基于表型和SSR標(biāo)記篩選海島棉優(yōu)異種質(zhì)資源

馬麒，寧新柱，李吉蓮，陳紅，余渝，林海

（新疆農(nóng)墾科學(xué)院棉花研究所/ 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西北內(nèi)陸區(qū)棉花生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/ 新疆兵團(tuán)棉花改良與高產(chǎn)栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子832000）

海島棉（Gossypium barbadenseL.）纖維具有長(zhǎng)、強(qiáng)、細(xì)等特點(diǎn)，是高檔和特種棉紡織品的重要原料，因其優(yōu)異的纖維品質(zhì)和黃萎病抗性，目前已成為最具利用價(jià)值的棉花栽培種之一[1-2]。 近年來(lái)，我國(guó)在海島棉種質(zhì)資源創(chuàng)新和新品種選育方面取得重要成果[3-6]，其產(chǎn)量得到較大幅度提高，纖維品質(zhì)也得到明顯的改善。 但我國(guó)海島棉產(chǎn)量及纖維品質(zhì)育種水平仍沒(méi)有明顯突破，其中優(yōu)異種質(zhì)資源的匱乏是主要原因之一。 因此篩選和挖掘海島棉優(yōu)異種質(zhì)資源對(duì)于海島棉新品種選育及資源創(chuàng)新具有重要意義。

種質(zhì)資源是作物遺傳育種工作的基礎(chǔ)，植物新品種選育及生產(chǎn)的發(fā)展，很大程度上取決于掌握優(yōu)異種質(zhì)資源的數(shù)量和研究深度。 育種實(shí)踐證明，一些具有關(guān)鍵性狀的優(yōu)異種質(zhì)往往對(duì)育種成效起決定性作用[7]。 因此急需發(fā)掘符合育種目標(biāo)和研究需要的優(yōu)異種質(zhì)，以滿足當(dāng)前和今后科研及生產(chǎn)發(fā)展的要求。 目前，已開展了包括大豆[8]、玉米[9]、小麥[10]等多種作物優(yōu)異種質(zhì)資源的分析與研究。 海島棉是棉花常見的四倍體栽培種之一，約占我國(guó)植棉總面積的5%。 近年來(lái)，海島棉種質(zhì)資源數(shù)量較多、類型也較豐富，但海島棉骨干親本的廣泛使用及定向育種策略，導(dǎo)致其遺傳基礎(chǔ)狹窄、遺傳背景單一，海島棉品種遺傳多樣性呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)[11-14]。 此外，部分具有重大科研價(jià)值的優(yōu)異種質(zhì)正在流失卻未引起重視，而單一性狀特別突出的優(yōu)異海島棉種質(zhì)資源更是極其匱乏。 海島棉優(yōu)異種質(zhì)的篩選不僅可為棉花科研和育種提供獨(dú)特、優(yōu)異、豐富的基礎(chǔ)材料，而且在一定程度上可加速一些優(yōu)異性狀相關(guān)Quantitative trait locus(QTL)定位，為實(shí)現(xiàn)分子標(biāo)記輔助育種、利用海島棉進(jìn)行陸地棉改良育種提供重要參考和依據(jù)。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展, 分子標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于作物優(yōu)異種質(zhì)資源的篩選與發(fā)掘。簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Simple sequence repeat,SSR）也叫微衛(wèi)星，廣泛分布于真核生物基因組的編碼區(qū)和非編碼區(qū)。 SSR 標(biāo)記具有多態(tài)信息含量高、共顯性遺傳、重復(fù)性好、特異性強(qiáng)、技術(shù)簡(jiǎn)單、成本低等特點(diǎn)，已成為從基因型方面評(píng)價(jià)種質(zhì)資源的重要工具[15]。一般來(lái)說(shuō)，表型是生物遺傳物質(zhì)在環(huán)境作用下的外在表現(xiàn)形式，主要包括肉眼可見的外部特性，也包含色素、生理、品質(zhì)等需要借助測(cè)試才可識(shí)別的特性[16]；基因型是生物個(gè)體全部基因組的總和，是性狀表現(xiàn)的內(nèi)在因素。 基于表型和SSR 分子標(biāo)記技術(shù)來(lái)研究現(xiàn)有海島棉核心種質(zhì)資源的遺傳變異情況，可深入了解其遺傳背景信息，充分挖掘關(guān)鍵性狀表現(xiàn)突出的優(yōu)異種質(zhì)。

