棉花花生間作田中花生蚜對(duì)吡蟲啉代謝抗性機(jī)制初步研究

楊媛雪，李卓，段愛(ài)玲，薛超，須志平，趙鳴*

（1.山東棉花研究中心，濟(jì)南250100；2.華東理工大學(xué)藥學(xué)院，上海200237）

棉花是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，棉田間作模式多樣。 花生作為重要的油料作物和經(jīng)濟(jì)作物，是棉花間作種植的主要作物之一。 棉花花生間作是一種集約利用農(nóng)業(yè)資源、提高土壤肥力的優(yōu)化種植模式，能夠大幅提高產(chǎn)量、經(jīng)濟(jì)、生態(tài)及社會(huì)效益[1]。 合理的間作套種可以通過(guò)改變農(nóng)田的生態(tài)結(jié)構(gòu)和環(huán)境條件，提高天敵的種群數(shù)量，降低或抑制害蟲的種群密度，進(jìn)而起到有效控制害蟲的作用。 同時(shí)，間作套種模式增加了田間作物物種的多樣性，使作物的群體結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜[2]，不同間作作物病蟲害發(fā)生的種類、抗藥性、防治方法和防治時(shí)期均存在一定的差異，同時(shí)對(duì)不同作物上的一類害蟲而言，在施藥情況完全相同的情況下不利于抗藥性的延緩。

棉蚜（Aphis gossypiiGlover）是棉花上的主要害蟲，以直接刺吸汁液為害，同時(shí)排泄蜜露，影響棉花的光合作用， 還可作為媒介傳播多種病毒，導(dǎo)致棉花產(chǎn)量和品質(zhì)降低[3]。 花生蚜（Aphis craccivoraKoch.）又稱豆蚜、苜蓿蚜，主要取食花生、豌豆、豇豆和苜蓿等豆科植物。 花生蚜是我國(guó)花生產(chǎn)區(qū)的一種常發(fā)性害蟲，并且是花生病毒病的重要傳播媒介， 嚴(yán)重影響花生產(chǎn)量和品質(zhì)，一般年份減產(chǎn)5%～10%， 嚴(yán)重時(shí)達(dá)20%～30%[4]。吡蟲啉是新煙堿類殺蟲劑的代表， 由于其高效性、持效性以及對(duì)哺乳動(dòng)物低毒而廣泛應(yīng)用于刺吸式口器等害蟲的防治[5]，對(duì)許多種類的昆蟲產(chǎn)生了抗藥性。 自20 世紀(jì)末至今，粉虱、飛虱、馬鈴薯甲蟲、 蚜蟲等對(duì)吡蟲啉產(chǎn)生抗藥性相繼被報(bào)道[3,6-9]。 吡蟲啉在棉田和花生田中的應(yīng)用都比較多，對(duì)蚜蟲、薊馬、葉螨以及地下害蟲都具有較好的防治效果。在棉花花生間作的農(nóng)田中，蚜蟲是2種作物上的重要害蟲。 棉蚜對(duì)吡蟲啉的抗藥性機(jī)制研究相對(duì)較多， 而花生蚜的相關(guān)研究相對(duì)較少[4,10-11]。 本研究比較了棉花花生間作農(nóng)田中棉蚜和花生蚜對(duì)吡蟲啉毒力的差異，并初步探討了花生蚜對(duì)吡蟲啉代謝抗藥性的機(jī)制，以期為該類間作農(nóng)田合理用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

