肺癌患者血清miR-200a的表達水平及意義

戚永超 繆 勁 鄭 琳 張愛平

原發(fā)性支氣管肺癌簡稱肺癌，依據(jù)生物學特性可將其分為小細胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)與非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)，其中NSCLC約占所有肺癌90%[1]。肺癌的發(fā)生發(fā)展為1個多步驟、多因素的過程，涉及較多基因與蛋白，而微小RNA(microRNA,miRNAs)為一類長度在19～25個核苷酸的單鏈非編碼小RNA，廣泛存在于真核生物體內(nèi)，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達，其通過與靶基因mRNA3’-非翻譯區(qū)(3’-untranslated region,3’-UTR)結合，降解靶基因mRNA或抑制其翻譯，從而調(diào)控多種細胞行為[2]，miR-200a為miR-200家族成員之一，研究發(fā)現(xiàn)其在多種惡性腫瘤中均表達異常，且有一定腫瘤特異性，如miR-200a在乳腺癌[3]、胰腺癌[4]等腫瘤中表達下調(diào)，而在結直腸癌[5]中表達上調(diào)，但目前關于miR-200a在肺癌中的表達及其臨床意義研究甚少。本文主要分析肺癌患者中miR-200a的表達水平及其臨床意義，并開展體外研究實驗，為NSCLC的發(fā)病機制與治療策略提供理論依據(jù)，結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2016年2月至2018年12月南京醫(yī)科大學附屬南京醫(yī)院收治的肺癌患者50例，納入標準：①均接受肺癌根治術治療，術后病理證實為肺癌；②家屬或患者本人對本研究內(nèi)容知情，簽署知情同意書，本研究獲得院倫理委員會批準。排除標準：①合并其他嚴重心、腦血管疾病患者；②合并嚴重精神性疾病患者；③合并嚴重認知與視聽障礙者。其中男性27例，女性23例；年齡47～80歲，平均(63.29±6.83)歲；肺癌類型：SCLC 2例，NSCLC 48例；病理分型：鱗癌15例，腺癌33例，小細胞未分化癌2例；國際聯(lián)盟肺癌TNM分期：Ⅱa期17例，Ⅱb期12例，Ⅲ期21例；手術方式：全肺切除3例，肺葉切除40例，局部肺切除7例。取肺癌患者的癌組織及癌旁組織(距離癌組織邊緣≥5 cm，且經(jīng)病理證實為無癌變標本)，另選擇人肺癌細胞系A549與永生化支氣管上皮細胞株16HBE。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器與試劑 A549與16HBE均購自南方醫(yī)科大學分子腫瘤病理重點實驗室。miRNA提取試劑盒購自北京百泰克公司，Real Time PCR System購自美國Bio-Rad公司(型號Agilent 3000)，酶標儀購自美國Bio-Rad公司(型號Bio-Rad550)，PRIM1640、胎牛血清FBS與胰蛋白酶購自HyClone公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo公司，轉(zhuǎn)染試劑盒購自Invitrogen公司，miR-200a mimics、陰性對照RNA購自上海吉瑪生物公司；RT-PCR檢測試劑盒購自全式金公司；TRIzol購自Takara公司，CCK-8試劑盒購自Dojindo公司，Transwell小室購自Corning公司。

1.2.2 細胞培養(yǎng)與miRNA提取 將A549與HBE培養(yǎng)在5% CO2、37 ℃、10%含胎牛血清的培養(yǎng)基中。取106～107個肺癌細胞或50～100 mg的組織，采用miRNA提取試劑盒提取出miRNA。應用超微量核酸蛋白測定儀測定miRNAs的OD260與OD280吸收值，計算其比值，比值在1.8～2.1即為質(zhì)量合格，放置在-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 檢測miR-200a表達水平 采用Primer Premier 5 軟件設計各miRNA與內(nèi)參基因U6的引物序列，由上海生物工程有限公司合成。將質(zhì)量合格的miRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反轉(zhuǎn)錄參數(shù)：16 ℃ 30 min；42 ℃ 30 min；80 ℃ 5 min。反轉(zhuǎn)錄體系：miRNA 5.40 μl，1 μmol/l莖環(huán)引物1 μl，2.5 mmol/l的dNTP 1 μl，1 U/μl的RNase抑制劑0.30 μl，60 U/μl的反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV 0.3 μl，5×M-MLV緩沖液2 μl。應用RT-PCR法檢測組織與細胞中3種miRNA的相對表達水平，嚴格依據(jù)試劑盒說明書進行操作。PCR反應體系：2×SYBR Premix Ex TaqTMⅡ12.5 μl，50×ROXⅡ0.5 μl，10 μmol/l的PCR正反引物各1 μl，cDNA 2 μl，ddH2O 8 μl。以熒光定量法測定目前miRNA及內(nèi)參U6的Ct值，miRNA在細胞中相對表達采用2-△Ct表示，△Ct=CtmiRNA-CtU6，miRNA在組織中的相對表達以2-△△Ct表示，△△Ct=(CtmiRNA癌組織-CtU6癌組織)-(CtmiRNA癌旁組織-CtU6癌旁組織)。