本研究以前期構(gòu)建的178 份海島棉核心種質(zhì)為試驗(yàn)材料，利用SSR 標(biāo)記技術(shù)闡明海島棉種質(zhì)資源的基因型變異及親緣關(guān)系；同時(shí)結(jié)合性狀表型值，開展基于表型和基因型的海島棉種質(zhì)資源評(píng)價(jià)與篩選， 挖掘海島棉核心種質(zhì)的產(chǎn)量、品質(zhì)構(gòu)成性狀中單一性狀表現(xiàn)突出的優(yōu)異種質(zhì)，以期為海島棉遺傳育種及理論研究提供重要基礎(chǔ)，同時(shí)也為其它作物優(yōu)異種質(zhì)資源的篩選與鑒定提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究以前期構(gòu)建的178 份海島棉核心種質(zhì)為試驗(yàn)材料。 178 份材料中包含新疆本地選育品種/ 系 130 份（前期已發(fā)表[5]），國(guó)外引進(jìn)材料26 份，內(nèi)地引進(jìn)材料22 份（附表1，見本刊網(wǎng)站）。

1.2 田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)與表型性狀調(diào)查

1.2.1田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)。田間試驗(yàn)于2015―2016年在新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)農(nóng)二師29 團(tuán)新疆農(nóng)墾科學(xué)院棉花研究所試驗(yàn)站開展，種植模式是（66＋10）cm 株行距配置， 一膜四行， 每個(gè)材料種植2行，行長(zhǎng)4 m，株距為9.5 cm。 田間采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，重復(fù)3 次，小區(qū)管理與當(dāng)?shù)卮筇锵嗤?/p>

1.2.2表型性狀調(diào)查。本研究中調(diào)查和測(cè)定的表型性狀主要是鈴重、單株鈴數(shù)、衣分、纖維長(zhǎng)度、纖維強(qiáng)度和馬克隆值6 個(gè)性狀。 田間調(diào)查時(shí)，每個(gè)小區(qū)隨機(jī)選取連續(xù)相鄰的10 株作為調(diào)查對(duì)象，調(diào)查總鈴數(shù)，并計(jì)算單株鈴數(shù)；收獲期每個(gè)小區(qū)隨機(jī)收取棉株中部50 個(gè)考種鈴， 稱取籽棉總重量，并計(jì)算鈴重；軋花后，稱取50 鈴的皮棉總重量，并計(jì)算衣分；取10 g 皮棉送原農(nóng)業(yè)部棉花品質(zhì)監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（HVICC 校準(zhǔn)），測(cè)定纖維上半部平均長(zhǎng)度、斷裂比強(qiáng)度、馬克隆值等品質(zhì)指標(biāo)。

1.3 棉花基因組DNA提取及SSR引物合成

苗期選取各個(gè)材料植株幼嫩葉片， 按Paterson 等[17]的方法提取基因組總DNA。 SSR 引物的選擇參考了 Guo 等[18]、Lin 等[19]構(gòu)建的棉花 SSR分子標(biāo)記遺傳圖譜，引物序列信息參考棉花微衛(wèi)星標(biāo)記數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.cottongen.org/data/markers）， 引物的合成由北京康為世紀(jì)生物科技有限公司完成。

1.4 多態(tài)性SSR引物的篩選及PCR反應(yīng)

選取覆蓋棉花26 對(duì)染色體的1 000 對(duì)SSR引物， 在12 份海島棉種質(zhì)間進(jìn)行引物多態(tài)性篩選，得到156 對(duì)多態(tài)性引物。 選取其中條帶差異明顯、背景清晰、信號(hào)較強(qiáng)、擴(kuò)增效果較好、都覆蓋所有染色體的120 對(duì)多態(tài)性SSR 引物 （圖1），對(duì)178 份海島棉核心種質(zhì)進(jìn)行Polymerase chain reaction（PCR）擴(kuò)增反應(yīng)。 PCR 的擴(kuò)增、電泳及染色參考 Zhang 等[20-21]的方法。

圖1 代表性多態(tài)性引物在12 份海島棉材料中的擴(kuò)增情況Fig.1 Amplification of the representative polymorphic primers in 12 accessions of sea-island cotton

