具有D-π-A 結(jié)構(gòu)的三苯胺類HClO/ClO–熒光探針的合成及其性能研究

摘要 次氯酸/次氯酸鹽（HClO/ClO–）在各種生物過程中具有重要作用，常用于飲用水消毒，但過量攝入HClO/ClO–會導(dǎo)致DNA、RNA 和蛋白質(zhì)等生物分子氧化，進(jìn)而損傷人體器官；此外，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、阿爾茨海默病等疾病也會誘導(dǎo)HClO/ClO–的過量產(chǎn)生。因此，準(zhǔn)確、高效識別HClO/ClO–與檢測其濃度水平具有重要意義。本研究設(shè)計(jì)合成了以三苯胺基為熒光母體、碳碳雙鍵為識別位點(diǎn)、季鏻鹽為線粒體靶向基團(tuán)且具有D-π-A 結(jié)構(gòu)的HClO/ClO–熒光探針NC-TPA-PPh3。探針的熒光壽命為3.71 ns，熒光量子產(chǎn)率為0.51。在DMSO/H2O（9∶1， V/V， pH=7.4）溶液中，當(dāng)HClO/ClO–存在時， 20 μmol/L 探針的最大熒光發(fā)射波長從550 nm 藍(lán)移至430 nm，熒光強(qiáng)度比探針空白溶液增強(qiáng)了35.7 倍，據(jù)此可以實(shí)現(xiàn)對HClO/ClO–的選擇性識別。此探針具有Stokes 位移大（130 nm）和檢出限低（9.16×10–8 mol/L）的優(yōu)勢?；诤舜殴舱駳渥V（1H NMR）、電噴霧質(zhì)譜（ESI-MS）、掃描電子顯微鏡（SEM）和理論計(jì)算結(jié)果，推測探針NC-TPA-PPh3 識別HClO/ClO-時，ClO–氧化斷裂探針NC-TPA-PPh3 結(jié)構(gòu)中的C=C 鍵，生成了具有更低水溶性和更小共軛結(jié)構(gòu)的TPA-CHO。該過程不僅破壞了探針的D-π-A 結(jié)構(gòu)，阻斷了分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）過程，引起熒光發(fā)射峰從550 nm 藍(lán)移至430 nm，還誘發(fā)了聚集誘導(dǎo)熒光效應(yīng)，使430 nm 處的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。

關(guān)鍵詞 三苯胺；碳碳雙鍵；次氯酸/次氯酸根；熒光探針

次氯酸/次氯酸鹽（HClO/ClO–）作為常見的強(qiáng)氧化劑和消毒劑，在日常生活中廣泛用于飲用水消毒、紙張和工業(yè)紡織品漂白等。根據(jù)現(xiàn)行生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，飲用水中游離氯含量不得超過2 mg/L[1-2]，HClO/ClO–的過量攝入會導(dǎo)致DNA、RNA 和蛋白質(zhì)等生物分子氧化，進(jìn)而損傷人體器官。在生物體內(nèi)，HClO/ClO–主要是由血紅素髓過氧化物酶（MPO）催化過氧化氫和氯離子形成的一類重要活性氧[3-4]，體內(nèi)過量的HClO/ClO–與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[5]、阿爾茨海默病[6]和癌癥[7-8]等多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)。因此，建立一種高靈敏、高選擇性識別、能夠檢測環(huán)境水體以及細(xì)胞中的HClO/ClO–濃度水平的分析方法具有重要意義。目前，檢測HClO/ClO–的方法主要有化學(xué)發(fā)光法[9]、電位分析法[10]、比色法[11]和熒光探針法[12-13]等，其中，熒光探針法因具有選擇性好、靈敏度高、對生物樣品的破壞小、生物相容性好和可實(shí)時監(jiān)測等優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注[14-15]。