1.2.4 miR-200a mimics的轉(zhuǎn)染及其對A549增殖、遷移、凋亡的影響 ①miR-200a mimics的轉(zhuǎn)染：將生長狀態(tài)良好的A549細胞接種在6孔板培養(yǎng)24 h后進行細胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染miR-200a mimics作為實驗組，轉(zhuǎn)染miRNA negative control(miR-NC)作為陰性對照組，轉(zhuǎn)染6 h后更換新鮮培養(yǎng)液進行后續(xù)實驗。②采用CCK-8法檢測A549細胞增殖能力：將轉(zhuǎn)染24 h的A549細胞接種在96孔板培養(yǎng)板，100 μl/孔，設空白對照，分別培養(yǎng)1 d、2 d、3 d、4 d、5 d，每孔加入10 μl CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)，酶標儀測定A450，以OD值表示增殖能力大小，重復測3次后取平均值，采用平板克隆實驗測定A549克隆能力：將轉(zhuǎn)染后的實驗組及陰性對照組接種在6孔板，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周，密切觀察細胞生長狀態(tài)，培養(yǎng)2周肉眼發(fā)現(xiàn)集落形成即終止培養(yǎng)。后加PBS洗滌3次，應用4%多聚甲醛固定10 min，應用吉姆薩染色法染色20 min，放置在空氣中干燥，計數(shù)細胞克隆。③Transwell小室遷移實驗評估A549遷移能力：取24孔板，放入60 μl RPMI與10%FBS培養(yǎng)基、Transwell小室，將轉(zhuǎn)染后的實驗組與陰性對照組細胞以0.25%胰蛋白酶消化，后進行接種，洗滌，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌3次，蘇木精染色30 min，清洗培養(yǎng)板，計數(shù)，拍照。④采用流式細胞計數(shù)檢測細胞凋亡率：轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞，離心，棄上清，預冷PBS洗滌細胞2次，以500 μl Binding Buffer懸浮細胞，加5 μl異硫氰酸熒光素(FITC)標記的Annexin Ⅴ，加10 μl PI，在混勻后室溫避光孵育5 min，進行檢測。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 肺癌患者miR-200a表達水平

肺癌患者癌組織中miR-200a水平低于癌旁組織(P<0.05)，見表1、圖1。

表1 肺癌患者miR-200a表達水平

圖1 肺癌患者miR-200a表達水平

2.2 A549及HBE細胞系中miR-200a表達水平

A549細胞系中miR-200a表達水平低于HBE細胞系，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2、圖2。

2.3 轉(zhuǎn)染miR-200a mimics對A549增殖、遷移、凋亡的影響

CCK-8實驗顯示，第2～5 d miR-200a mimics與miR-200a mimics的OD值明顯增加，且miR-200a mimics第3 d、4 d、5 d的OD值低于miR-NC(P<0.01)；平板克隆形成實驗發(fā)現(xiàn)miR-200a mimics克隆形成率低于miR-NC(P<0.01)；Transwell實驗顯示miR-200a mimics穿膜細胞數(shù)少于miR-NC(P<0.01)；流式細胞技術檢測顯示，miR-200a mimics凋亡率高于miR-NC(P<0.01)，見表3。

表2 A549及HBE細胞系中miR-200a表達水平

圖2 A549及HBE細胞系中miR-200a表達水平

2.4 肺癌患者miR-200a表達水平與臨床病理參數(shù)的關系

有淋巴結轉(zhuǎn)移、臨床分期Ⅲ期者miR-200a表達水平低于無淋巴結轉(zhuǎn)移、臨床分期Ⅱa～Ⅱb期者(P<0.05)，miR-200a在其他臨床病理參數(shù)間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表4。

3 討論

肺癌作為人類病死率最高的惡性腫瘤，其嚴重威脅著人類健康，而遠處轉(zhuǎn)移為肺癌患者主要死亡原因[6]，因此提高肺癌的早期診斷水平對指導臨床采取治療方案與改善預后有積極意義。miRNA為一類在進化程度上高度保守的非編碼小分子單鏈RNA，在正常狀態(tài)下，miRNA的表達有嚴格組織與程序特異性，miRNA異常表達可導致疾病的發(fā)生[7]，其中miR-200家族廣泛參與多種癌癥發(fā)生發(fā)展，且能抑制細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，在多種癌癥中均可抑制腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移，而miR-200a為miR-200家族成員，其定位在人1號染色體1p36.33，不僅能調(diào)控基因表達，也受上游基因、轉(zhuǎn)錄因子及表觀遺傳等的調(diào)控，有研究[8]顯示，上調(diào)miR-200a可增強NSCLC細胞對吉非替尼的敏感性，為克服表皮生長因子受體(EGFR)酪氨酸激酶抑制劑治療的耐藥性提供了一種新型有效治療方法。