敏感品系的棉蚜為2016 年采自山東臨清棉田，連續(xù)室內(nèi)飼養(yǎng)，不接觸任何殺蟲劑的相對(duì)敏感品系。 敏感品系花生蚜為國(guó)家南方農(nóng)藥創(chuàng)制中心上海基地提供原始敏感品系，后經(jīng)華東理工大學(xué)須志平副教授室內(nèi)連續(xù)飼養(yǎng)，于2018 年贈(zèng)與，飼養(yǎng)過(guò)程中不接觸任何殺蟲劑。 2 個(gè)花生蚜和棉蚜田間種群于2019 年分別采自山東巨野（JY）及山東臨清（LQ）的棉花花生間作的田中。飼養(yǎng)條件為（25±1）℃、光周期 16 h∶8 h、相對(duì)濕度 70%～80%。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1毒力測(cè)定。采用浸葉法對(duì)棉蚜和花生蚜進(jìn)行毒力測(cè)定[12]。 將吡蟲啉原藥用二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解后，用含 0.05%（體積分?jǐn)?shù)）TritionX-100 的清水將吡蟲啉稀釋成5 個(gè)系列濃度， 以含有體積分?jǐn)?shù)為0.05%的TritionX-100 和1%的DMSO 的蒸餾水作空白對(duì)照。選擇帶蟲棉花或花生葉， 剔除有翅成蚜和若蚜后，保留大小一致的無(wú)翅成蚜作為試蟲，在藥液中浸漬5 s 后，用干凈的濾紙吸去多余的藥液，詳細(xì)記錄各處理的試蟲數(shù)后，放入養(yǎng)蟲盒內(nèi)。 每處理4 次重復(fù)，每重復(fù)不少于40 頭。 將處理好的試蟲置于溫度（25±1）℃、相對(duì)濕度70%～80%、光周期16 h∶8 h 的人工氣候室中飼養(yǎng)觀察。 處理24 h 后，檢查記錄試蟲死亡情況。

1.2.2酶抑制劑對(duì)殺蟲劑毒力的影響測(cè)定。分別將順丁烯二酸二乙酯（Diethyl maleate,DEM）、胡椒基丁醚（Piperomyl butoxide,PBO）和磷酸三苯酯 （Triphenyl phosphate,TPP）3 種酶抑制劑溶于DMSO 中， 并使用含體積分?jǐn)?shù)為0.05%的TritionX-100 的清水將其稀釋至 20 mg·L－1，于浸藥前1 h 通過(guò)帶蟲浸液法處理2 種蚜蟲。 隨后進(jìn)行殺蟲劑毒力測(cè)定，24 h 后統(tǒng)計(jì)蚜蟲死亡率。

1.2.3花生蚜解毒酶活力測(cè)定。（1）酶液制備。分別收集敏感品系、2 個(gè)地理種群活成蟲，每處理重復(fù)3 次，凍于液氮中，用于后續(xù)所需的酶液制備。向凍存的蚜蟲中加入1.5 mL 濃度為0.1 mol·L－1（pH 7.4） 的磷酸緩沖液， 進(jìn)行冰浴研磨，于10 000×g（4 ℃）下離心 20 min，取上清液作為谷胱甘肽 -S- 轉(zhuǎn)移 酶 （Glutathione S-transferase,GST）和羧酸酯酶（Carboxylesterase, CarE）的酶源，每個(gè)處理重復(fù)3 次。

向凍存 的 蚜蟲中 加 入含 0.1 mol·L－1（pH 7.4）的磷酸緩沖液、1 mmol·L－1四元羧酸乙二胺四乙酸（Eethylenediaminetetaacetic acid, EDTA）、0.1 mmol·L－1二硫蘇糖醇（Dithiothreitol, DTT）、1 mmol·L－1丙硫氧嘧啶 （Propylthiouracil,PTU）和 1 mmol·L－1苯甲基磺酰氟（Phenylmethylsulfonyl fluoride,PMSF）的研磨液研磨后，于104×g（4 ℃）下離心 30 min。 取上清液，于 105×g（4 ℃）下離心60 min。用含體積分?jǐn)?shù)20%的甘油研磨液重懸浮離心后的沉淀物，將其作為細(xì)胞色素P450單 加 氧 酶 （Cytochrome P450 monooxygenase，P450）的酶源，每個(gè)處理重復(fù)3 次。

蛋白含量使用考馬斯亮藍(lán)方法測(cè)定[13]。

（2）GST 酶活力測(cè)定。 向 30 μL 酶液中加入20 μL 濃度為 0.01 mol·L－1的還原型谷胱甘肽（Glutathione,GSH）溶液，100 μL 濃度為 0.1 mol·L－1的磷酸緩沖液 （pH 7.4），80 μL 濃度為 0.01 mol·L－1的 1- 氯 -2,4- 二硝基苯 （CDNB） 溶液。27 ℃水浴條件下孵育20 min， 在340 nm 下測(cè)定OD值。 參考 Gao 等方法計(jì)算 GST 酶活力[14]。