三苯胺（TPA）類化合物是一種中心原子為氮的星型結(jié)構(gòu)化合物[16]，該類物質(zhì)是良好的電子供體，具有優(yōu)異的電子傳輸能力，且結(jié)構(gòu)易于修飾[17-18]。研究者通過引入新的識別位點(diǎn)并調(diào)節(jié)其連接方式，改變識別基團(tuán)和熒光體的電子分布和空間構(gòu)型，構(gòu)建了許多具有大Stokes 位移、靈敏度高、選擇性好的三苯胺類熒光探針[19-20]。Kong 研究組[21]合成了基于三苯胺的“開啟”型探針TBDT，該探針具有較低的檢出限（3.3×10–8 mol/L），并且可檢測人宮頸癌細(xì)胞中的HClO/ClO–水平。Xiong 研究組[22]開發(fā)了一種靶向溶酶體的三苯胺類熒光探針PTA，用于檢測細(xì)胞內(nèi)的外源性和內(nèi)源性HClO/ClO–。Kim 研究組[23]設(shè)計(jì)合成了一種檢測水溶液中ClO–的新型快速響應(yīng)熒光傳感器，并成功應(yīng)用于水樣、斑馬魚和芹菜中ClO–的檢測。Chen 等[24]基于噻吩醛和丙二腈構(gòu)建了探針TPAM，成功用于活細(xì)胞中ClO–成像，該探針具有良好的光穩(wěn)定性和生物相容性。上述研究表明，三苯胺類熒光探針具有選擇性好和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞中外源性、內(nèi)源性HClO/ClO– 和活細(xì)胞熒光成像以及水和食物樣本中HClO/ClO– 的檢測。然而在實(shí)際檢測中，由于樣品基質(zhì)復(fù)雜且干擾因素多，開發(fā)高靈敏、高選擇性和高穩(wěn)定性的HClO/ClO–探針仍然是研究者重點(diǎn)關(guān)注的研究方向之一。

本研究基于分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）原理，以三苯胺基為電子供體、碳碳雙鍵為π橋、氰基為電子受體，設(shè)計(jì)合成了一種新型HClO/ClO–熒光探針NC-TPA-PPh3。此探針具有低檢出限、較高的選擇性和靈敏度以及較寬的pH 適用范圍，可用于檢測環(huán)境水體中的HClO/ClO–。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Avance NEO 400 MHz 核磁共振波譜儀（德國布魯克公司）；Q Exactive 組合型四極桿軌道阱質(zhì)譜儀（美國賽默飛公司）；T10CS 紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；Varian CaryEclipse 熒光分光光度計(jì)（美國瓦里安公司）；FluoroMax Plus 穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀（日本HORIBA 公司）；泰克X-4 顯微熔點(diǎn)儀（北京泰克儀器有限公司）；SU3800 型掃描電子顯微鏡（日本日立高新技術(shù)公司）。

4-溴三苯胺、4-甲酰基苯硼酸、四（三苯基膦）鈀、四丁基溴化銨、2-氰基乙酸、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）和二甲基亞砜（DMSO）等均為分析純試劑，購于上海泰坦科技股份有限公司。實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水，由SZ-97 自動三重純水蒸餾器（上海亞榮公司）二次蒸餾制備。

1.2 探針NC-TPA-PPh3 的合成與表征

探針NC-TPA-PPh3 的合成路線見圖1。首先，將4-溴三苯胺與4-甲?；脚鹚嵬ㄟ^Suzuki 反應(yīng)獲得4′-（二苯基氨基）-[1，1′-聯(lián)苯]-4-甲醛（TPA-CHO）[25]；然后， TPA-CHO與2-氰基乙酸進(jìn)行Knoevenagel縮合得到（E）-2-氰基-3-（4′-二苯基氨基）-[1，1′-聯(lián)苯]-4-基丙烯酸（TPA-COOH）；最后， TPA-COOH 通過與（2-羥基乙基）三苯基溴化鏻酯化反應(yīng)得到靶向性熒光探針（E）-（2-氰基-3-（4′-二苯基氨基）-[1，1′-聯(lián)苯]-4-基）丙烯?；┭趸┮一┤交l（NC-TPA-PPh3）。通過紅外光譜（IR）、核磁共振氫譜（1H NMR）、核磁共振碳譜（13C NMR）和質(zhì)譜（ESI-MS）對TPA-CHO、TPA-COOH 和NC-TPA-PPh3 進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，具體結(jié)果見電子版文后支持信息圖S1～S6。

