二倍體棉種組織培養(yǎng)研究進(jìn)展

孫悅，華金平

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院棉花遺傳育種與基因組研究實(shí)驗(yàn)室／作物遺傳改良北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室／雜種優(yōu)勢(shì)利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193）

棉花是重要的經(jīng)濟(jì)作物。棉屬共有53 個(gè)種[1]，除了栽培種陸地棉（Gossypium hirsutum）和海島棉（G.barbadense）等7 個(gè)四倍體棉種外，其余的皆為二倍體棉種。46 個(gè)二倍體棉種染色體組分別屬于 A、B、C、D、E、F、G 和 K 組。二倍體棉種為四倍體栽培種提供了親本（祖先）種，在棉屬進(jìn)化與多倍化機(jī)制研究方面有著重要意義。 研究表明，異源四倍體棉種是由兩個(gè)不同的二倍體種雜交、染色體加倍而來(lái)的[2-7]。

二倍體棉種 A、B、E、F 組起源于亞非大陸，D組起源于美洲大陸，C、G、K 組起源于澳洲等地。A 組草棉、亞洲棉是栽培種，其他棉種均為野生種。 不同棉種株型差異大，有草本、灌木到喬木等類型。 二倍體棉種遺傳多樣性豐富，是棉花遺傳改良的重要種質(zhì)資源。 一些棉種具有高產(chǎn)、抗病蟲害、耐逆、優(yōu)異纖維品質(zhì)性狀的基因資源[1,8]；已發(fā)現(xiàn)亞洲棉、異常棉、哈克尼西棉、三裂棉胞質(zhì)不育系，其中哈克尼西棉、三裂棉細(xì)胞質(zhì)獲得了完全雄性不育系，并實(shí)現(xiàn)了三系配套[9]。

棉花遠(yuǎn)緣雜交在二倍體棉種資源利用中取得了成功，美國(guó)學(xué)者創(chuàng)造ATH（亞洲棉、瑟伯氏棉、陸地棉）三元雜種，成功改良了陸地棉纖維品質(zhì)。 近期分子生物學(xué)研究涉及更多，如構(gòu)建了亞洲棉 cDNA 文庫(kù)[10]，其中 WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)與耐旱有關(guān)；雷蒙德氏棉WRKY 基因，參與棉花低溫脅迫應(yīng)答反應(yīng)[11]。

組織培養(yǎng)技術(shù)是現(xiàn)代生物技術(shù)的基礎(chǔ)。 棉花組織培養(yǎng)研究難度大，但是在種質(zhì)資源改良與保存、雜種優(yōu)勢(shì)的利用、體細(xì)胞融合、基因工程等過(guò)程中有著巨大潛力， 對(duì)于建立轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系、開(kāi)展體細(xì)胞融合、 功能基因組研究具有重要意義。 相關(guān)研究主要涉及植株器官與細(xì)胞培養(yǎng)的再生途徑、原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞培養(yǎng)與融合等。

2 二倍體棉種組織培養(yǎng)體系

20 世紀(jì)70 年代以來(lái)， 逐漸開(kāi)始初步建立棉花體細(xì)胞培養(yǎng)、莖尖培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)體系的探索。 棉花植株的再生途徑可分為兩類：一類是體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑，外植體經(jīng)過(guò)體細(xì)胞發(fā)生形成胚狀體，胚狀體發(fā)育獲得再生苗；一類是愈傷組織途徑，外植體先誘導(dǎo)獲得愈傷組織，繼而誘導(dǎo)愈傷組織分化產(chǎn)生芽和根并獲得再生植株。二倍體棉種的再生體系建立相對(duì)于四倍體棉種難度更大， 現(xiàn)有再生途徑主要為體細(xì)胞胚胎發(fā)生[12-26]。

2.1 體細(xì)胞培養(yǎng)

