微酸性次氯酸對(duì)番茄灰霉病和灰葉斑病的抑制作用

余朝閣，隋心意，丁 勇，李 穎，齊蘊(yùn)榮，劉佩鈺

（1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/設(shè)施園藝教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng) 110161；2.沈陽(yáng)溢源生物科技有限公司，沈陽(yáng) 110179；3.撫順市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與扶貧開(kāi)發(fā)促進(jìn)中心，遼寧 撫順 113006；4.法庫(kù)縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，遼寧 法庫(kù) 110400）

番茄是設(shè)施栽培重要果菜，灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的灰霉病和茄匍柄霉（Stemphylium solani）引起的灰葉斑病是設(shè)施栽培番茄兩大重要病害，嚴(yán)重影響產(chǎn)量和品質(zhì)。在番茄設(shè)施栽培生產(chǎn)中，普遍長(zhǎng)期依賴化學(xué)農(nóng)藥防治作物病害，這不僅容易造成環(huán)境和產(chǎn)品的污染，還會(huì)導(dǎo)致病菌產(chǎn)生抗性，化學(xué)防治效果越來(lái)越難以令人滿意[1]。因此，探索更加綠色環(huán)保和高效的病害防治方法已成為生產(chǎn)中急需解決的重要問(wèn)題。

次氯酸可抑制人類、動(dòng)物和植物上的多種病原物，次氯酸對(duì)病原物起抑制作用的有效氯包括HClO 分子和ClO-離子[2]，其中HClO 的殺菌能力顯著強(qiáng)于ClO-[3]，在微酸性條件下次氯酸主要以HClO 分子形式存在[4-5]，殺菌效果好；而HClO 見(jiàn)光后易于分解，其終產(chǎn)物主要為Cl－和O2，所以不污染環(huán)境和產(chǎn)品。由于次氯酸具有殺菌譜廣、對(duì)環(huán)境和產(chǎn)品無(wú)污染、無(wú)殘留等優(yōu)點(diǎn)，所以，當(dāng)前次氯酸已廣泛應(yīng)用于衛(wèi)生、食品和物流等多個(gè)領(lǐng)域，并在植物病害的防治中也有部分研究和應(yīng)用[6-7]。但是，關(guān)于次氯酸在防治植物病害中的適宜濃度、施用時(shí)期、間隔時(shí)間等使用技術(shù)等方面研究尚不系統(tǒng)。

本研究以微酸性次氯酸和L402番茄為試材，首先探明微酸性次氯酸對(duì)番茄植株無(wú)傷害作用的有效氯濃度范圍；然后探索對(duì)番茄灰霉病和灰葉斑病病原物（B.cinerea和S.solani）的生長(zhǎng)和繁殖具較好地抑制作用，及對(duì)上述兩種病害具有良好防治效果的次氯酸最佳有效氯濃度；最后進(jìn)一步探明最佳有效氯濃度的次氯酸防治番茄灰霉病和灰葉斑病的最適施用時(shí)期和間隔時(shí)間。研究結(jié)果篩選出既不傷害番茄葉片、又能較好地抑制病菌和防治病害的最適次氯酸有效氯濃度，并明確其防治兩種病害的最佳施用時(shí)期和間隔時(shí)間，為應(yīng)用次氯酸防治蔬菜病害、實(shí)現(xiàn)設(shè)施蔬菜安全優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2018年3月至2019年5月在沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院科研基地和設(shè)施園藝教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。供試番茄（Solanum lycopersicumL.）品種為L(zhǎng)402，由遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院培育獲得。供試育苗和分苗所用基質(zhì)為沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)蔬菜無(wú)土育苗營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)（專利號(hào)：ZL03133591.8）。

供試灰葡萄孢（B. cinereacinerea）和茄匍柄霉（S. solani）分別采集自田間番茄灰霉病病果和灰葉斑病病葉，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室分離、純化，并經(jīng)鑒定為上述病菌后于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