1.2.1 化合物TPA-CHO 的合成與表征

將5.00 g（15.40 mmol）4-溴三苯胺、3.46 g（23.10 mmol）4-甲?；脚鹚帷?.64 g（0.2 mmol）四丁基溴化銨、5 mL K2CO3（2.0 mol/L）溶液、0.53 g（0.46 mmol）四（三苯基膦）鈀和40.0 mL 乙腈加入到500 mL 三頸燒瓶中，在N2 氛圍下回流6 h?；旌衔锢鋮s至室溫，用二氯甲烷萃取（3×50 mL），然后用無水硫酸鎂干燥，過濾濃縮，采用柱層析（洗脫劑為石油醚-乙酸乙酯（50∶1， V/V））分離得到7.70 g 淡綠色固體，產(chǎn)率為91.0%。m.p.119～120 ℃；IR（KBr， cm–1）：3443， 1692， 1488， 815， 697。1H NMR（400 MHz， CDCl3） δ：10.02（s， 1H）， 7.93～7.89（m， 2H）， 7.74～7.70（m， 2H）， 7.54～7.49（m， 2H）， 7.31～7.24（m， 4H）， 7.17～7.11（m， 6H）， 7.09～7.04（m， 2H）。

1.2.2 化合物TPA-COOH 的合成與表征

將5.00 g（14.30 mmol）TPA-CHO、2.43 g（28.60 mmol）2-氰基乙酸和20 mL 乙醇加入到50 mL 圓底燒瓶中，然后緩慢滴入0.20 mL 哌啶，加熱回流4 h，冷卻析出固體，經(jīng)抽濾、二氯甲烷洗滌得到粗品，再經(jīng)石油醚重結(jié)晶得淡黃色固體5.97 g，產(chǎn)率為80.3%。m.p.221～222 ℃；IR（KBr， cm–1）：3385， 2221，1588， 1492， 820， 697。1H NMR（400 MHz， CDCl3） δ：8.31（s， 1H）， 8.08（d， J=8.4 Hz， 2H）， 7.71（d， J=8.2 Hz， 2H）， 7.52（d， J=8.4 Hz， 2H）， 7.27（m， 4H）， 7.16～7.04（m， 8H）[26]。13C NMR（100 MHz， CDCl3）δ：152.19， 145.88， 133.27， 129.83， 129.43， 126.41， 125.35， 124.69， 123.80， 119.32。

1.2.3 探針NC-TPA-PPh3 的合成與表征

首先將0.30 g（0.7 mmol）TPA-COOH 和10 mL 無水二氯甲烷加入到25 mL 的圓底燒瓶中，冰浴攪拌至固體完全溶解后，緩慢滴加0.10 mL 草酰氯，并加入兩滴DMF，攪拌10 min。待反應(yīng)瓶溶液升至室溫后，繼續(xù)攪拌反應(yīng)2 h。最后，在反應(yīng)體系中加入0.41 g（1.05 mmol）（2-羥基乙基）三苯基溴化鏻，繼續(xù)反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后，加入10 mL 蒸餾水終止反應(yīng)，混合物用二氯甲烷萃?。?×50 mL），并用無水硫酸鎂干燥，過濾濃縮后，采用柱層析（洗脫劑為二氯甲烷-甲醇（100∶1， V/V））分離得到紅色固體0.22 g，產(chǎn)率65.2%。m.p.190～191 ℃；IR（KBr， cm–1）：2217， 1719， 1581， 1487， 690。1H NMR（400 MHz， CDCl3）δ：8.18（s， 1H）， 8.02～7.90（m， 8H）， 7.80～7.66（m， 11H）， 7.52 （d， J=8.0 Hz， 2H）， 7.32～7.27（m，4H）， 7.06～7.16（m， 8H）， 4.84～4.92（m， 2H）， 4.63～4.69（m， 2H）。13C NMR（100 MHz， CDCl3） δ：161.99， 156.06， 148.64， 147.11， 145.93， 134.92， 134.89， 133.92， 133.81， 132.22， 131.95， 130.71，130.40， 130.27， 129.38， 127.83， 124.97， 123.61， 122.72， 119.02， 118.16， 118.08， 115.29， 99.37， 77.38，77.06， 76.74， 55.53， 27.54。MS（ESI）：Calcd for C48H38N2O2P+ [M+H]+ 705.27; Found， 705.2650。