棉花體細(xì)胞培養(yǎng)體系，是棉花植株再生應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)。1979 年，Price 等首次成功從克勞茨基棉的懸浮培養(yǎng)中獲得了胚狀體[12]；隨后，獲得了高頻胚胎發(fā)生的陸地棉柯字棉再生植株，開(kāi)創(chuàng)了棉花體細(xì)胞培養(yǎng)及植株再生研究[15-16，18]。

二倍體棉種體胚發(fā)生方式是以下胚軸、葉片等作為外植體，誘導(dǎo)并增殖愈傷組織，隨后誘導(dǎo)分化出胚性愈傷組織，進(jìn)而獲得再生植株。

迄今，獲得了亞洲棉、異常棉、斯特提棉、瑟伯氏棉、戴維遜氏棉、克勞茨基棉、旱地棉、雷蒙德氏棉、野生擬似棉、司篤克氏棉、灰白棉、比克氏棉、 澳洲棉、 奈爾遜氏棉等14 個(gè)種體細(xì)胞胚[12-24]；獲得再生植株的棉種有：克勞茨基棉、野生擬似棉、亞洲棉、戴維遜氏棉、雷蒙德氏棉、司篤克氏棉、奈爾遜氏棉[13-14，17-20，22]（表1）。

2.1.1基因型。基因型是二倍體棉種體細(xì)胞胚胎發(fā)生和植株能否再生的決定性因素[25]。 不同基因型的棉種體細(xì)胞胚形成能力不同。 二倍體亞洲棉的體細(xì)胞胚發(fā)生的能力明顯高于草棉[15]；不同的野生棉在相同的培養(yǎng)條件下體胚發(fā)生能力相差較大[20]?？傊?，大多二倍體棉種體細(xì)胞胚胎發(fā)生和植株再生的能力較低、難以觀察到體細(xì)胞胚胎發(fā)生，少數(shù)棉種能夠形成體細(xì)胞胚胎但難以得到再生植株。

2.1.2外植體的選擇。外植體的選擇決定棉花再生的成敗。 一般選擇幼嫩的組織或器官作為外植體，常用的有下胚軸、子葉、幼莖等，其中無(wú)菌苗的下胚軸最佳。 二倍體棉種體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程中，下胚軸產(chǎn)生的愈傷組織最多[21]且產(chǎn)生的速度快[13]、體胚的轉(zhuǎn)化率較子葉等其他外植體高，且繼代培養(yǎng)的時(shí)間相對(duì)較短，從而可減少體細(xì)胞無(wú)性系變異[26]。

2.1.3培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件。不同棉種的體細(xì)胞胚胎發(fā)生與植株再生對(duì)植物激素等外界因素的反應(yīng)各有不同，通過(guò)不同激素組合、鹽離子添加、不同碳氮源組合等調(diào)控方式，可找到與棉種相適應(yīng)的培養(yǎng)條件的組合，從而提高二倍體棉種體細(xì)胞胚的產(chǎn)量與萌發(fā)能力（表2）。 成功獲得再生植株的二倍體棉種，對(duì)培養(yǎng)基尤其是激素配比用量要求較嚴(yán)，只有在嚴(yán)格、適宜的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下才能成功。

棉花組織培養(yǎng)常用激素有2,4-D （2,4- 二氯苯 氧 乙 酸 ，2,4-Dichlorophenoxyacetic acid）、IBA（吲哚丁酸，Indole butyric acid）、NAA （萘乙酸，1-Naphthylacetic acid）、KT（激動(dòng)素，Kinetin）等。一般來(lái)說(shuō)，2,4-D 能有效促進(jìn)愈傷組織生長(zhǎng)，并且

提高體胚轉(zhuǎn)化率，在野生棉胚性愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程中可減少愈傷組織的白化死亡。 其中，NAA 為誘導(dǎo)亞洲棉胚性愈傷組織的最佳激素。

