胃癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞與凝血功能及預(yù)后的研究

楊 漢 陳怡璋 崔笑雯 陳 楠 湯翠菊

胃癌是世界上第四大最常見的惡性腫瘤，也是第二大癌癥死亡原因[1]。幾乎三分之二的病例發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家，其中42%發(fā)生在中國(guó)。大部分胃癌患者在確診時(shí)已是晚期。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)作為預(yù)測(cè)總生存期(OS)、無(wú)進(jìn)展生存期(PFS)、復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)和化療有效性的生物標(biāo)志物，一直受到臨床醫(yī)師的關(guān)注。在惡性腫瘤患者中，大約一半的患者表現(xiàn)為凝血功能異常。高凝狀態(tài)是癌癥患者發(fā)生血栓的重要危險(xiǎn)因素，并可能在疾病進(jìn)展中發(fā)揮作用。本文就胃癌患者CTC水平與凝血指標(biāo)及預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行研究，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年9月至2017年9月在南京市第一醫(yī)院收治的103例經(jīng)病理證實(shí)的胃癌患者。其中男性74例，女性29例，年齡40～80歲，平均年齡66.2歲。62例患者行根治性胃切除術(shù)，30例患者行姑息性胃切除術(shù)，10例患者行剖腹探查術(shù)，1例患者未經(jīng)手術(shù)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者年齡至少為18歲但不超過(guò)80歲；②經(jīng)病理證實(shí)患有胃癌；③患者之前未接受過(guò)新輔助放化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①處于懷孕、哺乳或生育期；②診斷患有其他腫瘤；③有血栓栓塞、家族性凝血障礙、嚴(yán)重感染或彌散性血管內(nèi)凝血病史；④手術(shù)前1個(gè)月內(nèi)接受過(guò)抗凝或抗血小板聚集治療；⑤合并心、肝或腎功能不全患者。所有患者在手術(shù)后均根據(jù)NCCN指南進(jìn)行治療，隨訪至2018年9月31日。所有患者均簽署書面知情同意書。

1.2 檢測(cè)方法

胃癌患者于手術(shù)前2天采集靜脈血樣本。采用SF-8100全自動(dòng)凝血測(cè)試儀測(cè)定凝血四項(xiàng)水平。使用邁瑞B(yǎng)C6800全自動(dòng)血液分析儀檢測(cè)PLT。采用陰性免疫磁微粒法和熒光原位雜交法檢測(cè)CTC，具體如下：準(zhǔn)備CS1工作液(1×)、CS2工作液(1×)、CS3分離介質(zhì)、抗CD45磁微?；鞈乙旱龋胶庵潦覝?。充分混勻一次性真空采血管中的全血樣本，取4 ml全血至50 ml離心管中。用CS1沖洗標(biāo)本管管壁，將離心管內(nèi)的體積補(bǔ)充到45 ml。離心，吸去上清，留12 ml于離心管，輕搖離心管混勻沉淀細(xì)胞?；靹蚝蠹尤隒S2至45 ml。將離心管置于垂直混勻儀混勻，室溫8～10 min(20 rpm)。離心(650 g，室溫，5 min)，吸棄上清吸干，加300 μl的CS2。豎直離心管，沿水平方向搖勻，補(bǔ)加5 ml CS1。建議按量取用CS2。吸取適量磁微?；鞈乙褐? ml離心管中，置于磁力架上1 min左右。待溶液澄清后，吸棄澄清溶液。重復(fù)3次后按每份150 μl的劑量緩慢加入離心樣本中，充分混勻20 min。移動(dòng)到裝有3 ml CS3的離心管內(nèi)，配平后離心(300 g，室溫，5 min)。吸取最上兩層溶液于15 ml離心管中，補(bǔ)加CS1至14 ml，離心(950 g，室溫，5 min)，棄上清至約300 μl，沿管壁加入1 ml CS1，輕柔吹打重懸沉淀細(xì)胞。將標(biāo)本轉(zhuǎn)移至2 ml離心管中，置于磁力架上，室溫2～3 min，將上清轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管中。將1.5 ml離心管架于15 ml離心管上端，水平離心(2070 g，室溫，3 min)，棄上清至約100 μl，加入CF1固定液100 μl，充分輕柔吹打混勻10次以上，涂片至(20×20)mm2的免疫組化標(biāo)本框中，自然干燥標(biāo)本。免疫熒光染色：按每人份20 μl抗人CD45-AF594熒光抗體，加入180 μl 2% BSA溶液的比例，配制抗體工作液，混勻，避光待用。用0.2% BSA清洗標(biāo)本區(qū)2次。吸去標(biāo)本片上的0.2% BSA，將配制好的抗體加至標(biāo)本區(qū)，室溫下避光孵育1～1.5 h。用0.2% BSA清洗標(biāo)本區(qū)2次，DAPI復(fù)染，蓋片。使用生物熒光顯微鏡沿“S”軌跡觀察載玻片，并且利用裝有TCapture軟件的電荷耦合器件(CCD)相機(jī)(TucsenH694C)觀察全片，進(jìn)行圖像分析。聯(lián)合CD45、DAPI、CEP8和CD17的染色數(shù)據(jù)來(lái)進(jìn)行CTC計(jì)數(shù)。試劑盒規(guī)定CTC 數(shù)目≥2個(gè)為CTC陽(yáng)性。