1.3 溶液配制方法

1.3.1 化合物NC-TPA-PPh3 儲備液配制方法

準(zhǔn)確稱取17.64 mg（0.025 mmol）探針NC-TPA-PPh3，并分別以DMSO 和DMF 為溶劑，配制成50 mL0.5 mmol/L 的熒光探針儲備液。

1.3.2 溶液配制

根據(jù)文獻(xiàn)[27]方法，在冰浴條件下， 2.00 mL HCI（0.60 mol/L）和2.00 mL H2O2 水溶液（0.70 mol/L）混合攪拌20 min 后，加入2.00 mL NaOH 溶液（3.00 mol/L）與2.00 mL 亞硝酸鈉溶液（0.60 mol/L）繼續(xù)反應(yīng)1 min，得到微黃色的ONOO–儲備液，通過測量302 nm 處的吸光度確定其濃度為1.19 mmol/L。稱量149.00 mg（0.5 mmol）硝普鈉溶于10.00 mL 蒸餾水中制得0.05 mol/L 的NO–溶液。TBHP 溶液是由蒸餾水將市售TBHP 溶液（70%的水溶液）溶液稀釋至0.05 mol/L制得；0.05 mol/L TBHP 溶液與0.05 mol/L 硫酸亞鐵溶液等體積混合制得0.05 mol/L TBO–溶液。根據(jù)文獻(xiàn)[28]，將H2O2 溶液用蒸餾水稀釋，得到0.05 mol/L 的H2O2 儲備液。稱取41.13 mg（2.5 mmol）次氯酸鈉五水合物溶于50 mL 蒸餾水制得0.05 mol/L 的ClO–儲備液。參考文獻(xiàn)[29]方法，將0.05 mol/L 硫酸亞鐵水溶液和0.50 mol/L H2O2 水溶液等體積混合制得0.05 mol/L 的·OH 儲備液；0.05 mol/L 鉬酸鈉溶液和0.50 mol/L H2O2 水溶液等體積混合制得0.05 mol/L 的1O2 儲備液。

分別配制與LiCl·H2O、FeCl3·H2O、Mg（NO3）2·6H2O、Cu（NO3）2·3H2O、KNO3、NaNO3、AgNO3、Pb（NO3）2、Co（NO3）2·6H2O、Zn（NO3）2·4H2O、Ni（NO3）2·6H2O、Al（NO3）3·9H2O、Ca（NO3）2·6H2O、HgCl2、MnCl2·4H2O、Cr（NO3）3·9H2O、BaCl2·2H2O和Cd（NO3）2·4H2O 相應(yīng)的金屬陽離子水溶液（0.01 mol/L）。

分別配制0.01 mol/L 與KF、K2SO4、KBr、KCl， KI、KH2PO4、KNO3、KC2O4 和NaClO2 相應(yīng)的陰離子水溶液。

稱取0.0030 g 硫酸奎寧，用0.05 mol/L 的H2SO4 溶液溶解并定容至250 mL，得到12 mg/L 的硫酸奎寧溶液（熒光量子產(chǎn)率（Φ）為0.54）[30]。