表1 二倍體棉種組織培養(yǎng)案例＊Table 1 A list of diploid cotton tissue culture＊

獻(xiàn)文考參ces eferen R 3][1 4][1 7][1表2二倍體棉種體細(xì)胞培養(yǎng)再生植株培養(yǎng)體系Table2Alist of diploidcottonregenerationviasomaticembryogenesis件條養(yǎng)培基養(yǎng)培體植外組因基種棉體倍二s ndition re co ltu u C ajor steps lved in m vo in edium M t lan xp E e om en G loid cotton ip D熒白冷，/10 D L d 14 perio oto h P期周光；℃1)±8(2 1－L ol·m μ 0.9＋B S：M ctionindu lture genic cu bryo m E導(dǎo)誘胚體葉子、軸胚下D 3-k棉基茨勞克ight L強(qiáng)光，t ligh t rescen fluo ite h w ol o C燈光;.8；pH51 KT－·L ol m.32 μ 2＋2,4-Dcotyls ypo H m ianu lotzsch.k G 1.－2·s－m l·o m μ 33 sity ten in ryo b d em n an liferatio re progenic cultu bryo m E育發(fā)胎胚與殖增胚體onandcotyled 1 KT＋－·L l o m μ 0.93＋1 2,4-D－·L l o m 5 μ 0.04＋B：MS t en mdevelop 1 IBA;－L l·o m μ 2.46-D1 2,4－·L l o m 3 μ 0.2＋in liquid B：MS re n cultu sio en usp S養(yǎng)培浮懸;1 KT－·L ol m μ 0.93＋activated %0.5＋B S：1/4 M re lantlets cultuegenerated p R養(yǎng)培苗生再n.carbo ight L強(qiáng)光：duction in s allu C導(dǎo)誘織組傷愈1－·L g m 1＋1 IAA－·L g 2 m＋：MSctionallus indu C導(dǎo)誘織組傷愈軸胚下D 6棉似擬生野，/9D 5 L 1 eriod otop h P期周光，lx 00 0 0 1 sity ten in;T K cotyls ypo H es ssypioid.go G;℃1)9±(2＋：MS n inatio d germ an ction du ryo in b atic em m o S發(fā)萌與導(dǎo)誘胚體d n an uctio ryo ind b atic em om S發(fā)萌與導(dǎo)誘胚體.1 LH－·L g.5 01 2IP＋－·L g m 3＋A1 NA－·L g 0.1 m；0 lx 00 5 0～t intensity 4 00 igh L強(qiáng)光：n inatio germ.；28 ℃2 D /1 d 12 L perio oto h P期周光期周光，℃2)： (28±re allus cultu C養(yǎng)培織組傷愈；pH1 KT－·L g 1 m＋A1 NA－·L g 2 m＋：MSallus initiation C織組傷愈軸胚下A 2棉洲亞0 7 sity inten ight L強(qiáng)光，/8 D L 16 eriod otop h P 5.8;cotyls ypo H reum .arbo G速轉(zhuǎn)re：n cultuensiousp S養(yǎng)培?。?。 懸2·s－m l·o m μ d an callus selection ryogenic b m E持保與擇選織組傷愈性胚d 16 perio to ho P期周光－1，·min r 30 en speed 1 ak h S;.8；pH51 KT－·L g m 0.1＋A1 NA－·L g 0.5 m＋：MS ce an ainten m.8 ℃，2/8 D L in S lture： M cu ryo initiation b id em iqu L織組傷愈性胚養(yǎng)培浮懸rary po d tem 3程過(guò)水脫3 d行進(jìn)前基養(yǎng)培胚體）;O 3 NH 4 o N,nO 3 N K led（doub id liqu re efo b tissue callus f o esiccation d r o starvation ＋S：M ration atu m and ation in ryo germ b atic em m o S熟成和發(fā)萌胚體.2 0＋A1 NA－·L ol m 2.6 m＋：MS ia ed transfer to m 5.8.；pH1 sucrose－·L ol 4 m.0 0＋A1 NA－·L ol m 0.3 m.1 KT－L ol·m 0.2 m1 glucose ＋－L ol·m