1.3 觀察指標(biāo)及評(píng)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)

CTCs陽(yáng)性的判斷標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)CEP8、CEP17的表達(dá)狀態(tài)分為3類異常細(xì)胞：DAPI+/CD45-/CEP8=2/CEP17>2(8號(hào)染色體信號(hào)點(diǎn)兩個(gè)，17號(hào)染色體信號(hào)點(diǎn)多于2個(gè))，或DAPI+/CD45-/CEP17=2/CEP8>2(17號(hào)染色體信號(hào)點(diǎn)兩個(gè)，8號(hào)染色體信號(hào)點(diǎn)多于2個(gè))，或DAPI+/CD45-/CEP8>2/CEP17>2(8號(hào)和17號(hào)染色體信號(hào)點(diǎn)均超過(guò)2個(gè))。以上3類異常細(xì)胞均納入CTC計(jì)數(shù)。CTC數(shù)目≥2個(gè)為CTC陽(yáng)性。

各凝血指標(biāo)的正常范圍：APTT：9～13 s；PT：24～32.8 s；FIB：2～4 g/l；TT：14～21 s；D-D：0～0.5 mg/l；PLT：125～350×109。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)如符合正態(tài)分布，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示計(jì)量資料(如不符合則選用中位數(shù))，t檢驗(yàn)或單因素方差分析進(jìn)行組間比較(如不符合則選用兩樣本或多樣本秩和檢驗(yàn))。比較胃癌患者臨床特征和凝血指標(biāo)的關(guān)系。將CTC按數(shù)目分為CTC陽(yáng)性和CTC陰性兩組，使用Logistics分析D-D、PLT對(duì)CTC。采用Cox回歸模型進(jìn)行多因素分析各變量與胃癌預(yù)后的關(guān)系。采用Kaplan-Meier方法計(jì)算不同CTC水平下患者的生存曲線，并通過(guò)Log-rank檢驗(yàn)確定P值。P<0.05表明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 凝血指標(biāo)和臨床特征的相關(guān)性

在本研究中，6項(xiàng)凝血指標(biāo)(D-D數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)分布，其余均滿足)均不受患者年齡、性別、腫瘤原發(fā)部位影響，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。不同分化程度、TNM分期以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移狀態(tài)的患者之間D-D、PLT水平的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。FIB水平可能與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移狀態(tài)有一定關(guān)系，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 患者臨床特征與凝血指標(biāo)的關(guān)系

2.2 胃癌患者CTC與凝血指標(biāo)的關(guān)系

在103例胃癌患者中，共有CTC陰性(<2)41例，CTC陽(yáng)性(≥2)62例。對(duì)6組凝血指標(biāo)進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)果提示在CTC陽(yáng)性組中D-D、PLT水平明顯高于CTC陰性組(P<0.05)，其余各項(xiàng)指標(biāo)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示D-D、PLT和CTC可能存在一定聯(lián)系，見表2。

表2 胃癌患者CTC與凝血因子的關(guān)系

以D-D、PLT兩項(xiàng)指標(biāo)為自變量，CTC陽(yáng)性(≥2)為因變量(陽(yáng)性賦值為1，陰性賦值為0)，使用logistics回歸方法計(jì)算兩組數(shù)據(jù)與CTC陽(yáng)性率的關(guān)系，結(jié)果D-D、PLT均納入回歸方程中(P<0.05)，OR為3.95和1.01，提示CTC陽(yáng)性率與D-D、PLT均有明顯關(guān)系，見表3。

表3 D-D、PLT的二元logistics回歸分析

2.3 胃癌患者CTC與預(yù)后的關(guān)系

隨訪時(shí)間至2019年7月30日，研究結(jié)束時(shí)共計(jì)43例(41.9%)患者死亡。以月(m)為時(shí)間單位。中位隨訪時(shí)間為16.3 m，中位OS為24 m(95%CI:15.1～32.9 m)。根據(jù)CTC狀態(tài)分層，CTC陰性的患者的中位OS為35.7 m(95%CI:32.5～38.9)，CTC陽(yáng)性患者的中位OS為16.5 m(95%CI:8.31～12.97)。不同CTC狀態(tài)患者的OS差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖1。采用Cox回歸模型進(jìn)行的多因素生存分析表明，血漿D-D水平是胃癌患者生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(HR=2.369，95%CI:1.704～3.293，P<0.05)。見表4。

表4 CTC、D-D、PLT的Cox回歸分析

圖1 胃癌患者不同CTC狀態(tài)的Kaplan-Meier曲線

3 討論

腫瘤患者常伴有凝血功能紊亂及血栓[2]。凝血過(guò)程中纖溶激活系統(tǒng)在腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移中起著重要作用。腫瘤細(xì)胞分泌的尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPA)產(chǎn)生纖溶酶，纖溶酶催化降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)，從而促進(jìn)腫瘤浸潤(rùn)和腫瘤細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)[3-4]，提示循環(huán)腫瘤細(xì)胞可能與凝血系統(tǒng)存在一定聯(lián)系。

