木犀草素抑制結直腸癌SW620 細胞生長的蛋白質組學機制研究

摘要 隨著結直腸癌發(fā)病率的持續(xù)攀升，患者群體呈年輕化趨勢?，F(xiàn)有治療方案雖然能延長生存期，卻不可避免地帶來嚴重的副作用，因此，開發(fā)新型治療策略勢在必行。木犀草素（Luteolin， LUT）作為天然草藥活性成分，其廣譜抗腫瘤效應在多種癌癥研究中得到了證實，然而其對結直腸癌的作用機制尚未明確。本研究從蛋白質組-糖蛋白質組協(xié)同調(diào)控角度揭示了LUT 對結直腸癌SW620 細胞的分子作用機制。采用蛋白質組學分析鑒定出472 個差異表達的蛋白質。功能富集分析顯示，下調(diào)蛋白質主要參與氧化應激反應、mRNA處理、RNA 剪接以及肌動蛋白纖維組織等關鍵生物過程，并涉及氧化磷酸化和過氧化物酶體通路；而上調(diào)蛋白質則主要參與DNA 復制、蛋白質折疊及rRNA 代謝等過程，與DNA 復制和內(nèi)質網(wǎng)中蛋白質加工通路密切相關。在糖蛋白質組學層面，本研究發(fā)現(xiàn)了231 條差異表達的完整N-糖肽。對應糖蛋白的功能富集分析表明， LUT 可能通過調(diào)節(jié)核組織、核膜組織和Fc 受體介導的刺激信號通路等生物過程，以及內(nèi)質網(wǎng)蛋白質加工和N-糖基化生物合成通路發(fā)揮生物學效應。關鍵互作網(wǎng)絡分析鑒定出5 個核心靶蛋白，分別為RPS15A、WDR43、FBL、UTP18 和UTP11，這些蛋白缺失已被證實可抑制多種腫瘤細胞增殖和遷移。值得注意的是，溶酶體相關膜蛋白LAMP1 和LAMP2 的糖基化修飾改變提示LUT 可能通過調(diào)控細胞器動態(tài)影響腫瘤轉移潛能。本研究結果揭示了LUT 可通過特異性調(diào)控蛋白表達網(wǎng)絡與糖基化修飾模式雙重機制抑制結腸癌細胞惡性表型，為基于天然產(chǎn)物的結直腸癌精準治療提供了新型分子靶標和理論依據(jù)。

關鍵詞 結直腸癌；木犀草素；蛋白質組學；糖蛋白質組學

根據(jù)2024 年美國癌癥協(xié)會報告，結直腸癌在男女新發(fā)癌癥中均居第三位，占新發(fā)癌癥病例的7.64%。結直腸癌死亡病例數(shù)在男性癌癥死亡病例中排名第三，在女性中排名第四，占所有癌癥相關死亡人數(shù)的8.67%[1]。值得注意的是， 55 歲以下人群中的發(fā)病率和死亡率正以每年1%～2%的速度上升[1-2]。在中國，結直腸癌的平均存活率為56.9%，其中早期患者的五年相對存活率高達90%，而晚期轉移患者僅為14%[2-3]。目前，腸鏡檢查雖為金標準，但其侵入性強，不適于早期篩查[4]，且缺乏可靠的生物標志物，導致多數(shù)患者確診時已出現(xiàn)嚴重癥狀。盡管手術聯(lián)合放化療及靶向藥物（如貝伐珠單抗和帕尼圖單抗等）的應用改善了患者預后[5-9]，但藥物不良反應等問題仍亟待解決。