供試次氯酸為沈陽(yáng)溢源生物科技有限公司生產(chǎn)，氧化還原電位996mV，有效氯濃度為100mg·L-1。

1.2 方法

用碘量法對(duì)次氯酸有效氯濃度（ACC）標(biāo)定無(wú)誤后，再用無(wú)菌水配制有效氯濃度為0，20，40，60，80，100mg·L-1的次氯酸水溶液，各濃度次氯酸水溶液pH值為6.2±0.1。分別用無(wú)菌水配制106cfu的灰葡萄孢和茄匍柄霉孢子懸液備用。

番茄采用50 孔穴盤育苗，5 葉1 心期定植于上口徑和高度均為12cm 的塑料缽中，缽中所裝基質(zhì)高度為10cm。然后于白天溫度25℃、相對(duì)濕度70%，夜間溫度12℃、相對(duì)濕度90%，晝夜時(shí)長(zhǎng)均為12h 的條件下培養(yǎng)。

1.2.1 次氯酸對(duì)番茄幼苗生長(zhǎng)的影響 定植緩苗7d 后選株高和長(zhǎng)勢(shì)一致的秧苗，分別用有效氯濃度為0（對(duì)照），20，40，60，80，100mg·L-1的次氯酸噴霧番茄葉片的正反兩面，均勻噴至葉片表面完全濕潤(rùn)而無(wú)水滴下流為止。每處理5株，3次重復(fù)。處理后14d測(cè)定番茄株高、莖粗、植株鮮重、地下部分和地上部分干重等生長(zhǎng)指標(biāo)，并計(jì)算全株干重、根冠比及壯苗指數(shù)，壯苗指數(shù)計(jì)算公式為：

1.2.2 次氯酸對(duì)番茄葉片的傷害作用 次氯酸處理24h后取各處理番茄葉片，用去離子水反復(fù)沖洗干凈，并且注意不要對(duì)葉片造成機(jī)械損傷。晾干后用直徑為5mm 的打孔器在各處理不同葉位的葉片上打取相同數(shù)量的葉圓片，然后測(cè)定各處理葉圓片的電導(dǎo)率，并計(jì)算相對(duì)電導(dǎo)率[8]。每處理5株，試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

1.2.3 次氯酸對(duì)病菌孢子萌發(fā)率的影響 分別用0（CK），20，40，60，80，100mg·L-1的次氯酸（1mL）均勻噴霧剛長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿的灰葡萄孢和茄匍柄霉菌落，噴霧后立即蓋上培養(yǎng)皿蓋于25℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，36，44，52，60，68h后，用10mL無(wú)菌水洗脫各處理培養(yǎng)皿中的分生孢子，振蕩10min使孢子均勻懸浮，然后在顯微鏡下觀測(cè)病菌孢子總數(shù)和萌發(fā)數(shù)量，計(jì)算孢子萌發(fā)率。每處理5個(gè)培養(yǎng)皿，試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

1.2.4 不同濃度對(duì)次氯酸防病效果的影響 定植7d 后選長(zhǎng)勢(shì)一致的秧苗分為2 組，每組5 簇，每簇5 株，對(duì)上述兩組番茄秧苗分別噴施106cfu的灰葡萄孢和茄匍柄霉孢子懸液接種，晾干（約30min）后對(duì)每組各簇秧苗分別噴施0（對(duì)照），40，60，80，100mg·L-1次氯酸水溶液。孢子懸液和次氯酸溶液均噴霧至葉片均勻濕潤(rùn)而無(wú)水滴聚集，每處理設(shè)3次重復(fù)。接種后第7天調(diào)查各處理發(fā)病程度，并計(jì)算病情指數(shù)。

病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為：0 級(jí)，未發(fā)病；1 級(jí)，病斑面積占葉片總面積的5%以下；3 級(jí)，病斑面積占葉片總面積的6%～10%；5級(jí)，病斑面積占葉片總面積的11%～25%；7級(jí)，病斑面積占葉片總面積的26%～50%；9級(jí)，病斑面積占葉片總面積的50%以上[9]。按照公式計(jì)算病情指數(shù)，病情指數(shù)計(jì)算公式為：

