結(jié)直腸癌組織中NF-κB、Notch-1的臨床表達意義

郭錦濤 李 俊 馮 淞

結(jié)直腸癌是當前常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率僅次于胃癌和食管癌，嚴重威脅著人類的健康[1]。我國結(jié)直腸癌發(fā)病率的增速是世界平均水平的2倍左右[2]。不過由于各種因素的影響，結(jié)直腸癌患者的早期診斷率落后于發(fā)達國家，患者確診時大多數(shù)已經(jīng)處于中晚期，導致預后比較差[3]。結(jié)直腸癌的影像學檢查有一定的誤差性，病理學檢查也存在檢查的創(chuàng)傷性、取樣部位的誤差、閱片者自身偏倚等不足[4]。近年來，隨著分子生物學技術、現(xiàn)代免疫組織化學的不斷發(fā)展，通過檢測腫瘤細胞特異抗原等來診斷蛋白水平的變化已成為了可能[5]。核因子κB(nuclear factor kappa binding，NF-κB)是一種細胞核內(nèi)信號轉(zhuǎn)導的重要因子，活化后具有調(diào)控腫瘤相關基因轉(zhuǎn)錄的作用，可誘導細胞外基質(zhì)降解及血管生成，形成信號通路來促進血管生成[6]。Notch信號通路是一條重要的細胞間信號通路，Notch信號通路由4種受體(Notchl、Notch2、Notch3、Notch4)和5種配體及其下游的靶基因等構(gòu)成，可參與細胞的分化、增殖和凋亡，也可參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7-8]。本研究收集相關結(jié)直腸癌病例，對患者的臨床特征與生存狀況進行了回顧性研究，并用免疫組織化學法檢測NF-κB、Notch-1的表達水平，探討NF-κB、Notch-1在結(jié)直腸癌中的表達及其與患者生存的關系?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

2013年7月到2017年5月選擇在本院進行手術治療的120例結(jié)直腸癌患者原發(fā)癌組織標本(癌癥組)與癌旁組織標本(癌旁組，癌旁標本為相應的腸管組織，距離癌灶最邊緣2 cm處，病理證實無腫瘤侵犯)。在120例患者中，男68例，女52例；年齡最小35歲，最大83歲，平均年齡(54.22±12.49)歲；Dukes分期：A期+B期48例，C期+D期72例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：有60例，無60例；分化程度：高分化60例，中分化40例，低分化20例；黏液癌：有20例，無100例；浸潤深度：<肌層40例，≥肌層80例。納入標準：在取樣本前都未進行藥物或者其他方法治療；無嚴重心、肝、腎及血液系統(tǒng)等重要臟器疾病以及同時未患有其他惡性腫瘤，非其他部位轉(zhuǎn)移或復發(fā)的結(jié)直腸癌病例；年齡18～85歲；所有病例均為初次治療或外院術后治療不徹底3個月以內(nèi)；患者已簽知情同意書；研究得到醫(yī)院倫理委員會的批準。排除標準：組織病理學不明確的病例；未行手術或活檢病例；妊娠孕婦與哺乳期婦女；有病毒性肝炎、結(jié)核等傳染性疾??；精神疾病患者；結(jié)直腸腫瘤復發(fā)者；嚴重心肝腎疾病患者。

1.2 免疫組化分析

顯微鏡及病理圖像分析系統(tǒng)(日本Olympus)；手術轉(zhuǎn)輪切片機(德國LeicaRM2235)；微量移液器(美國Axg公司)；塑料孵育盒(北京中山金橋生物技術有限公司)。羊抗人NF-κB、Notch-1、CD31/PAS多克隆抗體均為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品，SP試劑盒為福建邁新產(chǎn)品。

所有標本經(jīng)10%福爾馬林固定24 h，分別取癌灶組織、癌旁組織，然后裁剪成大小為1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm的組織塊，脫水、透明、浸蠟、包埋、連續(xù)切片(4 μm)，然后進行免疫組化染色。

NF-κB、Notch-1表達：都以細胞膜或(和)細胞質(zhì)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性反應，隨機觀察5個400倍視野，每個視野計算100個細胞，無細胞染色為未表達，小于10%的腫瘤細胞染色為弱表達，10%～50%的細胞染色為中度表達，大于50%的細胞染色為強表達，中度表達與強表達都定義為陽性。

1.3 調(diào)查與隨訪分析

選擇Microsoft Excel 2010軟件收集2組的臨床資料信息，進一步調(diào)閱結(jié)直腸癌患者的病史，通過查閱住院、門診病歷，或電話隨訪等方式對患者進行隨訪，核定診斷并進行組織學病理分型。隨訪至今(2019年6月)，所有患者都給予積極的對癥治療，包括手術治療、化療、靶向治療等，記錄患者的生存與死亡情況。生存時間定義為從手術至患者死亡的時間。

1.4 統(tǒng)計方法

選擇SPSS 22.00軟件進行分析，計量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差表示，計數(shù)數(shù)據(jù)采用百分比、例數(shù)表示或者Log Rank檢驗，多因素分析采用Cox回歸模型分析，兩兩對比采用t檢驗與卡方χ2檢驗、Kaplan Meier曲線等分析，生存數(shù)據(jù)對比采用Kaplan Meier分析，檢驗水準為α=0.05，P<0.05表示差異存在統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 NF-κB、Notch-1表達陽性率對比