植物源化合物因其獨特的生物活性在癌癥治療中展現(xiàn)出巨大的潛力[10-13]，尤其在增強化療敏感性方面表現(xiàn)良好[14]。木犀草素（Luteolin， LUT）作為一種廣泛存在的黃酮類物質[15]，已被證實可通過抑制腫瘤細胞增殖、轉移和血管生成發(fā)揮抗癌作用[16-17]。Gao 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)LUT 處理48 h 后，口腔癌細胞（Oral carcinoma 3， OC3）增殖受到顯著抑制；流式細胞術檢測結果顯示， LUT 處理組S 期細胞比例降至10%（對照組25%， DMSO 組20%），同時細胞遷移能力降低50%（細胞遷移數(shù)40% vs 80%），證實其通過阻滯細胞周期和抑制遷移發(fā)揮抗癌作用。Huang 等[19]研究發(fā)現(xiàn)， LUT 以劑量依賴的方式有效抑制了乳腺癌細胞系（MDA-MB-231）的增殖和S 期細胞周期的劑量依賴性停滯。上述研究表明， LUT 對口腔癌和乳腺癌表現(xiàn)出抗癌特性，但對結直腸癌的治療效果的相關研究較少。

本研究采用定量蛋白質組學和糖蛋白質組學技術，系統(tǒng)分析了LUT 處理對結直腸癌細胞SW620 的分子調(diào)控機制。結果表明， LUT 處理誘導了顯著的蛋白質組重塑和N-糖基化修飾改變?；诨虮倔w論（Gene ontology， GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes， KEGG）功能富集分析，發(fā)現(xiàn)差異表達蛋白質和N-糖肽主要富集于細胞周期調(diào)控等關鍵通路。本研究為解析LUT抑制結直腸癌細胞生長的分子機制提供了新的理論依據(jù)，同時揭示了其在癌癥治療中的應用潛力。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CKX53 細胞培養(yǎng)倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；DHP-9052 電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；Concentrator plus 濃縮儀和ThermoMixer C 金屬?。ǖ聡鳨ppendorf 公司）；JY92-IIN 超聲波細胞破碎儀（寧波新芝生物科技公司）；HVE50 高壓滅菌鍋（日本Hirayama 公司）；Snail Girl LC-4006G 低速離心機（美國labyeah 公司）；HERACELL 150i 二氧化碳細胞培養(yǎng)箱、Multiskan SkyHigh 全波長酶標儀、NanoDrop OneC 微量紫外分光光度計、Orbitrap Fusion Lumos 三合一高分辨質譜儀和Easy nLC1200 納升級液相色譜儀（美國賽默飛科技公司）。

結直腸癌SW620 細胞系（北京北納生物公司）；DMEM 細胞培養(yǎng)基和胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（美國Gibco 公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS）和0.25%胰蛋白酶溶液（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；臺盼藍溶液（普諾賽公司）；Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒（武漢百瑞極公司）；T25 細胞培養(yǎng)瓶、細胞培養(yǎng)96 孔板和100 mm 細胞培養(yǎng)皿（無錫NEST 公司）；30 kDa 超濾管（美國Pall Corporation 公司）；尿素（≥99%）、二硫蘇糖醇（≥98%）、碘乙酰胺（≥99%）和碳酸氫銨（≥99%）（美國Sigma Aldrich公司）；測序級胰蛋白酶（質譜純，北京酶知源生物科技有限公司）；HILIC 填料（天津博納艾杰爾公司）；三氟乙酸（≥99%）、甲酸（gt;99%）、乙腈（質譜純）和氨水（≥99%）（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；SDB-RPS 固相萃取盤片（色譜純，美國3M 公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)

將液氮中凍存的SW620 細胞于37 ℃水浴中迅速解凍，離心（1000 r/min， 5 min）后棄上清。采用DMEM 培養(yǎng)基重懸細胞并接種于培養(yǎng)皿，于37 ℃、5% CO2 培養(yǎng)箱中孵育2 h 后更換新鮮培養(yǎng)基。每日觀察細胞形態(tài)，待細胞密度達到80%～90%時進行傳代。傳代操作：移除舊培養(yǎng)基后，經(jīng)預冷PBS 清洗兩次（2 mL/次）；加入0.25%胰酶（1 mL）消化3 min，以含血清培養(yǎng)基終止消化反應；離心收集細胞沉淀（1000 r/min， 5 min），用DMEM 培養(yǎng)基重懸后按1∶2 比例接種傳代，在37 ℃、5% CO2 條件下培養(yǎng)。