（3）P450 酶活力測(cè)定。 取 450 μL 酶液，分別加入1 mmol·L－1煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（NADPH） 和 0.4 mmol·L－1的 7- 乙氧基香豆素各 25 μL，放置于 30 ℃下反應(yīng) 30 min。 然后加入0.03 mol·L－1的氧化型谷胱甘肽 35 μL 和 0.5 U的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶35 μL， 于室溫下靜置10 min以除去熒光背景。 加入含體積分?jǐn)?shù)50%乙腈的Tris 溶液 570 μL 以終止反應(yīng)。 檢測(cè)熒光值，激發(fā)波長(zhǎng)為390 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為465 nm。 每處理重復(fù)3 次，參考 Kwon 等的方法計(jì)算 P450 酶活力[15]。

（4） CarE 酶活力測(cè)定。 取 30 μL 酶液，加入0.1 mol·L－1（pH 7.4）的磷酸緩沖液 40 μL，底物100 μL （0.3 mol·L－1的 α- 醋酸萘酯中含有0.01 mmol·L－1的毒扁豆堿）。 于 30 ℃下孵育20 min。 加入 30 μL 顯色劑（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 1%固蘭B 水溶液與5%十二烷基磺酸鈉體積比2∶5，現(xiàn)配現(xiàn)用），室溫下靜置30 min，測(cè)定600 nm 下的OD值，每處理重復(fù) 3 次。 參考 Saito 的方法計(jì)算CarE 酶活力[16]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 23 軟件計(jì)算各供試藥劑的毒力回歸方程LC50和95%置信區(qū)間，利用t檢驗(yàn)分析2組數(shù)據(jù)之間的差異顯著性，數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤，顯著性差異水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 吡蟲啉對(duì)棉蚜和花生蚜的毒力測(cè)定

毒力測(cè)定結(jié)果（表1）顯示，巨野和臨清2 個(gè)田間棉蚜種群的抗性倍數(shù)為43.2 倍和54.6 倍，達(dá)到了中等抗性水平。 巨野和臨清2 個(gè)花生蚜田間種群的LC50分別是 2.971 mg·L－1和 1.313 mg·L－1，是室內(nèi)敏感品系的 8.3 倍和 3.7 倍，分別處于低等抗性水平和敏感水平。

2.2 花生蚜中不同酶抑制劑對(duì)吡蟲啉的增效作用

如表2 所示，在花生蚜中，3 種酶抑制劑對(duì)吡蟲啉的增效作用不同。 在巨野種群中，PBO 和DEM 對(duì)吡蟲啉都具有一定的增效作用，PBO 的增效作用較大，增效比達(dá)到了3.63，DEM 的增效比為1.95。 在臨清種群中，只有PBO 對(duì)吡蟲啉具有明顯的增效作用，而DEM 和TPP 對(duì)吡蟲啉不具有增效作用。由此推測(cè)，P450 和GST 在花生蚜對(duì)吡蟲啉的抗藥性中發(fā)揮重要作用。

表1 不同蚜蟲種群對(duì)吡蟲啉的抗性水平Table 1 Resistance of different populations of aphids to imidacloprid

表2 花生蚜中增效劑對(duì)吡蟲啉增效作用Table 2 Synergic effects of synergist on the toxicity of imidacloprid in A.craccivora

2.3 花生蚜不同地理種群間解毒酶活性差異

花生蚜不同地理種群3 種解毒酶活性檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。 巨野種群與敏感品系相比，CarE 活性沒(méi)有顯著性差異，而P450 和GST 活性前者顯著高于后者。 在臨清種群中，只有P450 活性顯著高于敏感品系，而CarE 和GST 活性與敏感品系沒(méi)有顯著性差異。

3 討論與結(jié)論

昆蟲抗藥性的分子機(jī)制主要包括靶標(biāo)敏感性的降低和解毒代謝作用的增強(qiáng)[17]。 殺蟲劑有效成分到達(dá)靶標(biāo)的量只占進(jìn)入體內(nèi)總藥量的很小一部分，大部分都被解毒代謝酶代謝后貯存于脂肪體中或排出體外。 因此，本研究中處于低水平抗性時(shí)期的田間種群主要是解毒代謝酶發(fā)揮作用[17]。 P450 是具有多重功能的超基因家族，在昆蟲中，其可以通過(guò)羥基化、環(huán)氧化等作用代謝有機(jī)磷、擬除蟲菊酯、新煙堿類等多種殺蟲劑，使昆蟲產(chǎn)生抗藥性[17-18]。

表3 不同地理種群花生蚜解毒酶活性Table 3 The activities of detoxification enzyme in different A.craccivora populations