1.5 SSR分子標(biāo)記的多態(tài)性、 群體結(jié)構(gòu)及聚類分析

對(duì)于SSR 標(biāo)記數(shù)據(jù)， 根據(jù)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果采用0、1 系統(tǒng)記錄譜帶位置，觀察某一擴(kuò)增條帶的有無(wú)，有帶記為1，無(wú)帶記為0，構(gòu)建0、1 矩陣。利用 POPGENE 3.2 軟件計(jì)算等位基因變異數(shù)和多態(tài)性信息量 （Polymorphism information content,PIC）。 利用 Structure 2.3.4 軟件[22]估測(cè)該自然群體的遺傳結(jié)構(gòu)，計(jì)算每個(gè)材料對(duì)應(yīng)的Q 值（即每個(gè)材料歸屬于某個(gè)亞群的概率），假定位點(diǎn)是獨(dú)立的， 設(shè)定群體數(shù)目 K 為 1～10，MCMC 開始時(shí)的不作數(shù)迭代 （Length of burn-in period）為10 000，然后根據(jù)最大似然值原則選取合適的K 值。初選海島棉優(yōu)異種質(zhì)的基因型聚類分析采用NTSYS-pc 2.10 軟件，根據(jù) SimQual 程序求Jaccard 相似系數(shù)，采用類平均法（Unweighted pair group method arithmetic averages, UPGMA），對(duì)遺傳相似系數(shù)矩陣進(jìn)行聚類并繪制樹狀聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 海島棉核心種質(zhì)表型性狀的遺傳多樣性分析

從表1 可知，178 份海島棉核心種質(zhì)的平均鈴重（3.04±0.23） g、衣分（31.42±2.25）%、單株結(jié)鈴數(shù) 10.53±2.10、 纖維上半部平均長(zhǎng)度（35.99±1.88） mm、 斷裂比強(qiáng)度 （42.14±4.18）cN·tex－1、 馬克隆值 3.80±0.32。 鈴重變幅為2.29～3.58 g、衣分 22.17%～36.82 %、單株結(jié)鈴數(shù) 5.4～17.4、 纖維上半部平均長(zhǎng)度 26.78 ～38.62 mm、斷裂比強(qiáng)度 31.95～53.50 cN·tex－1、馬克隆值2.67～4.51。變異度分析發(fā)現(xiàn)，海島棉核心種質(zhì)表型性狀具有較廣泛的變異范圍，6 個(gè)性狀的變異系數(shù)為5.22%～19.94%，其中單株結(jié)鈴數(shù)的變異系數(shù)最大，為19.94%，這說(shuō)明單株結(jié)鈴數(shù)性狀的變異度最豐富，有利于篩選強(qiáng)結(jié)鈴性的海島棉優(yōu)異種質(zhì)。 多樣性分析發(fā)現(xiàn)，單株鈴數(shù)、纖維上半部平均長(zhǎng)度、斷裂比強(qiáng)度和馬克隆值的遺傳多樣性指數(shù)較高，均大于1.000 0，且斷裂比強(qiáng)度的多樣性指數(shù)達(dá)到1.412 0，說(shuō)明這些核心種質(zhì)中斷裂比強(qiáng)度的遺傳多樣性最豐富的。

表1 海島棉表型性狀的變化及分布特征Table1 The variation and distribution of phenotypic traits of sea-island cotton germplasm

2.2 基于SSR標(biāo)記的遺傳多樣性分析

2.2.1多態(tài)性SSR 引物的篩選。利用1 000 對(duì)SSR 引物在12 份海島棉材料間進(jìn)行多態(tài)性引物的初選，得到156 對(duì)差異性引物，剔除擴(kuò)增條帶模糊、離散度低的引物，選取其中擴(kuò)增效果較好的120 對(duì)多態(tài)性明顯的SSR 引物（圖1），用于海島棉核心種質(zhì)的基因型分析。

2.2.2海島棉核心種質(zhì)全基因組SSR 擴(kuò)增結(jié)果分析。選取120 對(duì)多態(tài)性明顯的SSR 引物，對(duì)178 份海島棉核心種質(zhì)進(jìn)行SSR 標(biāo)記的擴(kuò)增分析 （圖2）。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，120 對(duì) SSR 引物共檢測(cè)到262 個(gè)位點(diǎn)， 每對(duì)引物檢測(cè)到等位變異的數(shù)目為1～6、平均為2.18；多態(tài)性信息含量在0.067 8～0.630 0，平均為 0.296 0，位于 0.25～0.50 之間，說(shuō)明178 份海島棉的不同位點(diǎn)多態(tài)性屬中度多態(tài)（表2）。