1.3 CCK8 試驗測定細胞增殖情況

將LUT 采用二甲基亞砜（DMSO）配制成100 mmol/L 的原液，使用DMEM 細胞培養(yǎng)基將其稀釋至100 μmol/L，于–20 ℃儲存，備用。使用時，用DMEM 細胞培養(yǎng)基將LUT 稀釋至相應的濃度。實驗設置空白組、對照組和實驗組?？瞻捉M僅加入DMEM 細胞培養(yǎng)基，未接種任何細胞。對照組：將生長狀態(tài)良好且處于對數(shù)生長期的SW620 細胞接種于96 孔板，每孔接種1×104 個細胞，培養(yǎng)基為DMEM，按照實驗組的時間同步更換新的DMEM 細胞培養(yǎng)基。實驗組：將生長狀態(tài)良好且處于對數(shù)生長期的SW620 細胞接種于96 孔板，每孔接種1×104 個細胞，采用DMEM 細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)至SW620 細胞貼壁后，更換培養(yǎng)基為含有不同濃度LUT（0、6.25、12.5、25、50、75 和100 μmol/L）的DMEM 培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，然后每孔加入10 μL CCK-8 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h。使用全波長酶標儀測量各孔在490 nm 處的光密度（OD）。計算細胞生長抑制率（IC）：IC（%）=（OD490 nm對照細胞–OD490 nm 處理細胞）/OD490 nm對照細胞×100。半數(shù)最大抑制濃度（IC50）為與對照細胞培養(yǎng)相比LUT 產(chǎn)生50%抑制細胞生長的濃度。各實驗均重復3 次。

1.4 LUT 處理SW620 細胞

對照組（Control）的SW620 細胞在DMEM 養(yǎng)基中培養(yǎng)， LUT 組的SW620 細胞用含有28.20 μmol/LLUT 的DMEM 基培養(yǎng)。Control 組和LUT 組均接種相同密度的SW620 細胞，加入無藥物的DMEM 細胞培養(yǎng)基，置于細胞培養(yǎng)箱中，在5% CO2 的條件下培養(yǎng)過夜。然后，將LUT 組的培養(yǎng)基更換為含有28.20 μmol/L LUT 的DMEM 培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。Control 組更換新的DMEM 細胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。為了確保DMSO 不會對實驗結果產(chǎn)生影響，始終保持培養(yǎng)基中DMSO 的濃度在0.1% （V/V）以下。

1.5 蛋白提取及濃度測定

收集細胞置于無菌EP 管中，加入540 μL 蛋白裂解液（8 mol/L 尿素），置于超聲細胞破碎儀中超聲5 min。超聲細胞破碎儀的程序設置為：工作2 s，停2 s，功率為25%。超聲完成后，采用超高速離心機，在4 ℃下以14000 r/min（16000 g）離心15 min，收集上清，即為細胞全蛋白。利用Bradford 法[20]測定細胞全蛋白濃度。

1.6 蛋白的酶切、分餾和完整糖肽的富集

采用過濾器輔助樣品制備方案（Filter-aided sample preparation， FASP）[21]酶切樣品蛋白。（1）稱取500 μg 蛋白加入30 kDa 超濾管中，離心，棄去濾液；（2）加入裂解緩沖液（8 mol/L 尿素， 100 mmol/L Tris-HCl， pH 8.5）離心洗滌；（3）加入10 mmol/L 二硫蘇糖醇（DTT），于37 ℃孵育4 h；（4）離心，棄去上清液，加入50 mmol/L 碘乙酰胺（IAM），室溫下于暗處避光孵育0.5 h；（5）離心，棄去上清液，加入10 mmol/LDTT 室溫避光放置15 min， 離心，棄去上清液；（6）分別加入尿素溶液和50 mmol/L 碳酸氫銨（ABC）洗滌3 次，更換新套管，加入50 mmol/L ABC 溶解的20 μg 胰蛋白酶， 37 ℃孵育16 h；（7）反應結束后離心，收集肽段，依次加入ddH2O 和50 mmol/L ABC 洗滌超濾管，離心收集洗脫液；（8）用SpeedVac 真空干燥離心機（Eppendorf）干燥肽段；（9）肽段使用0.1%甲酸（FA）/ddH2O 溶解，采用NanoDrop 測定其濃度，取50 μg肽段使用SpeedVac真空干燥離心機干燥，于–80 ℃凍存。