1.4 測試方法

1.4.1 熒光光譜的測定

向制備的NC-TPA-PPh3 的DMSO 儲備液（0.5 mmol/L， 20 μL）中逐步加入0～10 μL 的HClO/ClO–溶液（50 mmol/L），并補(bǔ)加DMSO、蒸餾水和PBS 緩沖液（10 mmol/L）至終體積為5 mL，使HClO/ClO–最終濃度為0～100 μmol/L，探針的DMSO/H2O（9∶1， V/V， pH=7.4）溶液的最終濃度為20 μmol/L，并將上述混合溶液在室溫下反應(yīng)26 min。設(shè)置熒光分光光度計(jì)的激發(fā)波長為300 nm，燈電壓為600 V，狹縫寬度為5 mm，測定熒光發(fā)射光譜，記錄430 nm 處的熒光強(qiáng)度。按照上述方法考察不同濃度的HClO/ClO–和100 μmol/L 不同種類陰離子（C2O4 2–、Br–、F–、CO3 2–、I–、H2PO4 2–、Cl–、NO3–和ClO2–）、金屬陽離子（K+、Li+、Ag+、Na+、Hg2+、Mg2+、Cd2+、Pb2+、Mn2+、Ni+、Co2+、Ba2+、Ca2+、Cu2+、Zn2+、Cr3+、Al3+和Fe3+）及其它ROS/RNS （1O2、TBO–、TBHP、NO–、H2O2、·OH 和ONOO–）存在下探針NC-TPA-PPh3 溶液的熒光響應(yīng)。

1.4.2 熒光量子產(chǎn)率測定及計(jì)算

將12 mg/L 硫酸奎寧溶液稀釋至0.6 mg/L，測量其紫外-可見吸收光譜并記錄350 nm 處的吸光度。然后以350 nm 為激發(fā)波長，測量其在360～650 nm 范圍內(nèi)的熒光發(fā)射光譜，記錄其熒光積分峰面積。將0.5 mmol/L NC-TPA-PPh3 的DMF 儲備液稀釋為10 μmol/L NC-TPA-PPh3 的DMF 溶液。重復(fù)以上步驟，分別記錄10 μmol/L NC-TPA-PPh3 的DMF 溶液在350 nm 處的吸光度和熒光積分峰面積。將上述數(shù)值分別代入公式（1）中，計(jì)算熒光量子產(chǎn)率。熒光量子產(chǎn)率計(jì)算公式為：

Φx = Φs（Ix/Is）（As/Ax）（nx/ns）2 （1）

其中， A 為吸光度值， I 代表熒光積分面積， n 為溶劑的折射率（ns=1.33， nx=1.43）， Φ 代表量子產(chǎn)率（其中硫酸奎寧的Φs=0.54[31]），下標(biāo)s 和x 分別代表硫酸奎寧和探針NC-TPA-PPh3。

1.4.3 計(jì)算方法

采用Gaussian 09 軟件對化合物NC-TPA-PPh3 和TPA-CHO 進(jìn)行幾何結(jié)構(gòu)優(yōu)化，使用B3LYP 泛函在6-31G 基組水平上進(jìn)行計(jì)算，電子密度分布圖和分子軌道圖通過Multiwfn 軟件繪制[32]。

1.4.4 實(shí)際樣品分析

將烏魯木齊市本地自來水樣品用0.22 μm 的濾膜過濾3 次以去除懸浮污染物。使用過濾后的水樣分別配制ClO–濃度分別為20、30、40、50、60、70、80 μmol/L 的探針NC-TPA-PPh3（20 μmol/L）的DMSO/H2O 溶液（9∶1， V/V， pH=7.4），在室溫下反應(yīng)26 min 后，記錄其在430 nm 處的熒光強(qiáng)度，計(jì)算回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 探針NC-TPA-PPh3 的光物理性質(zhì)

使用紫外-可見分光光度計(jì)、熒光分光光度計(jì)分別測定探針NC-TPE-PPh3 在DMSO 溶液中的紫外-可見吸收光譜、熒光發(fā)射光譜、熒光量子產(chǎn)率和熒光壽命。由電子版文后支持信息圖S7A 可知，探針NC-TPE-PPh3 在305 nm 處有最大吸收峰。305 nm 處的吸收峰可歸因于探針NC-TPE-PPh3 結(jié)構(gòu)中共軛基團(tuán)的π-π*躍遷產(chǎn)生的K 帶[33]，而440 nm 處的吸收峰是在NC-TPE-PPh3 分子內(nèi)電子供體（D）-共軛連接體（π）-電子受體（A）之間的ICT 過程中產(chǎn)生[34]，因此探針NC-TPE-PPh3 在440 nm 處的吸收峰是與ICT帶相對應(yīng)的吸收峰。探針NC-TPE-PPh3 的DMSO 溶液在305 nm 激發(fā)波長下的最大發(fā)射波長為550 nm。以硫酸奎寧溶液（Φ=0.54）為參考，測得探針NC-TPE-PPh3（10 μmol/L）在DMF 溶液中的熒光量子產(chǎn)率為0.51，固態(tài)時間分辨熒光測量結(jié)果顯示其壽命為3.71 ns（電子版文后支持信息圖S7B）。