獻(xiàn)文考參ces eferen R 8][1 9][1 0][2 0][2件條養(yǎng)培s ndition re co ltu u C rescent ite fluo h ol w o C燈光熒白冷；1) ℃±7(2光2－·s1；－m·ol m 0 μ 6 0～ight intensity 4 L強(qiáng)光t,ligh.D/8 L d 16 perio hoto P期周熒白冷，/10 D L d 14 perio oto h P期周光；℃1)±8(2 ight L強(qiáng)光，t ligh t rescen fluo ite h w ol o C燈光1.2－·s－m·l o m μ 33 sity ten in熒白冷，/10 D L d 14 perio oto h P期周光；℃1)±8(2 ight L強(qiáng)光，t ligh t rescen fluo ite h w ol o C燈光1.2－·s－m·l o m μ 33 sity ten in）續(xù)（2表)n tio a u tin n o(C 2 le b a T基養(yǎng)培體植外組因基種棉體倍二ajor steps lved in m vo in edium M t lan xp E e om en G loid cotton ip D 4.64A＋1 NA－·L ol m μ 0.74 1＋S M n:uctio allus ind C導(dǎo)誘織組傷愈葉子、軸胚下;1 KT－m o l·L μ cotyls ypoH 1－·L l o m 8 μ 0.67＋B S: M ation ryo form b atic em om S成形胚胞細(xì)體on and cotyled altose.－1 M·L 30 g＋1 2IP－·L ol m.98 μ 2＋2,4-D 1－·L g 0.1 m＋A1 NA－·L g 2 m＋：MS n uctio allus ind C導(dǎo)誘織組傷愈、軸胚下、葉子3-d D棉氏遜維戴;T K葉真、莖幼nii avidso.d G 0.11 BA＋－·L g m 1＋：MSation form bryo atic em om S成形胚胞細(xì)體,on otyled C；A1 NA－·L g m cotyls,ypo h.A1 NA－·L g m 0.5＋：MSm ediu g m ootin R根生d ot an sholeaves 2 2.3＋-D1 2,4－·L l o m μ 0.09＋B：MSctions indu allu C導(dǎo)誘織組傷愈軸胚下.8;；pH51 KT－m o l·L μ cotyls ypo H：ce aintenan m and ction du ryogenic callus in b m E導(dǎo)誘織組傷愈性胚9 2.6＋B：MS esis gen bryo atic em m o S發(fā)萌胚體se alto M;%3＋B S M;1 KT－·L ol m μ 0.93＋1 IBA－·L l o m 6 μ 2.4＋A1 NA－m o l·L μ 6 2.4＋A1 NA－·L ol m.69 μ 2＋B：MSration atu ryo m b m E熟成胚體.1 KT－m o l·L 65 μ0.4＋1 IBA－m o l·L μ 2 2.3＋-D1 2,4－·L l o m μ 0.09＋B：MSduction allus in C導(dǎo)誘織組傷愈軸胚下D 5棉氏德蒙雷5.8;H p;1 KT－m o l·L μ cotyls ypo H dii on.raim G：ce aintenan m and ction du ryogenic callus in b m E導(dǎo)誘織組傷愈性胚;1 KT－·L ol m μ 65.4 01 2,4-D＋－·L ol m μ.226 0 se ＋co lu G%3＋B S M＋A1 NA－·L ol m μ 2.69＋B：MS genesis bryo atic em m o S發(fā)萌胚體;1 KT－L ol·m μ 0.93＋1 IBA－L l·o m μ 2.46 6 2.4＋A1 NA－·L ol m.69 μ 2＋B：MSration atu ryo m b m E熟成胚體.1 KT－m o l·L 65 μ0.4＋1 IBA－m o l·L μ

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胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的氮源去除NH4NO3（硝酸銨），同時(shí) KNO3（硝酸鉀）加倍可以成功誘導(dǎo)體胚發(fā)生[17,26]；碳源一般采用葡萄糖。 但是，誘導(dǎo)克勞茨基棉體胚需要采用蔗糖和麥芽糖混合碳源，此時(shí)胚胎發(fā)生率要比單獨(dú)使用葡萄糖高[20]。 麥芽糖是胚性愈傷組織增殖和體胚形成過(guò)程的最佳碳源之一[22]。