采用SDB-RPS 進行分餾。首先，取5 層SDB-RPS 膜加入Tip 柱中；然后，將50 μg 上述凍存的肽段用0.2% TFA 溶解，并加至SDB-RPS-Tip 柱中；接著加入0.2% TFA 洗滌一次；依次用100 mmol/L 甲酸銨/40%ACN/0.5%FA、150 mmol/L 甲酸銨/60%ACN/0.5%FA 和80%ACN/5%NH3H2O 洗脫。洗脫的肽段溶液在真空離心濃縮儀中45 ℃、V-HV 模式下熱干回收，隨后在–80 ℃儲存，用于后續(xù)LC-MS/MS 分析。HILIC 富集完整糖肽的實驗方案如下：利用0.1% TFA 溶液活化HILIC 填料（5 μm， 100 ?），重復3 次；然后，使用80% ACN/0.2% TFA 溶液平衡填料，重復3 次；將熱干的肽段用80% ACN/0.2% TFA 溶液復溶，加入已平衡好的HILIC 填料，置于室溫旋轉混合儀上孵育2 h；將混合物轉移到填充有一層C8 膜的Tip 柱中，并利用80% ACN/0.2% TFA 溶液洗滌除去未結合肽段；更換新離心管，加入0.1% TFA 溶液洗脫收集糖肽，重復洗脫操作3 次并合并收集液。使用SpeedVac 真空干燥離心機熱干糖肽，在–80 ℃儲存，待LC-MS/MS 分析。

1.7 液相色譜及質譜參數(shù)設置

使用由EASY-nLC 1200 液相色譜系統(tǒng)和Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 質譜儀組成的液相色譜-質譜聯(lián)用（LC-MS/MS）系統(tǒng)進行蛋白質組分析。液相色譜流動相A 為0.1% FA， B 為80% ACN/0.1% FA。分析柱為實驗室自制C18 柱（30 cm（L）×100 μm（o.d.）×360 μm（i.d.）），填料粒徑為1.9 μm（ReproSil-Pur C18-AQ; Dr. Maisch）。

1.7.1 蛋白質組分析

將肽段溶于0.1% FA/ddH2O 中，用NanoDrop 測定其濃度。取1 μg 肽段經(jīng)過液相加載到分析柱中，采用梯度洗脫：0～5 min， 4%～10% B；5～48 min， 10%～22% B；48～66 min， 22%～35% B；66～76 min，35%～90% B；76%～78 min， 90% B。流速為600 nL/min。

質譜參數(shù)如下：Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 質譜儀采用OT（Obitrap）-OT 模式；一級質譜掃描的自動增益控制（Automatic Gain Control， AGC）目標值為400000；掃描范圍為m/z 350～1550；分辨率為120000；離子最大注入時間（Maximum injection time， MaxIT）為50 ms。二級質譜掃描AGC 目標值為50000；分辨率為15000， MaxIT 為30 ms，使用高能碰撞解離（HCD）對2～7 電荷的母離子進行碎裂，碰撞能量為30%；動態(tài)排除時間為18 s，質量數(shù)據(jù)由XCalibur 進行實時采集。