2.2 探針NC-TPA-PPh3 對HClO/ClO–的熒光響應(yīng)

利用熒光光譜法研究了不同條件下探針NC-TPA-PPh3 對HClO/ClO–的識別性能。如圖2 所示，在300 nm 激發(fā)波長下， 20 μmol/L NC-TPA-PPh3 的DMSO/H2O（9∶1， V/V）溶液的熒光強(qiáng)度較弱，且最大發(fā)射波長位于550 nm。在100 μmol/L HClO/ClO–存在下，此探針溶液的最大發(fā)射波長藍(lán)移至430 nm 處，且熒光強(qiáng)度從12 增加至564，表現(xiàn)出顯著的熒光增強(qiáng)。當(dāng)HClO/ClO–的濃度降低至50 μmol/L時，探針在430 nm 處的熒光增強(qiáng)效應(yīng)明顯減弱。相比之下，在水體積分?jǐn)?shù)為90%的DMSO/H2O 溶液中， 20 μmol/L NC-TPA-PPh3 與100 μmol/LHClO/ClO–反應(yīng)后，探針的最大發(fā)射波長和熒光強(qiáng)度均未發(fā)生明顯變化。綜上所述， 20 μmol/L探針NC-TPA-PPh3 在DMSO/H2O（9∶1， V/V）溶液中能夠有效識別HClO/ClO–。

2.3 pH 值對探針NC-TPA-PPh3 識別HClO/ClO–的影響

在不同pH 值的DMSO/H2O（9∶1， V/V）中，探針NC-TPA-PPh3（20 μmol/L）對HClO/ClO–的熒光響應(yīng)如圖3 所示。當(dāng)pH 值在2～8 之間時，空白探針NC-TPA-PPh3 溶液的熒光強(qiáng)度較低（～20）；而與100 μmol/L HClO/ClO–作用后，熒光強(qiáng)度顯著增大至550 左右；當(dāng)pH 值大于8 時，探針NC-TPA-PPh3 與HClO/ClO–作用前后的熒光強(qiáng)度分別呈上升和下降趨勢。上述結(jié)果表明，探針NC-TPA-PPh3 在較寬的pH 范圍（2～8）內(nèi)對HClO/ClO–具有高效且穩(wěn)定的熒光響應(yīng)性能。基于國家標(biāo)準(zhǔn)[2]規(guī)定的生活飲用水pH=6.5～8.5，為模擬實(shí)際水樣和細(xì)胞內(nèi)的pH條件，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇pH=7.4 進(jìn)行測試。

2.4 時間對探針NC-TPA-PPh3 識別HClO/ClO–的影響

探針NC-TPA-PPh3 對HClO/ClO–的熒光響應(yīng)隨時間的變化如圖4 所示。加入100 μmol/LHClO/ClO–后，探針NC-TPA-PPh3 在430 nm 處的熒光強(qiáng)度隨時間（0～25 min）的延長而逐漸增強(qiáng)，并在26 min 時達(dá)到最大，隨后趨于穩(wěn)定。因此，選擇反應(yīng)時間為26 min。