愈傷組織誘導(dǎo)繼代培養(yǎng)過(guò)程中，選擇懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)方式可有效增加體細(xì)胞數(shù)目，縮短體細(xì)胞胚胎發(fā)生時(shí)間[13]，較固體培養(yǎng)基更為有效。 此外， 培養(yǎng)基加入一定的活性炭更利于體細(xì)胞萌發(fā)、生根。

2.2 莖尖培養(yǎng)

棉花莖尖培養(yǎng)使用的是莖尖完整的分生組織，可以規(guī)避二倍體棉種在體胚轉(zhuǎn)化過(guò)程中基因型限制問(wèn)題， 且再生植株所需時(shí)間也相對(duì)較短，有效減少因繼代培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而引起的無(wú)性系變異。 目前莖尖培養(yǎng)研究主要集中于亞洲棉和比克氏棉[27-30]，其中比克氏棉莖尖培養(yǎng)獲得再生植株的時(shí)間[27]與體細(xì)胞培養(yǎng)[20]相比，可節(jié)省4 個(gè)月左右。 但通過(guò)莖尖培養(yǎng)建立再生系統(tǒng)的植株較少（表3）。

2.3 花藥培養(yǎng)

花藥培養(yǎng)培育單倍體植株，可用于探究胚胎發(fā)生的機(jī)理。 棉花花藥培養(yǎng)難度較大，仍處于探索階段。 棉花花藥培養(yǎng)受基因型、花藥培養(yǎng)的時(shí)期、培養(yǎng)條件等影響，進(jìn)展不大，其中亞洲棉較易誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，但難以從花藥培養(yǎng)中獲得再生植株；戴維遜氏棉較難誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷[31]。

2.4 原生質(zhì)體培養(yǎng)

原生質(zhì)體培養(yǎng)植株再生，需要經(jīng)歷原生質(zhì)體分離、純化培養(yǎng)、細(xì)胞壁再生、體胚發(fā)生等過(guò)程。原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞培養(yǎng)相比， 難度更大、培養(yǎng)過(guò)程更為復(fù)雜。 目前，僅有克勞茨基棉和戴維遜氏棉兩個(gè)棉種培養(yǎng)成功的報(bào)道，其主要來(lái)源為胚性細(xì)胞懸浮系（表4）[19,32-36]。

二倍體棉種原生質(zhì)體培養(yǎng)的周期較長(zhǎng)，培養(yǎng)方式有平板培養(yǎng)法、液體淺層培養(yǎng)法、固液相結(jié)合培養(yǎng)法等，對(duì)培養(yǎng)基、黑暗等培養(yǎng)條件要求較為嚴(yán)格（表5）。 其中，使用改良KM8P 進(jìn)行棉花二倍體種原生質(zhì)體培養(yǎng)，成功得到了再生植株。

2.5 種間雜種

利用原生質(zhì)體融合技術(shù)進(jìn)行體細(xì)胞雜交，從而獲得種間雜種。孫玉強(qiáng)[37]于2005 年首次成功通過(guò)來(lái)源于胚性愈傷組織和體細(xì)胞幼胚的原生質(zhì)體融合得到棉花體細(xì)胞雜種植株，其中，陸地棉和克勞茨基棉、陸地棉和戴維遜氏棉、陸地棉和比克棉、陸地棉和司篤克氏棉組合的種間雜種植株的可育性較高，且種間雜種植株在表觀上可觀察到雜種優(yōu)勢(shì)。

3 二倍體棉種組織培養(yǎng)研究展望

棉花組織培養(yǎng)難度較大，存在較大的種間差異，其后續(xù)研究方向有以下幾點(diǎn)：

3.1 胚性愈傷組織誘導(dǎo)

