplasmic reticulum protein-containing complex)等。GO 富集分析結(jié)果揭示了許多差異表達(dá)蛋白質(zhì)與細(xì)胞周期緊密相關(guān)。KEGG 分析(圖3F)表明,上調(diào)蛋白質(zhì)主要的信號(hào)通路包括DNA 復(fù)制(DNA replication)、核苷酸切除修復(fù)(Nucleotide excision repair)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工(Protein processing in endoplasmic reticulum)和錯(cuò)配修復(fù)(Mismatch repair)等;下調(diào)蛋白質(zhì)參與的信號(hào)通路包括氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation)、檸檬酸循環(huán)(Citrate cycle)和過(guò)氧化物酶體(Peroxisome)等。以上結(jié)果表明,差異蛋白顯著富集于細(xì)胞周期相關(guān)通路,提示LUT 可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程影響SW620 細(xì)胞增殖。

    2.4 Control 組和LUT 組SW620 細(xì)胞差異糖蛋白質(zhì)組分析

    糖蛋白質(zhì)組差異分析結(jié)果表明, LUT 處理后的SW620 細(xì)胞中,有130 條完整N-糖肽表達(dá)顯著上調(diào),101 條完整N-糖肽表達(dá)顯著下調(diào)(圖4A)。PCA 分析顯示, Control 組與LUT 組在N-糖基化修飾上具有顯著差異(圖4B),且LUT 處理顯著改變了N-糖基化修飾水平(圖4C)。

    對(duì)差異完整N-糖肽對(duì)應(yīng)的糖蛋白進(jìn)行功能注釋。GO 分析結(jié)果顯示,這些蛋白質(zhì)主要參與了細(xì)胞核組織(Nucleus organization)、核膜組織(Nuclear envelope organization)、脯氨酸修飾(Peptidyl-prolinemodification)、蛋白質(zhì)羥基化(Protein hydroxylation)和Fc 受體介導(dǎo)的刺激信號(hào)通路調(diào)節(jié)(Regulation of Fcreceptor mediated stimulatory signaling pathway)等生物過(guò)程;具有硫酸酯水解酶活性(Sulfuric ester hydrolaseactivity)和外肽酶活性(Exopeptidase activity);主要定位于細(xì)胞器膜的固有成分(Intrinsic componentof organelle membrane)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔(Endoplasmic reticulum lumen)、含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白的復(fù)合體(Endoplasmicreticulum protein-containing complex)和原始溶酶體(Primary lysosome)等(圖4D)。KEGG 通路分析結(jié)果表明,這些蛋白質(zhì)主要參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工(Protein processing in endoplasmic reticulum)、溶酶體(Lysosome)、不同類型的N-糖基化生物合成(Various types of N-glycan biosynthesis)和糖胺聚糖降解(Glycosaminoglycan degradation)等代謝途徑(圖4E)。這些發(fā)現(xiàn)為理解LUT 對(duì)SW620 細(xì)胞糖基化修飾的調(diào)控機(jī)制提供了重要的依據(jù)。

    2.5 影響SW620 細(xì)胞增殖的核心基因的篩選

    基于蛋白質(zhì)組和糖蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù),篩選了與LUT 抑制SW620 細(xì)胞增殖相關(guān)的核心基因。通過(guò)String數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行PPI 分析,并結(jié)合Cytoscape 軟件的CytoHubba 插件,篩選出Top 10 核心基因:RPS16、RPS23、RPS12、RPS15A、WDR43、WDR3、FBL、UTP18、UTP11 和RRP9(圖5A)。這些基因在經(jīng)過(guò)LUT 處理后的SW620 細(xì)胞系中差異表達(dá),其中5 個(gè)表達(dá)上調(diào), 5 個(gè)表達(dá)下調(diào)(見(jiàn)電子版文后支持信息圖S1A)。PCA 分析顯示,通過(guò)Top 10 核心基因可將Control 組和LUT 組區(qū)分開(kāi), PC1 為99.99%, PC2 為0.01%(圖5B)?;诓町惐磉_(dá)完整N-糖肽對(duì)應(yīng)的糖蛋白,篩選出的Top 10 核心基因?yàn)長(zhǎng)AMP1、LAMP2、GNS、M6PR、IGF2R、CD63、CD82、TFRC、SCARB2 和PSAP(圖5C)。PCA 分析結(jié)果證實(shí)了Control 組和LUT 組在糖基化修飾上的顯著差異, PC1 為99.33%, PC2 為0.31%(圖5D)。Top 10 核心基因?qū)?yīng)的差異糖肽在Control 組和LUT 組中有顯著的表達(dá)差異(電子版文后支持信息圖S1B)。

    功能分析結(jié)果表明, RPS15A 為核糖體蛋白s15a,參與mRNA/核糖體相互作用,對(duì)其抑制可減少肝細(xì)胞癌增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯[31-32]。FBL 是一種高度保守的核仁甲基轉(zhuǎn)移酶,負(fù)責(zé)核糖體RNA 和蛋白質(zhì)的甲基化,在各種癌癥中高表達(dá),敲除后可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[33]。WDR43 作為染色質(zhì)相關(guān)RNA 結(jié)合蛋白,在結(jié)直腸癌中高表達(dá),敲低后可抑制癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[34]。UTP11 和UTP18 分別參與18S 核糖體RNA 合成和前核糖體RNA 加工,其過(guò)表達(dá)可促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng),而敲除則抑制腫瘤發(fā)生[35-36]。這些基因在LUT 處理后表達(dá)下調(diào),提示其可能是LUT 抑制SW620 細(xì)胞增殖的關(guān)鍵靶點(diǎn)。此外, LAMP1 和LAMP2 作為溶酶體相關(guān)膜糖蛋白,在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和粘附中發(fā)揮重要作用[37-39]。盡管其蛋白表達(dá)量無(wú)顯著變化,但糖基化修飾的改變可能影響其功能[40-42]。上述結(jié)果為闡明LUT 抑制SW620 細(xì)胞增殖的分子機(jī)制提供了重要線索。

    3 結(jié)論

    本研究利用定量蛋白質(zhì)組學(xué)與糖蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),深入研究了LUT 對(duì)結(jié)直腸癌SW620 細(xì)胞的調(diào)控作用。通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)分析,共鑒定出472 個(gè)差異表達(dá)蛋白。進(jìn)一步的PPI 網(wǎng)絡(luò)分析篩選出10 個(gè)核心基因,其中FBL、RPS15A、WDR43、UTP11 和UTP18 與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),可能是LUT 作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。糖蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)有130 條完整N-糖肽差異表達(dá)上調(diào), 101 條完整N-糖肽差異表達(dá)下調(diào)?;谶@些差異表達(dá)的完整N-糖肽對(duì)應(yīng)的糖蛋白,通過(guò)PPI 網(wǎng)絡(luò)分析,篩選出10 個(gè)核心基因,其中,LAMP1 和LAMP2 與腫瘤細(xì)胞的粘附和遷移密切相關(guān),可能是LUT 作用的潛在靶點(diǎn)。

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    支持信息

    木犀草素抑制結(jié)直腸癌SW620 細(xì)胞生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)組學(xué)機(jī)制研究

    趙佳威 孟波 陸澳 韓梓星 葉子弘 趙洋

    科技基礎(chǔ)資源調(diào)查專項(xiàng)項(xiàng)目(No. 2022FY101202)和國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(No. 2022YFF0608400)資助。

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