1.2.5 不同施用時(shí)間對(duì)次氯酸防病效果的影響 番茄秧苗定植緩苗7d后，分別在噴霧接種灰葡萄孢和茄匍柄霉前48，24，12，6，0h，和接種后6，12，24，48，72h噴施80mg·L-1的次氯酸，其中病菌接種與次氯酸同時(shí)處理為直接用80 mg·L-1的次氯酸配制106cfu 的灰葡萄孢或茄匍柄霉孢子懸液，以僅接種病菌不噴施次氯酸溶液的處理為對(duì)照。每處理5株，3次重復(fù)。接種后第7天調(diào)查發(fā)病程度并計(jì)算病情指數(shù)。

1.2.6 不同間隔時(shí)間對(duì)次氯酸防病效果的影響 番茄秧苗定植緩苗7d后，分別用106cfu的灰葡萄孢和茄匍柄霉孢子懸液噴霧接種，在接種后2，4，6d噴施80mg·L-1次氯酸，其中接種2d后噴施次氯酸的處理每隔2d噴施1次氯酸、接種4d后噴施次氯酸的處理則每隔4d噴施1次氯酸、接種6d后噴施次氯酸的處理則每隔6d重復(fù)噴施次氯酸，所有處理在接種后每2d如果無(wú)次氯酸處理時(shí)則噴施等量的無(wú)菌水，如此處理至接種后第12d，以接種后每2d噴施一次無(wú)菌水而不噴施次氯酸的處理為對(duì)照，對(duì)照和處理噴施次氯酸和蒸餾的次數(shù)見(jiàn)表1。每處理5株，3次重復(fù)。番茄秧苗培養(yǎng)條件、病菌接種、次氯酸處理、病害調(diào)查方法等同前，接種后第15天調(diào)查發(fā)病程度并計(jì)算病情指數(shù)。

表1 不同間隔時(shí)間噴施次氯酸處理的實(shí)驗(yàn)安排Table 1 Experiment arrangement of hypochlorous acid treatment at different interval time

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)結(jié)果采用Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，然后用SPSS 19軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度次氯酸處理對(duì)番茄幼苗生長(zhǎng)和葉片的影響

2.1.1 不同濃度次氯酸處理對(duì)番茄生長(zhǎng)的影響 有效氯濃度為20～100mg·L-1時(shí)，次氯酸處理的番茄幼苗株高、莖粗、植株鮮重、植株干重、根冠比及壯苗指數(shù)等生長(zhǎng)指標(biāo)與未噴施對(duì)照差異并未達(dá)顯著水平（表2），可見(jiàn)，20～100mg·L-1的次氯酸處理對(duì)番茄幼苗的正常生長(zhǎng)影響不大。

表2 不同濃度有效氯處理后番茄植株的生長(zhǎng)指標(biāo)Table 2 Growth index of tomato plants treated with different concentrations of available chlorine

2.1.2 不同濃度次氯酸處理對(duì)番茄葉片的傷害作用由圖1可知，次氯酸有效氯濃度為20～80mg·L-1的處理，番茄葉片相對(duì)電導(dǎo)率與對(duì)照差異不顯著；但當(dāng)次氯酸有效氯濃度達(dá)100mg·L-1時(shí)，番茄葉片相對(duì)電導(dǎo)率比對(duì)照升高，差異達(dá)顯著水平（圖1）?？梢?jiàn)，次氯酸有效氯濃度為20～80mg·L-1的處理對(duì)番茄葉片無(wú)明顯傷害作用，次氯酸有效氯濃度為100mg·L-1時(shí)，對(duì)番茄葉片開(kāi)始產(chǎn)生一定的傷害。

圖1 不同濃度有效氯處理番茄葉片的相對(duì)電導(dǎo)率Figure 1 Relative electrical of tomato leaves treated with different concentrations of available chlorine