棉花組織培養(yǎng)的第一步通常為愈傷組織的誘導(dǎo)。 不同二倍體棉種產(chǎn)生愈傷組織的能力不同，其中以亞洲棉較為容易誘導(dǎo)愈傷組織。 同一棉種也可通過(guò)不同激素組合誘導(dǎo)愈傷組織[38]，但培養(yǎng)得到的愈傷組織形態(tài)各有不同：早期愈傷組織顏色較淺、部分質(zhì)地透明，排列疏松；晚期愈傷組織顏色變深，質(zhì)地松軟。 胚性愈傷組織為黃綠色，質(zhì)地較脆[39]。 可針對(duì)不同的棉種，通過(guò)不同的激素等組合，誘導(dǎo)愈傷組織。

3.2 消除基因型限制

體細(xì)胞培養(yǎng)體系研究見(jiàn)于亞洲棉、克勞茨基棉、戴維遜氏棉等棉種。 基因型差異導(dǎo)致培養(yǎng)周期的延長(zhǎng)，易造成體胚發(fā)育異常、體胚轉(zhuǎn)化率降低等，也使得愈傷組織繼代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差[23]。此外，亞洲棉[40]和雷蒙德氏棉[41]已完成全基因組測(cè)序，為研究關(guān)鍵功能基因提供了便利。

體細(xì)胞培養(yǎng)中愈傷組織分化為胚性愈傷組織是主要的瓶頸。 激活二倍體棉種控制胚胎發(fā)生能力的相關(guān)基因， 可能解決體細(xì)胞胚發(fā)生問(wèn)題。體細(xì)胞胚胎發(fā)生受體激酶SERKs基因參與植物發(fā)育、激素感應(yīng)及病理反應(yīng)等。GhSERK1 基因在胚性愈傷組織時(shí)表達(dá)量達(dá)到高峰，過(guò)表達(dá)該基因能夠加快愈傷組織形成胚性愈傷組織進(jìn)程[42]，縮短培養(yǎng)時(shí)間，而非本質(zhì)上提高愈傷組織分化率。

株植生再養(yǎng)培尖莖種棉體倍二3表re ltu cu tip m te s ia v n tio ra e n e g re n tto o c id lo ip f d list o A 3 le b a T獻(xiàn)文考參件條養(yǎng)培基養(yǎng)培體植外組因基種棉體倍二ces eferen R s dition re conultu C r steps ajo lved in m invoium ed M t plan x E e enom G n cotto id iplo D][28（L,light;/8 D 6 L toperiod 1ho P期周光；℃2)0±(3＋A1 NA－·L ol m-10.7 μ.3 0＋：MSctionoots indu h S養(yǎng)培芽發(fā)始起節(jié)葉子的葉子無(wú)A 2棉洲亞1;pH－2－·s·m ol m μ tensity 50 t in igh L強(qiáng)光）;ark,d D;P1 BA－·L l o m r4.4 μ 2.2oary on otyled C.arboreum G 5.8..6～5 P1 BA－·L ol m μ.4 4＋：MSoots proliferated h S養(yǎng)培殖增代繼f o evoidodes dn1 glucose.－·L 20 g＋：MSduction ts in oo R養(yǎng)培根生s on cotyled][29熒白冷;/8 D 6 L toperiod 1ho P期周光；℃1)5±(2養(yǎng)培芽發(fā)始起節(jié)葉子的葉子無(wú)t igh L強(qiáng)光，orescent light hite flu l w oo C燈光;P1 BA－·L g.5 or 2.0 m 1＋：MS n uctio ts ind oo le sh ultip M ary on otyled C H5.8.p－1;2·s－m ol·m μ 50～tensity 40 in 1－L g·m.5 0＋S：M ngated d elo oots harvested an h S養(yǎng)培殖增代繼f o evoidodes d n;A 3 G s on cotyled.S M duction：1/2 ts in oo R養(yǎng)培根生][30期周光；0 lx tensity 2 00 t in igh L強(qiáng)光；℃3)2±(2·g m.0 1＋：MS n.liferatio ro and p itiation ot in ho S養(yǎng)培殖增芽發(fā)始起尖莖葉子無(wú)./8 D 6 L 1 eriod otop h P;1 KT－L g·m 0.5＋P1 BA－L ot tips ho S.A－1 IB·L g m 0.75uid ＋liq in：MSduction ts in oo R養(yǎng)培根生s on tyled out co ith w][27熒白冷，/8 D 6 L toperiod 1ho P期周光；℃1)8±(2 1－·L g m.1 0＋P1 BA－·L g m 4＋B：MSctionoots indu h S養(yǎng)培芽發(fā)始起節(jié)葉子的葉子無(wú)G 1棉氏克比t igh L強(qiáng)光，orescent light hite flu l w oo C燈光.85;；pH5Z D T ary on otyled C ickii .b G 1.2－·s－·m ol m μ tensity 33 in;1 GA3－·L g 5 m.0 0＋B：1/2 MS lture bcu u S養(yǎng)培殖增代繼evoid odes d n on.carb ctivated A%0.5＋S M duction：1/2 ts in oo R養(yǎng)培根生s on of cotyled動(dòng)激：T hthylacetic acid；K ap-N 1酸乙萘：A A；N in 5 vitam B andre system ltu cu oog k S&ige urash M物機(jī)5 有B＋液母S：M B S；M re system ltu g cu oo k S&ige urash M液母S：M S：M注.iazuron hid T物生衍類脲基苯，)隆苯噻(靈葉脫：Z；TD 3 ibberellin A G素霉赤：3；GA rine opu in zylam en-B 6呤嘌基氨芐：6-P；BA utyric acid dole b In酸丁哚吲：；IBA etin in K素