圖2 引物NAU3310 在海島棉核心種質(zhì)的擴(kuò)增電泳圖Fig.2 The amplified electropherogram of primers NAU3310 in core collection of sea-island cotton

表2 120 對(duì)SSR 引物的多態(tài)性分析Table 2 The polymorphism analysis of 120 pairs of SSR primers

表2 （續(xù)）Table 2 (Continuation)

2.2.3群體結(jié)構(gòu)及聚類分析。由Structure 2.3.4軟件分析顯示，似然值 ln（P（D））隨 K 值的增加而增加（圖3a）。 根據(jù) Evanno 等[23]的方法，由△K來(lái)確定 K 值。 由圖3b 可知，K＝2 時(shí)，△K 最大并且出現(xiàn)顯著的峰值，即該自然群體可劃分為2 個(gè)亞群（圖3c），亞群 1 和 2 分別包含 95 份和 83 份材料，且2 個(gè)亞群的材料均來(lái)自不同的地區(qū)和單位，說(shuō)明各育種單位之間的種質(zhì)資源發(fā)生了較為廣泛的交換與融合。

2.3 海島棉優(yōu)異種質(zhì)資源的篩選與鑒定

對(duì)178 份海島棉種質(zhì)資源進(jìn)行2 年1 點(diǎn)的大田種植鑒定，剔除田間表現(xiàn)較差（早衰、抗病性差、產(chǎn)量低）的種質(zhì)55 份，以123 份海島棉種質(zhì)作為優(yōu)異種質(zhì)的篩選對(duì)象。 鈴重、衣分、單株鈴數(shù)和纖維上半部平均長(zhǎng)度、斷裂比強(qiáng)度、馬克隆值的表型值按照10%最優(yōu)取樣策略，在123 份海島棉種質(zhì)資源中篩選出鈴重、衣分、結(jié)鈴性、纖維長(zhǎng)度、纖維強(qiáng)度最優(yōu)種質(zhì)和馬克隆值最低的種質(zhì)各12 份，作為初選海島棉優(yōu)異種質(zhì)（表3）。 同時(shí)參考群體結(jié)構(gòu)分析（圖3）及初選海島棉優(yōu)異種質(zhì)資源的基因型聚類分析（附圖1，見刊網(wǎng)站），依據(jù)“同一聚類群擇優(yōu)選取”原則，在取樣措施上分層取樣、綜合考慮，對(duì)海島棉種質(zhì)資源進(jìn)行了合理客觀的評(píng)價(jià)與篩選，最終篩選每個(gè)單一性狀特別突出的優(yōu)異種質(zhì)資源各5 份（表4）。

由表4 可知，共篩選出具有不同突出性狀的海島棉優(yōu)異種質(zhì)資源共23 份，其中新海28 號(hào)具有鈴重高、結(jié)鈴性強(qiáng)和纖維強(qiáng)度高等優(yōu)點(diǎn)；G-92、新海 21 號(hào)、墾綠 04-20-2、Pima 3-79、新海 47 號(hào)同時(shí)具有2 個(gè)突出性狀。 這23 份海島棉優(yōu)異種質(zhì)資源不僅可用作海島棉常規(guī)遺傳育種的親本選擇，而且可用于相關(guān)QTL 定位。

3 討論

種質(zhì)資源的遺傳多樣性及親緣關(guān)系信息是育種工作的基礎(chǔ)，對(duì)我國(guó)海島棉品種的遺傳多樣性準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)可以為親本的選配、后代遺傳變異程度及雜種優(yōu)勢(shì)水平的預(yù)測(cè)提供預(yù)見性，這是育種目標(biāo)能否成功實(shí)現(xiàn)的關(guān)鍵[2]。 本研究對(duì)已構(gòu)建的178 份海島棉核心種質(zhì)資源的纖維產(chǎn)量及品質(zhì)構(gòu)成性狀進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定并開展遺傳多樣性分析。 研究發(fā)現(xiàn)6 個(gè)性狀的變異度和遺傳多樣性較豐富，研究結(jié)果與王莉萍[24]、謝元元[25]的研究結(jié)論基本相似。 說(shuō)明本研究中海島棉核心種質(zhì)資源較高的變異度高和豐富的遺傳多樣性，可以為海島棉優(yōu)異種質(zhì)的發(fā)掘提供良好的基礎(chǔ)。