2.2 不同濃度次氯酸處理對(duì)2種病原物孢子萌發(fā)的影響

次氯酸對(duì)2 種病原物分生孢子萌發(fā)的抑制作用隨著其濃度的增大而增強(qiáng)。20mg·L-1和40mg·L-1次氯酸對(duì)2種病原物分生孢子萌發(fā)均有一定的抑制作用，但其抑制率均較低，對(duì)灰葡萄孢分生孢子萌發(fā)的抑制率分別為5.0%和12.3%，對(duì)茄匍柄霉分生孢子萌發(fā)的抑制率分別為8.3%和17.0%。60～100mg·L-1次氯酸不僅顯著抑制2種病原物的分生孢子萌發(fā)，且其抑制作用顯著高于20mg·L-1和40mg·L-1次氯酸處理；80mg·L-1和100mg·L-1次氯酸處理對(duì)2種病原物分生孢子萌發(fā)的抑制作用最強(qiáng)，二者對(duì)灰葡萄孢分生孢子萌發(fā)的抑制率分別達(dá)到了40.4%和46.2%，對(duì)茄匍柄霉分生孢子萌發(fā)的抑制率分別達(dá)到了41.6%和44.9%（圖2）。

圖2 不同濃度次氯酸處理對(duì)灰葡萄孢（A）和茄匍柄霉（B）孢子萌發(fā)率的影響Figure 2 Spore germination rate of B. cinerea (A) and S. solani (B) after treated with different concentrations available chlorine

2.3 次氯酸對(duì)番茄灰霉病和灰葉斑病的防治效果

2.3.1 不同濃度次氯酸對(duì)番茄灰霉病和灰葉斑病的防病效果 次氯酸處理可顯著降低番茄灰霉病和灰葉斑病的病情指數(shù)，且隨處理濃度增加病情指數(shù)降低。40mg·L-1次氯酸處理的灰霉病病情指數(shù)為55.0，比CK 降低38.6%，差異達(dá)到顯著水平。80mg·L-1和100mg·L-1次氯酸處理病情指數(shù)最低，且二者十分接近，約為CK的1/3。40mg·L-1次氯酸處理的灰葉斑病病情指數(shù)為71.1，比CK降低14.6%，差異達(dá)到顯著水平。60，80，100mg·L-1次氯酸處理灰葉斑病的病情指數(shù)在45.6～50.0 之間，顯著低于40mg·L-1處理和CK，且三者間差異不顯著（圖3）。綜上可知，80mg·L-1和100mg·L-1次氯酸對(duì)番茄灰霉病和灰葉斑均具有較高的防病效果，且兩個(gè)濃度處理間防病效果之間無(wú)顯著差異，所以后期以80mg·L-1次氯酸作為防治番茄灰霉病和灰葉斑的安全有效濃度。

2.3.2 不同時(shí)期施用次氯酸對(duì)番茄灰霉病和灰葉斑病的防病效果 接種前12h 以上施用次氯酸，對(duì)2 種病害幾乎均無(wú)預(yù)防作用；接種前6h至接種后48h施用次氯酸，對(duì)番茄灰霉病和灰葉斑病均具較好的預(yù)防效果，平均防效分別達(dá)56.8%和45.5%；其中，接種前6h施用次氯酸對(duì)灰霉病和灰葉斑病防效分別為39.7%和34.1%，接種0～48h后噴施次氯酸，對(duì)灰霉病和灰葉斑病防效分別達(dá)51.2%～64.5%和40.7%～55.2%；接種后72h噴施次氯酸，對(duì)兩種病害的防效則顯著降低，分別為20.7%和21.9%（圖4）。可見(jiàn)，應(yīng)用次氯酸防治番茄灰霉病和灰葉斑病，宜在番茄接種前6h至感病后48h以內(nèi)進(jìn)行及時(shí)處理。

圖3 不同濃度次氯酸處理番茄灰霉?。ˋ）和灰葉斑?。˙）的病情指數(shù)Figure 3 Disease index of tomato gray mold (A) and gray leaf spot (B) after treated with different concentrations available chlorine