養(yǎng)培體質(zhì)生原種棉體倍二4表s ie c e p s n tto co id lo ip f d o re ltu u t c s la p to ro P 4 le b a T獻(xiàn)文考參果結(jié)養(yǎng)培料材eferences R esult R aterial M 2][3 ass ell m C團(tuán)胞細(xì)ther callus n A織組傷愈藥花3][3 ass ell m C團(tuán)胞細(xì)s ocotyl callu yp H織組傷愈軸胚下4][3 n plant eratio egen R株植生再atic cell ature som m d im n an sio en sp nic cell su bryo m E胞細(xì)胚體熟成未，液浮懸胞細(xì)胎胚5][3 ass ell m C團(tuán)胞細(xì)allus C織組傷愈D 2-2essii arkn.h G棉西尼克哈9][1 ass ell m C團(tuán)胞細(xì)allus C織組傷愈D 3-diiavidson.d G棉氏遜維戴6][3 n plant eratio egen R株植生再genic callus bryo m E織組傷愈性胚

件條養(yǎng)培株植生再養(yǎng)培體質(zhì)生原種棉體倍二5表n tio ltiva u st c la p to ro p ia v n tio ra e n e g re n tto o c id lo ip r d l fo o c to ro p e h T 5 le b a T獻(xiàn)文考參件條養(yǎng)培基養(yǎng)培料材組因基種棉體倍二eferences R s dition ulture con C s r step ajo m in involvedm iu ed M aterial M e om en G tton species loid co ip D 4][3蕩振；ark D暗黑；：28 ℃n e solutionzym E解酶酶膠果%.5 1 ellulase ＋C酶素維纖：3%lution e so nzym E解酶浮懸胞細(xì)胎胚D 3-k棉基茨勞克）;h 24～－1（14·min r g 40hakin S;9M W P C icellulase ＋em H酶素維纖半%0.5 ase ＋ectin P胚體熟成未，液m ianuklotzsch.G暗黑；：28℃lture layer cu id hin liqu T養(yǎng)培層淺1－·L l o m μ 0.452＋8P：KMid layer cultureliqu hin T養(yǎng)培層淺體液ryonic b m E胞細(xì)ark;D.1 KT－·L ol m μ.465 0＋2,4-Dsion spen cell su強(qiáng)光，bes t tu rescen aylight fluo D管光熒光日)＋O 3 NH 4 o N(n B：MSction du s in bryo atic em m o S養(yǎng)培導(dǎo)誘胚體ature m and im 1.