2.5 探針NC-TPA-PPh3 的選擇性

在最優(yōu)測試條件下，考察了探針NC-TPAPPh3對HClO/ClO–的選擇性，結(jié)果如圖5 所示。20 μmol/L 探針NC-TPA-PPh3 溶液（DMSO/H2O，9∶1， V/V， pH=7.4）對100 μmol/L HClO/ClO–表現(xiàn)出“turn-on”識別，且熒光信號藍(lán)移至430 nm，熒光強(qiáng)度由16 增大到571，增強(qiáng)了35.7 倍。而在其它ROS/RNS（1O2、TBO–、TBHP、NO–、H2O2、·OH、ONOO–）、金屬陽離子（K+、Li+、Ag+、Na+、Hg2+、Mg2+、Cd2+、Pb2+、Mn2+、Ni+、Co2+、Ba2+、Ca2+、Cu2+、Zn2+、Cr3+、Al3+、Fe3+）及陰離子（C2O4 2–、Br–、F–、CO3 2–、I–、H2PO4 2–、Cl–、NO3–、ClO2– ）存在下，探針NC-TPA-PPh3 未表現(xiàn)出顯著的熒光增強(qiáng)現(xiàn)象（電子版文后支持信息圖S8）。上述結(jié)果表明探針對HClO/ClO–具有較高的選擇性，表現(xiàn)為熒光“turn-on”響應(yīng)。

2.6 探針NC-TPA-PPh3 的抗干擾性能

實(shí)際水樣中存在多種離子，可能對探針NC-TPA-PPh3 識別HClO/ClO–產(chǎn)生干擾。為評價探針NC-TPA-PPh3 的抗干擾性能，測試了探針在陰離子（C2O42–、Br–、F–、CO32–、I–、H2PO42–、Cl–、NO3–、ClO2–）、金屬陽離子（K+、Li+、Ag+、Na+、Hg2+、Mg2+、Cd2+、Pb2+、Mn2+、Ni+、Co2+、Ba2+、Ca2+、Cu2+、Zn2+、Cr3+、Al3+、Fe3+）及其它ROS/RNS（1O2、TBO–、TBHP、NO–、H2O2、·OH、ONOO–）存在下的熒光響應(yīng)情況。如圖6 所示，當(dāng)HClO/ClO–存在時， 20 μmol/L 探針NC-TPA-PPh3（DMSO/H2O（9∶1， V/V，pH=7.4））在430 nm 處的熒光出現(xiàn)了增強(qiáng)現(xiàn)象。在此體系中，其余干擾離子的存在未對探針的熒光響應(yīng)產(chǎn)生顯著影響，表明探針具有良好的抗干擾性能，有望用于復(fù)雜的生物環(huán)境中的分析檢測。

2.7 探針NC-TPA-PPh3 對HClO/ClO–的分析性能

通過熒光滴定實(shí)驗(yàn)研究了探針NC-TPAPPh3識別HClO/ClO–的靈敏度。探針NCTPA-PPh3 對不同濃度HClO/ClO–的熒光響應(yīng)性能如圖7 所示。20 μmol/L 探針NC-TPAPPh3的DMSO/H2O（9∶1， V/V， pH=7.4）溶液在430 nm 處的熒光強(qiáng)度隨HClO/ClO–濃度（0～100 μmol/L）增大而增大。HClO/ClO–濃度在15～100 μmol/L范圍內(nèi)，探針NC-TPA-PPh3在430 nm 處的熒光強(qiáng)度與HClO/ClO–濃度呈良好的線性關(guān)系，線性方程為y=5.79x–23.15（R2=0.997），檢出限（LOD=3S/K，其中S 是空白標(biāo)準(zhǔn)偏差， K 是熒光強(qiáng)度與HClO/ClO–濃度的斜率）為9.16×10–8 mol/L。與已報(bào)道的HClO/ClO–檢測方法相比（表1），探針NC-TPA-PPh3 對HClO/ClO–具有更高的識別靈敏度。