圖4 不同時(shí)期施用次氯酸處理的番茄病情指數(shù)（A.灰霉?。籅.灰葉斑?。〧igure 4 Disease indice of tomato after treated with hypochlorous acid at different periods(A.Gray mold;B.Gray leaf spot)

2.3.3 不同間隔時(shí)間施用次氯酸對(duì)番茄灰霉病和灰葉斑的防病效果 由圖5可知，間隔2，4，6d噴施次氯酸的處理番茄灰霉病和灰葉斑病的病情指數(shù)均顯著低于對(duì)照，但不同間隔時(shí)間處理間的病情指數(shù)差異較大，間隔2d的處理病情指數(shù)顯著低于間隔6d的處理，間隔2d的處理和間隔4d的處理病情指數(shù)最低，且病情指數(shù)間無(wú)顯著差異?？梢?jiàn)，隔2～4d噴施次氯酸的處理對(duì)番茄灰霉病和灰葉斑病的預(yù)防有較好的抑制效果。

3 討論與結(jié)論

3.1 有效氯濃度對(duì)次氯酸抑菌和防病效果的影響

次氯酸具很強(qiáng)的殺菌效果，可有效殺滅多種禽畜和人體病原物[10-12]，所以被廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖和衛(wèi)生等領(lǐng)域。次氯酸溶液中其殺菌作用主要為HClO 分子，其殺菌能力顯著強(qiáng)于ClO-[3，13]，NaClO 溶液在偏酸性條件下（pH 值5～7）有效氯主要為HClO（90%以上），在堿性條件下ClO-所占比例增多，NaClO 溶液在pH 值5.7時(shí)對(duì)熒光假單胞菌（P.fluorescens）殺滅效果達(dá)98%，而在pH值7.6和pH值9.3時(shí)殺滅效果達(dá)僅為40%和1.3%[14-15]。

圖5 不同間隔時(shí)間施用次氯酸處理的番茄病情指數(shù)（A.灰霉??；B.灰葉斑?。〧igure 5 Disease index of tomato after treated with hypochlorous acid at different interval days(A.Gray mold;B.Gray leaf spot)

關(guān)于次氯酸對(duì)植物病害防治的研究報(bào)道較少，但與之相關(guān)的電解水防治植物病害的研究相對(duì)較多，而酸性或微酸性電解水中有效氯主要為HClO，研究發(fā)現(xiàn)，酸性或微酸性電解水在有效氯濃度50mg·L-1和80mg·L-1時(shí)，對(duì)黃瓜白粉病、番茄白粉病和細(xì)菌性葉斑病的防治效果均可達(dá)到60%以上[2，4]。另有研究發(fā)現(xiàn)，有效氯濃度為100mg·L-1的次氯酸處理可提高黃瓜種子發(fā)芽率、利于黃瓜植株生長(zhǎng)，而200mg·L-1效氯濃度的次氯酸則顯著抑制黃瓜的生長(zhǎng)[3]。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，有效氯濃度為80mg·L-1和100mg·L-1的次氯酸對(duì)灰霉病和灰葉斑病的孢子萌發(fā)及其所致病害發(fā)生程度均具較強(qiáng)的抑制作用，而80mg·L-1的次氯酸既不抑制番茄植株生長(zhǎng)，也不傷害番茄葉片，故80mg·L-1次氯酸處理是本研究較優(yōu)的處理濃度。另一方面，各濃度的次氯酸對(duì)病原物的抑制作用與其對(duì)相應(yīng)病害的防治效果表現(xiàn)基本一致，可見(jiàn)次氯酸的防病效果主要在于其對(duì)病原物的抑制作用。