－2 s－·m l o m μ t intensity33 igh L 1－·L ol m 85 μ2.6＋1 IBA－·L ol m 60 μ2.4＋O 31 KN－·L ol m m 91.7 18atic cell som;A 3 G＋1 KT－·L l o m 7 μ 0.69＋A AN炭性活%0.05＋B：MS lture lantlets cuegenerated p R養(yǎng)培苗生再c tive charcoal.A 6][3；ark D暗黑；℃0)3：(28～n e solutionzym E解酶酶膠果%.5 1 ellulase ＋C酶素維纖：2%lution e so nzym E解酶織組傷愈性胚D 3-d棉氏遜維戴）;24 h1（14～－·min 0 r g 4 in ak h S蕩振;9M W P C icellulase ＋em H酶素維纖半%2 ase ＋ectin P genic bryo m E nii so david.G；℃)1±lasts culture：(28 top ro P養(yǎng)培體質(zhì)生原1 2,4-D＋－L l·o m 5 μ 0.4＋8P M re：K ltu plasts cu to ro P養(yǎng)培體質(zhì)生原callus.Dark暗黑;1 KT－L ol·m μ 0.93＋A1 NA－L l·o m μ2.68：5ediumover solid m id ith liqu re w ltu ble-layer cu ou d養(yǎng)培層雙液固.8P M K＋B3 MS cm 1－L ol·7 μm.3 15 I,－1 KL ol·m μ 10O,H 2 5·O 41 CuS－L l·o m μ 0.1,OH 2 7·O 4gS－1 ML ol·m 1.0 m,O 3 N－1 KL ol·m m.0 1,O 4 PH 2－1 KL ol·m m.2 0,O2H 2·l 21 CaC－L ol·m m：109M W P：C注；inetin K素動(dòng)激：T；K ylacetic acid th aph 1-N酸乙萘：A A；N oxyacetic acid en rophichlo-D 2,4酸乙氧苯氯二：-D；2,4edium m 8P M K基養(yǎng)培8P M：K P 8 M 5.8；K H p l,ito ann m/v)(m%,9 S E M.3 berellin A ib G素霉赤：3 A utyric acid；Gdole b In酸丁哚吲：A IB

Wuschel（WUS）基因表達(dá)能夠促進(jìn)體細(xì)胞胚胎的發(fā)育，該基因在下胚軸與非胚性愈傷組織階段表達(dá)微弱[38,43]。 過(guò)表達(dá)該基因，極大地提升了難分化棉種的愈傷組織分化率， 體胚發(fā)生率提高4倍[42]。

生長(zhǎng)素的合成、運(yùn)輸、響應(yīng)，在植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生、 發(fā)育等全過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。亞洲棉ARF 家族是參與生物素信號(hào)調(diào)節(jié)的重要轉(zhuǎn)錄因子，影響生長(zhǎng)素的運(yùn)輸和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與根、葉的形成[44]。

3.3 原生質(zhì)體融合

原生質(zhì)體融合，可以克服植物遠(yuǎn)緣雜交不親和性，創(chuàng)造體細(xì)胞雜種。 通過(guò)電融合法獲得多種由陸地棉和二倍體棉種克勞茨基棉、 比克氏棉、司篤克氏棉的原生質(zhì)體對(duì)稱融合產(chǎn)生的雜種植株[37,45-47]。將陸地棉與克勞茨基棉原生質(zhì)體非對(duì)稱融合，獲得了多種有利的田間材料[48]。 目前，對(duì)于棉花原生質(zhì)體融合， 仍需要擴(kuò)大基因型范圍，豐富材料基礎(chǔ)。