組織因子(TF)是1種跨膜糖蛋白，與膜磷脂共同參與血液高凝的發(fā)生過(guò)程。一般情況下，只有當(dāng)血管結(jié)構(gòu)受到破壞，血液暴露在血管外時(shí)，血液中的凝血因子與血管外表表達(dá)TF的細(xì)胞接觸才會(huì)激活凝血系統(tǒng)。而在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中，血液中TF表達(dá)陽(yáng)性的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)可促進(jìn)凝血酶的生成和纖維蛋白的生成，從而導(dǎo)致病理性血栓的形成。Lee等通過(guò)建立CTC及凝血酶濃度梯度的數(shù)學(xué)計(jì)算模型，發(fā)現(xiàn)CTC在血流中的空間分布決定了局部凝血酶的濃度，證明了CTC對(duì)血液高凝狀態(tài)的促進(jìn)作用[5]。Wang等發(fā)現(xiàn)血小板可被骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSCs)和癌細(xì)胞激活，而活化的血小板增強(qiáng)了BM-MSCs促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的能力[6]。Diao等分析了41例晚期原發(fā)性胃癌患者的血漿D-D水平和CTC值，發(fā)現(xiàn)D-D水平與CTC數(shù)呈線性相關(guān)(R2=0.688，P<0.001)[7]。D-D雖不能促進(jìn)CTC的轉(zhuǎn)移，但其作為凝血過(guò)程中穩(wěn)定的最終產(chǎn)物能準(zhǔn)確的反映血液高凝狀態(tài)?？梢娧焊吣隣顟B(tài)也能促進(jìn)CTC的轉(zhuǎn)移。在本研究中103例胃癌患者中發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者有42例，其中CTC陽(yáng)性的患者有34例，CTC陽(yáng)性率為80.95%，明顯高于無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者(陽(yáng)性率32.79%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。證明CTC水平的升高可能促進(jìn)了胃癌的轉(zhuǎn)移。Logistics回歸分析，D-D、PLT水平與CTC的陽(yáng)性率有密切關(guān)系，進(jìn)一步說(shuō)明D-D、PLT水平的升高即血液高凝狀態(tài)可能促進(jìn)了CTC在其他器官的種植、侵襲和轉(zhuǎn)移。

近年來(lái)有大量研究證實(shí)CTC的檢測(cè)對(duì)胃癌患者的預(yù)后有重要意義[8-10]。Wang等對(duì)胃癌患者的19項(xiàng)CTC研究進(jìn)行了薈萃分析，提示患者CTC陽(yáng)性與更短的總生存期有關(guān)(HR=2.42，95%CI:1.94～3.02，P<0.001)[11]。Okabe等在一項(xiàng)針對(duì)136名Ⅰ～Ⅳ期胃癌患者的研究報(bào)告，CTC陽(yáng)性的患者的無(wú)進(jìn)展生存期明顯短于CTC陰性的患者(P=0.016)[12]。本研究使用Kaplan-Meier分析顯示對(duì)于未經(jīng)治療的胃癌患者不同的CTC狀態(tài)，患者的OS有顯著差異(P<0.05)。同樣，血液高凝狀態(tài)也是腫瘤患者預(yù)后不佳的標(biāo)志。Sorensen等指出，同時(shí)診斷有癌癥和靜脈血栓的患者的一年生存率為12%，而未診斷為血栓的患者的一年生存率為36%[13]。Liu等分析了247例胃癌患者和220例健康志愿者的D-D指標(biāo)和臨床病理特征，發(fā)現(xiàn)高水平的D-D與胃癌患者的腹膜轉(zhuǎn)移和生存時(shí)間縮短有關(guān)[14]。采用Cox回歸模型的多因素分析進(jìn)一步表明，D-D水平是胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。D-D水平≥0.5 mg/l的胃癌患者死亡的可能性是D-D水平低于該臨界值(<0.5 mg/l)患者的2.37倍。

本研究的不足之處在于：樣本量較少，對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果有一定影響，未對(duì)患者進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪，后續(xù)仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，完善隨訪數(shù)據(jù)。未檢測(cè)患者抗凝或抗腫瘤治療后凝血指標(biāo)及CTC計(jì)數(shù)的變化，故無(wú)法探討治療對(duì)凝血指標(biāo)及CTC計(jì)數(shù)的影響。今后將設(shè)計(jì)更全面的臨床試驗(yàn)方案，更全面地研究血液高凝狀態(tài)、CTC和腫瘤轉(zhuǎn)移及預(yù)后之間的關(guān)系。

綜上所述，胃癌患者血液高凝狀態(tài)與分化程度、TNM分期以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移狀態(tài)有關(guān)并可能對(duì)CTC的轉(zhuǎn)移有促進(jìn)作用。治療前檢測(cè)CTC指標(biāo)對(duì)預(yù)測(cè)胃癌患者的預(yù)后有重要意義。