1.7.2 糖蛋白質組分析

將肽段溶于0.1% FA/ddH2O 中，使用NanoDrop 測定其濃度。然后，取1 μg 肽段經(jīng)過液相加載到分析柱中，采用梯度洗脫：0～8 min， 5%～8% B；8～68 min， 8%～22% B；68～82 min， 22%～32% B；82～88 min，32%～90% B；88～90 min， 90% B。流速為600 nL/min。

質譜參數(shù)如下：Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 質譜儀采用OT（Orbitrap）-OT 模式；一級質譜掃描的AGC 目標值為400000；掃描范圍m/z 800～2000；分辨率為120000；MaxIT 為100 ms。二級質譜掃描AGC 目標值為50000；分辨率為15000， MaxIT 為250 ms，使用HCD 對2～6 電荷的母離子進行碎裂，階梯碰撞能量為20%、30%和40%；動態(tài)排除時間為15 s，質量數(shù)據(jù)由XCalibur 進行實時采集。

1.8 數(shù)據(jù)處理

使用MaxQuant（2.0.3.0）軟件[22]解析蛋白質組的原始質譜數(shù)據(jù)。用于檢索的數(shù)據(jù)庫為2023年6月1日從Uniprot[23]下載的Swiss-Prot蛋白庫，包含20422種蛋白質。設定參數(shù)如下：蛋白水解酶為Trypsin/P，最大漏切位點為2；母離子質量偏差為20 ppm（10–6），子離子質量偏差為4.5 ppm；固定修飾設定半胱氨酸碘乙酰胺化（Carbamidomethy/+57.021 Da），可變修飾選擇甲硫氨酸氧化（Oxidation/+15.995 Da）和N-乙?；ˋcetyl/+42.011 Da）；蛋白和多肽定性假陽性率（FDR）為1%，定量方法選擇非標定量（Lable free），其它參數(shù)為默認參數(shù)。使用pGlyco3[24]解析糖蛋白質組質譜原始數(shù)據(jù)，用于檢索的蛋白質組數(shù)據(jù)庫與上述蛋白質組質譜數(shù)據(jù)檢索使用的一致。設定參數(shù)如下：固定修飾設定為半胱氨酸碘乙酰胺化（Carbamidomethy/+57.021 Da），可變修飾選擇甲硫氨酸氧化（Oxidation/+15.995 Da）和N-乙酰化（Acetyl/+42.011 Da）。母離子質量偏差（Mass tolerance）為±4 ppm，子離子質量偏差（Peptide tolerance）為±20 ppm，允許兩個漏切位點。完整糖肽鑒定的質量控制方法設置為FDR 小于1%，其它參數(shù)設置選擇默認值。

蛋白質組和糖蛋白質組的數(shù)據(jù)使用Perseus 軟件[25]完成數(shù)據(jù)篩選和缺失值填充等差異分析前處理工作。數(shù)據(jù)篩選的條件為至少在一個實驗組中被鑒定頻率≥3 的蛋白質組。缺失值填充的方法：采用Perseus 軟件內(nèi)置的正態(tài)分布法進行填補，設置Width 為0.3， Down shift 為1.8，每列分別處理（Mode 為Separately for each column）。蛋白質組和糖蛋白質組的差異分析均使用Limma[26]R 包完成，選擇p（BH）lt;0.05 和| log2（Fold Change）|≥1.2 為顯著差異表達蛋白或糖肽。差異基因或差異糖肽對應的基因的GO和KEGG 富集分析使用clusterProfiler 4.0 軟件[27]完成，選擇p（BH）lt;0.05 為顯著富集條目。GO 富集結果包括細胞組分（Cellular component， CC）、分子功能（Molecular function， MF）和生物過程（Biological process，BP）。差異基因或差異糖肽對應的基因使用String 軟件[28]進行蛋白互作分析（PPI）， Network type 設置為full STRING network， meaning of network edges 設置為confidence， minimum required interaction score設置為0.900（蛋白質組）/0.400（糖蛋白質組），其它參數(shù)為默認值。PPI 網(wǎng)絡使用Cytoscape 軟件[29]優(yōu)化。關鍵基因使用cytoHubba 插件[30]篩選。