3.2 次氯酸施用時(shí)期對(duì)其防病效果的影響

接種病菌孢子前6h至接種后48h施用次氯酸對(duì)番茄灰霉病和灰葉斑病均具較高的防病效果，更早或更晚施用次氯酸對(duì)病害的防效顯著降低，甚至無(wú)效。次氯酸是一種強(qiáng)氧化劑，即使在常溫下也會(huì)分解，而在高溫或強(qiáng)光條件分解更快[16-17]。所以應(yīng)用次氯酸防治上述病害需要把握好施用時(shí)期，施用過(guò)早可能由于次氯酸有效氯成分的分解而導(dǎo)致其抑菌效果迅速下降，施用過(guò)晚則可能病菌已在施用前已完成侵入和潛育，錯(cuò)過(guò)了最佳防治時(shí)期。

但是，由于本研究防病試驗(yàn)均為人工接種病原物，只有在接種處理時(shí)才將病原物人為施加到番茄上，所以提前噴施次氯酸的處理在接種之前不會(huì)影響到病原物。而實(shí)際生產(chǎn)中的病原物原本就存在于番茄所生長(zhǎng)的環(huán)境中，只要對(duì)溫室空間或番茄植株施用次氯酸處理，次氯酸所到之處不管病原物是否侵染植物均會(huì)對(duì)其產(chǎn)生影響。所以，實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用次氯酸在病害發(fā)生前進(jìn)行預(yù)防，有可能比在植物發(fā)病后進(jìn)行治療效果更佳，關(guān)于次氯酸在番茄灰霉病和灰葉斑病自然發(fā)病中的作用還需進(jìn)一步探索。

3.3 間隔時(shí)間對(duì)次氯酸防病效果的影響

植物病害防治的間隔時(shí)間是保證防治效果的重要因素之一，不同類型的病害或不同的藥劑防治間隔時(shí)間不同。王紅梅等[18]用氰烯菌酯懸浮劑防治小麥赤霉病發(fā)現(xiàn)，間隔4～10d 防治效果無(wú)顯著差異；喬志文等[19]用3種殺菌劑防治甜菜褐斑病發(fā)現(xiàn)，間隔7d和14d之間防治效果無(wú)顯著差異，但通常顯著高于間隔21d的防效。

本研究發(fā)現(xiàn)，番茄在接種灰霉病和灰葉斑病后每隔2～4d 噴施1 次次氯酸可有效抑制病害的發(fā)生，說(shuō)明次氯酸有效防治番茄灰霉病和灰葉斑病的適宜間隔期為2～4d。但是，由于次氯酸防病主要在于其抑菌作用，應(yīng)用次氯酸處理番茄植株或溫室空間，只要次氯酸施用到的地方，無(wú)論病原物是否侵染番茄植株，都必然對(duì)其產(chǎn)生抑制作用，減輕這些病原物繼續(xù)侵染植株，從而降低病害的發(fā)生程度，有可能間隔更長(zhǎng)時(shí)期也可達(dá)到有效防病的效果。

3.4 次氯酸防病效果與番茄生長(zhǎng)期的關(guān)系

灰霉病和灰葉斑病通常在番茄開(kāi)花結(jié)果以后易于發(fā)生，特別是灰霉病，在番茄開(kāi)花期花粉散落在葉片上，容易感染灰霉病[20]，這是因?yàn)榉言陂_(kāi)花結(jié)果期營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)同時(shí)進(jìn)行，導(dǎo)致植株抗病性與單純營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)相比有所下降。本研究用于防病試驗(yàn)的番茄植株為5葉1心期秧苗，并經(jīng)過(guò)7d緩苗過(guò)程，該時(shí)期番茄秧苗處于營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)后期并向花芽分化和開(kāi)花期過(guò)渡階段，其防病試驗(yàn)結(jié)果對(duì)番茄成株期灰霉病和灰葉斑病的防治具有同樣參考價(jià)值；同時(shí)，該階段也是預(yù)防番茄多種病害發(fā)生的關(guān)鍵時(shí)期。

綜上，在番茄灰霉病和灰葉斑病發(fā)生初期（2d 之內(nèi)），每2～4d 使用1 次80mg·L-1有效氯濃度的微酸性次氯酸，不僅可有效預(yù)防上述兩種病害，而且對(duì)番茄植株生長(zhǎng)影響不大，對(duì)番茄葉片的傷害作用也較小。