表型性狀有時(shí)并不能真實(shí)地反映種質(zhì)間的內(nèi)在差異性，需結(jié)合基因型的遺傳變異來(lái)揭示種質(zhì)間的遺傳差異性。 分子標(biāo)記可以為海島棉種質(zhì)的基因型分析提供重要工具，前人已利用不同分子標(biāo)記對(duì)海島棉的遺傳多樣性進(jìn)行研究。 吳大鵬等[14]認(rèn)為我國(guó)海島棉品種遺傳多樣性適中；陳光等[12]、李武等[2]和米日古麗·馬木提等[26]利用分子標(biāo)記進(jìn)行了新疆海島棉遺傳多樣性分析，通過(guò)研究認(rèn)為我國(guó)新疆海島棉育成品種遺傳背景相對(duì)較為狹窄。本研究利用SSR 分子標(biāo)記對(duì)海島棉核心種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳多樣性分析，研究發(fā)現(xiàn)其遺傳基礎(chǔ)同樣比較狹窄。

圖3 187 份海島棉種質(zhì)資源的群體結(jié)構(gòu)分析Fig.3 Population structure analysis of 178 accessions of sea-island cotton germplasm

表3 海島棉優(yōu)異種質(zhì)的表型篩選結(jié)果Table 3 The elite Sea-island cotton germplasm identified via phenotyping

表3 （續(xù)）Table 3 (Continuation)

目前，海島棉骨干親本的廣泛使用及定向育種策略是造成其遺傳基礎(chǔ)狹窄、 遺傳背景單一的最主要的原因之一。 長(zhǎng)期的人工定向選擇育種， 雖然使一些綜合性狀比較優(yōu)良的材料積累下來(lái)， 但同時(shí)多數(shù)單一性狀突出的育種材料正逐漸遭到淘汰和流失。 因此， 在表型鑒定基礎(chǔ)上， 急需通過(guò)現(xiàn)代生物技術(shù)手段篩選和發(fā)掘單一性狀突出的優(yōu)異種質(zhì)資源。 育種實(shí)踐也證明，育種上的突破性成就多源于對(duì)某一關(guān)鍵性狀特別突出的優(yōu)異種質(zhì)資源的發(fā)現(xiàn)和利用[7]。 本研究采用表型鑒定與基因型鑒定相結(jié)合的方法，篩選與發(fā)掘海島棉優(yōu)異種質(zhì)資源， 即先通過(guò)表型鑒定結(jié)果初選海島棉優(yōu)異種質(zhì)； 然后基于SSR分子標(biāo)記進(jìn)行基因型分析和親緣關(guān)系聚類分析，綜合表型變異和基因型變異情況，在取樣策略上偏重評(píng)價(jià)、參考變異，在取樣措施上分層取樣、綜合考慮，最終對(duì)海島棉種質(zhì)資源進(jìn)行了合理客觀的評(píng)價(jià)， 并最終篩選到海島棉優(yōu)異種質(zhì)資源。 研究過(guò)程中既考慮了表型的變異度，同時(shí)也參考了基因型變異的結(jié)果， 在優(yōu)異種質(zhì)資源的篩選與鑒定的過(guò)程中實(shí)現(xiàn)了性狀分析和鑒定的準(zhǔn)確性和可靠性。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)178 份海島棉核心種質(zhì)資源進(jìn)行表型和分子標(biāo)記基因型的分析和評(píng)價(jià)，最終篩到單一性狀突出的海島棉優(yōu)異種質(zhì)資源共23份， 其中新海 28 號(hào)、G-92、 新海 21 號(hào)、 墾綠04-20-2、Pima 3-79 和新海 47 號(hào)同時(shí)具有 2 個(gè)或者2 個(gè)以上突出性狀。 該23 份海島棉優(yōu)異種質(zhì)資源不僅可以在海島棉常規(guī)遺傳育種中親本選擇時(shí)優(yōu)先考慮， 而且可作為表型性狀QTL 定位的關(guān)鍵材料利用。 本研究成果可以為海島棉遺傳育種及理論研究提供重要基礎(chǔ)，同時(shí)也為其它作物優(yōu)異種質(zhì)資源的篩選與鑒定提供參考和依據(jù)。

表4 海島棉優(yōu)異種質(zhì)資源的篩選結(jié)果Table 4 Screening results of elite sea-island germplasm