2 結果與討論

2.1 LUT 抑制SW620 細胞的增殖

設置空白組、對照組（Control）和處理組（LUT），系統(tǒng)評估LUT（圖1A）對結直腸癌SW620 細胞系的抗增殖效應。結果表明，其對結直腸癌SW620 細胞系的抗增殖效應呈顯著的劑量依賴性，由LUT 濃度與細胞存活率之間的劑量-效應曲線（圖1B），計算出LUT 的半抑制濃度（IC50）為28.20 μmol/L。由圖1C的顯微鏡觀察結果可知，相較于Control 組， LUT 組（28.20 μmol/L）呈現(xiàn)劑量依賴性細胞數(shù)量減少。對細胞數(shù)量進行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)Control 組的細胞數(shù)量明顯多于LUT 組，并且兩組之間的細胞數(shù)量差異具有統(tǒng)計學意義（圖1D）。

2.2 Control 組和LUT 組SW620 細胞的蛋白質組及糖蛋白質組測序結果統(tǒng)計

收集Control 與LUT 處理48 h 的SW620 細胞，每組6 個生物學重復。FASP 酶解獲得的肽段分成兩份，一份使用SDB-RPS-Tip 分離（50 μg）用于蛋白質組分析，另一份使用HILIC 富集（100 μg）用于完整N-糖肽分析。

在蛋白質組分析中，從Control 組中平均鑒定出4825 個蛋白質（4720～4894），顯著高于LUT 組的4613 個（4519～4695）（圖2A 和2C）。兩組共同鑒定的蛋白質有5201 個，占總數(shù)的90.99%；Control 組特有的蛋白質為362 個，占6.33%；而LUT 組特有的蛋白質為153 個，占2.68%（圖2C）。在肽段層面，兩組樣本鑒定出的肽段數(shù)量基本一致（圖2B）。在糖蛋白質組分析中共鑒定出4647 條完整N-糖肽， Control組平均鑒定出1694 條（1550～1829）， LUT 組為1632 條（1349～1852）（圖2D 和2E）。兩組共有的糖肽僅占41.87%（2729 條），而Control 與LUT 組特有糖肽分別為1918 條（29.43%）和1871 條（28.71%），表明LUT處理顯著改變了SW620 細胞的糖基化修飾譜。通過糖蛋白質組與蛋白質組分析結果的交叉比對發(fā)現(xiàn)，有32.70%的糖蛋白在蛋白質組測序中未被檢測到（圖2F），凸顯了糖蛋白質組學在全面解析蛋白質修飾中的獨特價值，同時也說明糖蛋白質組測序為蛋白質組學分析提供了重要的補充信息。

2.3 Control 組和LUT 組差異蛋白質組分析

差異蛋白質組分析發(fā)現(xiàn)顯著差異表達上調(diào)蛋白212 個，下調(diào)蛋白260 個（圖3A）。主成分分析（Principal component analysis， PCA）顯示， Control 組和LUT 組獲得SW620 細胞的蛋白質組有顯著分離，表明LUT 處理顯著改變了SW620 細胞的蛋白質表達譜（圖3B）。聚類分析進一步證實了兩組樣本的顯著區(qū)分性（圖3C）。