表3 轉(zhuǎn)染miR-200a mimics對A549增殖、遷移、凋亡的影響

注：與第1 d比較，*為P<0.05。

表4 肺癌患者miR-200a表達水平與臨床病理參數(shù)的關系

本研究顯示，肺癌患者癌組織中miR-200a水平低于癌旁組織，表明miR-200a在肺癌患者中表達下調(diào)，這與王勇等[9]的研究結果一致，而Zhen等[10]也報道m(xù)iR-200a在非小細胞肺癌中表達下調(diào)，且通過靶向EGFR與c-Met抑制肺癌細胞侵襲。miRNA可對靶基因產(chǎn)生負性調(diào)控作用，正是這種負性調(diào)控作用使miRNA與腫瘤有著密切關系，影響腫瘤發(fā)生發(fā)展，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中充當抑癌基因，miR-200a為miRNA中miR-200家族成員[11]，有研究[12]報道m(xù)iR-200a可通過抑制Yes相關蛋白1(YAP1)基因表達而對肺癌細胞增殖產(chǎn)生抑制作用，為臨床治療肺癌提供新思路。

A549為體外研究中人肺癌細胞系常用細胞株，本研究對比了A549與永生化支氣管上皮細胞株16HBE中miR-200a表達水平，結果發(fā)現(xiàn)A549細胞系中miR-200a表達水平低于HBE細胞系，差異有統(tǒng)計學意義，因而miR-200a在肺癌細胞株A549中也呈低表達。同時本研究通過轉(zhuǎn)染成熟體miR-200a mimics序列，上調(diào)miR-200a的表達，并對A549的細胞生物學行為進行檢測，結果CCK-8實驗顯示，miR-200a mimics第3 d、4 d、5 d的OD值低于miR-NC，而平板克隆形成實驗也發(fā)現(xiàn)miR-200a mimics克隆形成率低于miR-NC，這與劉曙光等[13]的報道結果一致，表明miR-200a可抑制肺癌細胞增殖，使用A549細胞生長受到抑制，細胞克隆率明顯減少。王亞飛等[14]的研究也發(fā)現(xiàn)，miR-200a可通過抑制Wnt/β-catemin信號通路而增強A549對紫杉醇化療藥物的敏感性，其中Wnt/β-catemin信號通路的異常表達與NSCLC細胞增殖、分化與凋亡等生物學過程密切相關，β-catemin是Wnt/β-catemin信號通路調(diào)控的核心因子，為Wnt/β-catemin通路激活的重要標志。本研究Transwell實驗也發(fā)現(xiàn)miR-200a mimics穿膜細胞數(shù)少于miR-NC，流式細胞技術檢測顯示，miR-200a mimics凋亡率高于miR-NC，表明miR-200a在肺癌中可發(fā)揮抑癌作用，能有效抑制肺癌細胞遷移，促進其凋亡，提示hsa-miR-200a有可能作為肺癌治療的新靶點。李東亮等[15]的研究也發(fā)現(xiàn)，miR-200a可通過靶向調(diào)控硫酸酯酶2基因而抑制NSCLC細胞A549遷移，Shi等[16]的研究也證實miR-200a可通過抑制NF-κB等信號通路而參與腫瘤進展。因此miR-200a與肺癌細胞株A549的增殖、遷移和凋亡密切相關，可將其作為臨床治療的1個靶點。本研究也發(fā)現(xiàn)，有淋巴結轉(zhuǎn)移、臨床分期Ⅲ期者miR-200a表達水平低于無淋巴結轉(zhuǎn)移、臨床分期Ⅱa～Ⅱb期者，表明miR-200a的表達也與肺癌患者臨床病理參數(shù)有密切關系，miR-200a可能對肺癌存在負性調(diào)控作用，可能是介導肺癌轉(zhuǎn)移、侵襲與浸潤的重要miRNA，但因條件限制，本研究未對miR-200a作用于肺癌的靶基因進行研究，臨床可進一步開展研究以明確其作用機制。

綜上所述，miR-200a在肺癌中呈低表達，且與淋巴結轉(zhuǎn)移與否、臨床分期有密切關系，體外實驗也發(fā)現(xiàn)，miR-200a可能介導肺癌細胞株A549的增殖、遷移和凋亡等生物學過程，是臨床治療肺癌的新靶點。