2.8 探針NC-TPA-PPh3 識別HClO/ClO–的機(jī)理

探究了NC-TPA-PPh3 識別HClO/ClO–的機(jī)理。將5 mL 20 μmol/L 的探針NC-TPA-PPh3（DMSO/H2O（9∶1， V/V， pH=7.4））與0.5 μmol ClO–于室溫下孵育反應(yīng)26 min，隨后分離反應(yīng)產(chǎn)物，對其進(jìn)行1H NMR 和ESI-MS 表征。1H NMR 結(jié)果如電子版文后支持信息圖S9 所示，化學(xué)位移在10.03 ppm 處的信號峰對應(yīng)醛基氫。根據(jù)1H NMR 譜圖分析，在ClO–存在下，探針NC-TPA-PPh3 可能發(fā)生雙鍵斷裂生成TPA-CHO。ESI-MS 圖（電子版文后支持信息圖S10）中m/z 350.15 處的峰可歸屬于化合物TPA-CHO（M=349.15 mol–1）的M+1 分子離子峰，進(jìn)一步驗(yàn)證了TPA-CHO 的存在。SEM 圖顯示了探針NC-TPA-PPh3 與ClO–反應(yīng)前后的形貌變化。識別前探針NC-TPA-PPh3 呈現(xiàn)單個個體的分散形貌（圖8A），但探針NC-TPA-PPh3 識別ClO–后的產(chǎn)物聚集在一起（圖8B），形成聚集體。

理論計(jì)算結(jié)果表明，探針NC-TPA-PPh3 和TPA-CHO 的HOMO 上的π 電子均集中在三苯胺基團(tuán)；而探針NC-TPA-PPh3 的LUMO 中的π 電子位于丙烯氰基， TPA-CHO 的LUMO 中的π 電子則主要分布在醛基（圖9）。探針NC-TPA-PPh3 的躍遷能為2.10 eV，顯著小于TPA-CHO（3.24 eV），這與識別前后熒光光譜的藍(lán)移現(xiàn)象相符。

結(jié)合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、理論計(jì)算及相關(guān)文獻(xiàn)[38-39]，推測探針識別ClO– 的機(jī)理如圖10 所示：ClO–氧化探針中的C=C 鍵，生成低水溶性且共軛程度較小的TPA-CHO，破壞了探針的D-π-A 結(jié)構(gòu)并抑制了ICT 過程，導(dǎo)致熒光發(fā)射峰從550 nm 藍(lán)移至430 nm，同時顯著增強(qiáng)了430 nm 處的熒光強(qiáng)度。

2.9 實(shí)際樣品檢測

為驗(yàn)證方法的實(shí)用性，將探針NC-TPA-PPh3 應(yīng)用于烏魯木齊市自來水實(shí)際樣品中ClO–的檢測，結(jié)果如表2 所示。自來水樣中ClO–的加標(biāo)回收率為98.1%～103.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.7%～1.3%。此結(jié)果表明，探針NC-TPA-PPh3 檢測水樣中的ClO–具有良好的實(shí)用性與準(zhǔn)確性。

3 結(jié)論

本研究設(shè)計(jì)了一種基于D-π-A 結(jié)構(gòu)的熒光增強(qiáng)型HClO/ClO–探針NC-TPA-PPh3。在DMSO/H2O 溶液（9∶1， V/V， pH=7.4）中，探針NC-TPE-PPh3 （20 μmol/L）對HClO/ClO–表現(xiàn)出較高的選擇性和良好的抗干擾性，檢出限為9.16×10–8 mol/L。結(jié)合1H NMR、ESI-MS、SEM 及理論計(jì)算，推測探針NC-TPA-PPh3對HClO/ClO–的響應(yīng)機(jī)制為ClO–誘導(dǎo)C=C 鍵氧化斷裂，生成了低水溶性、低共軛結(jié)構(gòu)的TPA-CHO，破壞了探針的D-π-A 結(jié)構(gòu)并阻斷了ICT 過程，進(jìn)而引起最大發(fā)射波長藍(lán)移至430 nm和430 nm 處的熒光增強(qiáng)。將探針用于實(shí)際自來水樣中ClO–的檢測，回收率gt;98%，顯示出良好的實(shí)際應(yīng)用性能。本研究制備的探針NC-TPA-PPh3 可用于環(huán)境水體中HClO/ClO–的檢測，具有良好的應(yīng)用潛能。

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支持信息

具有D-π-A 結(jié)構(gòu)的三苯胺類HClO/ClO-熒光探針的合成及性質(zhì)研究

田勇琪 李富卓 楊欣月 曾竟

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No. 2022D01A95）資助。