使用clusterProfile 軟件包對差異表達蛋白質進行了GO 和KEGG 富集分析。如圖3D 所示，表達下調(diào)的蛋白質主要參與了mRNA 處理（mRNA processing）、DNA 代謝過程的調(diào)控（Regulation of DNA metabolicprocess）、RNA 剪接（RNA splicing）和對氧化應激的響應（Response to oxidative stress）等生物過程；分子功能包括DNA 結合轉錄因子結合（DNA-binding transcription factor binding）、轉錄共調(diào)控子活性（Transcriptioncoregulator activity）、肌動蛋白結合（Actin binding）和鈣黏蛋白結合（Cadherin binding）等；主要定位于細胞-細胞連接（Cell-cell junction）、線粒體基質（Mitochondrial matrix）、肌動蛋白骨架（Actincytoskeleton）和細胞-基質連接（Cell-substrate junction）等。如圖3E 所示，表達上調(diào)的蛋白質主要參與ncRNA 處理（ncRNA processing）、DNA 復制（DNA replication）、核糖核蛋白復合體生物生成（Ribonucleoproteincomplex biogenesis）、蛋白質折疊（Protein folding）和rRNA 代謝過程（rRNA metabolic process）等；分子功能涉及作用于RNA 的催化活性（Catalytic activity， acting on RNA）、鈣黏蛋白結合（Cadherin binding）、ATP 水解活性（ATP hydrolysis activity）和解旋酶活性（Helicase activity）等；定位于核膜（Nuclearenvelope）、線粒體基質（Mitochondrial matrix）、染色體區(qū)域（Chromosomal region）、核糖體（Ribosome）和內(nèi)質網(wǎng)蛋白復合體（Endoplasmic reticulum protein-containing complex）等。GO 富集分析結果揭示了許多差異表達蛋白質與細胞周期緊密相關。KEGG 分析（圖3F）表明，上調(diào)蛋白質主要的信號通路包括DNA 復制（DNA replication）、核苷酸切除修復（Nucleotide excision repair）、內(nèi)質網(wǎng)中的蛋白質加工（Protein processing in endoplasmic reticulum）和錯配修復（Mismatch repair）等；下調(diào)蛋白質參與的信號通路包括氧化磷酸化（Oxidative phosphorylation）、檸檬酸循環(huán)（Citrate cycle）和過氧化物酶體（Peroxisome）等。以上結果表明，差異蛋白顯著富集于細胞周期相關通路，提示LUT 可能通過調(diào)控細胞周期進程影響SW620 細胞增殖。

2.4 Control 組和LUT 組SW620 細胞差異糖蛋白質組分析

糖蛋白質組差異分析結果表明， LUT 處理后的SW620 細胞中，有130 條完整N-糖肽表達顯著上調(diào)，101 條完整N-糖肽表達顯著下調(diào)（圖4A）。PCA 分析顯示， Control 組與LUT 組在N-糖基化修飾上具有顯著差異（圖4B），且LUT 處理顯著改變了N-糖基化修飾水平（圖4C）。

對差異完整N-糖肽對應的糖蛋白進行功能注釋。GO 分析結果顯示，這些蛋白質主要參與了細胞核組織（Nucleus organization）、核膜組織（Nuclear envelope organization）、脯氨酸修飾（Peptidyl-prolinemodification）、蛋白質羥基化（Protein hydroxylation）和Fc 受體介導的刺激信號通路調(diào)節(jié)（Regulation of Fcreceptor mediated stimulatory signaling pathway）等生物過程；具有硫酸酯水解酶活性（Sulfuric ester hydrolaseactivity）和外肽酶活性（Exopeptidase activity）；主要定位于細胞器膜的固有成分（Intrinsic componentof organelle membrane）、內(nèi)質網(wǎng)腔（Endoplasmic reticulum lumen）、含內(nèi)質網(wǎng)蛋白的復合體（Endoplasmicreticulum protein-containing complex）和原始溶酶體（Primary lysosome）等（圖4D）。KEGG 通路分析結果表明，這些蛋白質主要參與內(nèi)質網(wǎng)中的蛋白質加工（Protein processing in endoplasmic reticulum）、溶酶體（Lysosome）、不同類型的N-糖基化生物合成（Various types of N-glycan biosynthesis）和糖胺聚糖降解（Glycosaminoglycan degradation）等代謝途徑（圖4E）。這些發(fā)現(xiàn)為理解LUT 對SW620 細胞糖基化修飾的調(diào)控機制提供了重要的依據(jù)。