癌癥組的NF-κB、Notch-1表達陽性率分別為75.0%、65.0%，顯著高于癌旁組的5.0%和3.3%(P<0.05)。見表1。

表1 不同組別的NF-κB、Notch-1表達陽性率對比(例，%)

2.2 隨訪情況

隨訪到2019年6月，120例患者中死亡20例，生存100例，中位生存時間為(28.33±4.19)個月。

2.3 結(jié)直腸癌中NF-κB、Notch-1表達與臨床特征、預后生存的相關性

在120例患者中，NF-κB、Notch-1表達陽性都與結(jié)直腸癌的Dukes分期、黏液癌、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度、隨訪預后呈正相關(P<0.05)，與組織學分化程度呈負相關(P<0.05)。見表2。

2.4 影響因素Cox回歸模型分析

在癌癥組中，以預后生存作為因變量，以調(diào)查的臨床內(nèi)容與NF-κB、Notch-1表達陽性的指標作為自變量，Cox回歸模型分析顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Dukes分期、NF-κB、Notch-1表達陽性為影響患者中位生存時間的重要因素(P<0.05)。見表3。

表2 結(jié)直腸癌NF-κB、Notch-1表達與臨床特征、預后生存的相關性(例，%)

表3 影響結(jié)直腸癌預后的因素分析(n=120)

3 討論

結(jié)直腸癌為臨床上比較常見的惡性腫瘤，不過早期癥狀不顯著，發(fā)現(xiàn)病情時多為癌癥中晚期，因此患者死亡率一直居高不下。在常規(guī)檢查中，影像學檢查上傾向于良性腫瘤的表現(xiàn)，細針穿刺細胞學多需要石蠟組織病理檢測后才可以確診，導致早期診斷效果不佳[9]。

目前結(jié)直腸癌發(fā)病機理尚未完全了解，與其它腫瘤一樣，結(jié)直腸癌的發(fā)生歸因于基因一環(huán)境的相互作用，正是這些基因多態(tài)性影響或“修飾”不同個體對環(huán)境因素作用的敏感性[10]。Notch是進化高度保守的細胞間信號傳導系統(tǒng)，Notch信號通路的過渡活化與腫瘤惡性潛能密切相關，包括腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡等[11]。Notch大多時候起著促癌蛋白的作用，激活Notch信號有助于這些腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Notch-1是Notch信號通路的主要受體之一，Notch-1胞內(nèi)區(qū)是Notch信號通路的主要功能執(zhí)行單位，胞外區(qū)主要功能是與相應的配體結(jié)合后激活Notch-1信號通路[12]。NF-κB是腫瘤發(fā)病及血管生成過程中的重要調(diào)節(jié)因子，NF-κB激活可以誘導腫瘤細胞及血管內(nèi)皮細胞增生、遷移、侵襲及抑制細胞凋亡，也可調(diào)節(jié)其它血管生成因子如血管內(nèi)皮生長因子來促進血管生成[13-14]。本研究顯示癌癥組的NF-κB、Notch-1表達陽性率分別為75.0%、65.0%，顯著高于癌旁組的5.0%和3.3%，表明結(jié)直腸癌組織存在NF-κB、Notch-1的高表達狀況。

結(jié)直腸癌是常見胃腸道惡性腫瘤，雖然醫(yī)療技術有了很大提高，但大部分患者5年內(nèi)死于復發(fā)或轉(zhuǎn)移。因此準確預測腫瘤的復發(fā)、轉(zhuǎn)移，提早進行相應的診治對于提高結(jié)直腸癌總體生存率有重要意義[15]?，F(xiàn)代研究表明腫瘤血管生成是一個多因素、多步驟的調(diào)控過程，所有這些步驟均由生長因子、細胞和細胞外基質(zhì)間的相互作用所調(diào)控[16]。Notch-1可激活靶基因HES、cyclinA、cyclinD1、c-Myc、p21等的表達，通過調(diào)控細胞的增殖、分化。NF-κB可促進體外生長的結(jié)直腸癌細胞的生長和運動，能夠充分地將上皮細胞轉(zhuǎn)化為侵襲表型[17-18]。本研究隨訪到2019年6月，120例患者中死亡20例，生存100例，中位生存時間為(28.33±4.19)個月；NF-κB、Notch-1表達陽性都與結(jié)直腸癌的Dukes分期、黏液癌、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度、隨訪預后呈正相關，與組織學分化程度呈負相關；Cox回歸模型分析顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Dukes分期、NF-κB、Notch-1表達陽性為影響患者中位生存時間的危險因素。相關研究也表明NF-κB、Notch-1能參與了惡性腫瘤的癌前病變、轉(zhuǎn)移、復發(fā)及化療耐藥等多個過程中，特別是Notch1信號通路可能通過對結(jié)直腸癌前細胞分化相關基因異常調(diào)節(jié)，使其向癌細胞轉(zhuǎn)化[19]。

總之，NF-κB、Notch-1在結(jié)直腸癌中都呈現(xiàn)高表達狀況，與結(jié)直腸癌的臨床病理特征相關，也與患者的預后生存顯著相關。