2.5 影響SW620 細胞增殖的核心基因的篩選

基于蛋白質組和糖蛋白質組數(shù)據(jù)，篩選了與LUT 抑制SW620 細胞增殖相關的核心基因。通過String數(shù)據(jù)庫進行PPI 分析，并結合Cytoscape 軟件的CytoHubba 插件，篩選出Top 10 核心基因：RPS16、RPS23、RPS12、RPS15A、WDR43、WDR3、FBL、UTP18、UTP11 和RRP9（圖5A）。這些基因在經(jīng)過LUT 處理后的SW620 細胞系中差異表達，其中5 個表達上調(diào)， 5 個表達下調(diào)（見電子版文后支持信息圖S1A）。PCA 分析顯示，通過Top 10 核心基因可將Control 組和LUT 組區(qū)分開， PC1 為99.99%， PC2 為0.01%（圖5B）。基于差異表達完整N-糖肽對應的糖蛋白，篩選出的Top 10 核心基因為LAMP1、LAMP2、GNS、M6PR、IGF2R、CD63、CD82、TFRC、SCARB2 和PSAP（圖5C）。PCA 分析結果證實了Control 組和LUT 組在糖基化修飾上的顯著差異， PC1 為99.33%， PC2 為0.31%（圖5D）。Top 10 核心基因對應的差異糖肽在Control 組和LUT 組中有顯著的表達差異（電子版文后支持信息圖S1B）。

功能分析結果表明， RPS15A 為核糖體蛋白s15a，參與mRNA/核糖體相互作用，對其抑制可減少肝細胞癌增殖并誘導細胞周期停滯[31-32]。FBL 是一種高度保守的核仁甲基轉移酶，負責核糖體RNA 和蛋白質的甲基化，在各種癌癥中高表達，敲除后可抑制腫瘤細胞的增殖[33]。WDR43 作為染色質相關RNA 結合蛋白，在結直腸癌中高表達，敲低后可抑制癌細胞增殖、遷移和侵襲[34]。UTP11 和UTP18 分別參與18S 核糖體RNA 合成和前核糖體RNA 加工，其過表達可促進腫瘤生長，而敲除則抑制腫瘤發(fā)生[35-36]。這些基因在LUT 處理后表達下調(diào)，提示其可能是LUT 抑制SW620 細胞增殖的關鍵靶點。此外， LAMP1 和LAMP2 作為溶酶體相關膜糖蛋白，在腫瘤細胞轉移和粘附中發(fā)揮重要作用[37-39]。盡管其蛋白表達量無顯著變化，但糖基化修飾的改變可能影響其功能[40-42]。上述結果為闡明LUT 抑制SW620 細胞增殖的分子機制提供了重要線索。

3 結論

本研究利用定量蛋白質組學與糖蛋白質組學技術，深入研究了LUT 對結直腸癌SW620 細胞的調(diào)控作用。通過蛋白質組學分析，共鑒定出472 個差異表達蛋白。進一步的PPI 網(wǎng)絡分析篩選出10 個核心基因，其中FBL、RPS15A、WDR43、UTP11 和UTP18 與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，可能是LUT 作用的關鍵靶點。糖蛋白質組學分析發(fā)現(xiàn)有130 條完整N-糖肽差異表達上調(diào)， 101 條完整N-糖肽差異表達下調(diào)?；谶@些差異表達的完整N-糖肽對應的糖蛋白，通過PPI 網(wǎng)絡分析，篩選出10 個核心基因，其中，LAMP1 和LAMP2 與腫瘤細胞的粘附和遷移密切相關，可能是LUT 作用的潛在靶點。

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支持信息

木犀草素抑制結直腸癌SW620 細胞生長的蛋白質組學機制研究

趙佳威 孟波 陸澳 韓梓星 葉子弘 趙洋

科技基礎資源調(diào)查專項項目（No. 2022FY101202）和國家重點研發(fā)計劃項目（No. 2022YFF0608400）資助。