在昆蟲中，某些P450 基因在對(duì)吡蟲啉抗藥性中發(fā)揮重要作用，如果蠅的CYP6G1[19]、家蠅的CYP6D1[20]、煙粉虱的CYP6CM1[6]、庫(kù)蚊的CYP9M10[21]、褐飛虱的CYP6AY1、CYP6ER1、CYP4CE1、CYP6CW1[22]，其體外表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物能夠代謝吡蟲啉。 Zhang 等在褐飛虱的研究中發(fā)現(xiàn)，PBO 能夠增加抗性種群對(duì)吡蟲啉的敏感性[23]， 表明P450 在田間抗吡蟲啉的褐飛虱種群中發(fā)揮重要作用，這與本研究結(jié)果一致。 許多研究表明， 與殺蟲劑解毒代謝相關(guān)的P450 基因通過(guò)表達(dá)量上調(diào)使蛋白量和活性升高。 在本研究中，PBO 降低了田間花生蚜種群對(duì)吡蟲啉的抗藥性， 并且抗性種群中P450 酶活性顯著高于敏感品系，二者結(jié)果是一致的。 因此，認(rèn)為P450 在花生蚜對(duì)吡蟲啉的抗藥性中發(fā)揮了重要作用，并且推斷可能是一個(gè)或多個(gè)P450 基因調(diào)控作用的結(jié)果。P450 主要通過(guò)基因過(guò)量表達(dá)和點(diǎn)突變介導(dǎo)害蟲抗藥性。 因此，應(yīng)進(jìn)一步檢測(cè)抗性種群與敏感品系中P450 基因序列以及表達(dá)量的差異， 找出關(guān)鍵P450 基因， 利用異源表達(dá)系統(tǒng)對(duì)上述鑒定到的關(guān)鍵P450 基因進(jìn)行體外表達(dá)， 分離純化表達(dá)的蛋白，并通過(guò)液質(zhì)聯(lián)通技術(shù)檢測(cè)其對(duì)吡蟲啉的代謝能力；利用RNAi 技術(shù)檢測(cè)干擾后的田間種群對(duì)吡蟲啉的敏感性變化，從而確定在花生蚜中對(duì)吡蟲啉抗性具有作用的P450 基因， 進(jìn)而明確花生蚜對(duì)吡蟲啉代謝抗性的機(jī)理。

棉花花生間作是一種集約利用農(nóng)業(yè)資源、提高土壤肥力的優(yōu)化種植模式， 大幅提高了產(chǎn)量、經(jīng)濟(jì)、生態(tài)和社會(huì)效益[24]，但存在用藥量大、害蟲抗性增長(zhǎng)等問(wèn)題。 棉蚜是棉田中的一種主要害蟲，目前防治方式主要以化學(xué)防治為主，藥劑主要選擇新煙堿類等殺蟲劑等，這種對(duì)農(nóng)藥的依賴性導(dǎo)致棉蚜抗藥性問(wèn)題日益嚴(yán)重。 因此，棉蚜抗藥性問(wèn)題的研究相對(duì)較多。Hirata 等研究表明，棉蚜nAChR β1 亞基R81T 突變導(dǎo)致其對(duì)新煙堿類殺蟲劑產(chǎn)生抗藥性[25]；Peng 等研究表明，CYP6A2與棉蚜對(duì)螺蟲乙酯抗藥性相關(guān)，并且介導(dǎo)其與α-氰戊菊酯的交互抗性[26]；張國(guó)福等研究發(fā)現(xiàn)CYP6CY3 與棉蚜對(duì)吡蟲啉抗性相關(guān)[27]；相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)CYP6CY14、UTGs 與棉蚜對(duì)噻蟲嗪抗性相關(guān)[18,28]。 本研究發(fā)現(xiàn)，2 種間作作物上的蚜蟲對(duì)吡蟲啉的抗藥性存在顯著性差異，2 個(gè)地理種群的棉蚜對(duì)吡蟲啉的抗藥性處于中等水平。 此結(jié)果與之前報(bào)道的結(jié)果一致， 崔麗等發(fā)現(xiàn)在河北廊坊、山東德州、新疆阿克蘇和奎屯地區(qū)棉蚜對(duì)吡蟲啉也處于中等抗性水平[3]。 而本研究發(fā)現(xiàn)2 個(gè)花生蚜田間種群對(duì)吡蟲啉則分別處于敏感和低水平抗性，推測(cè)是由于近年來(lái)吡蟲啉以拌種的形式應(yīng)用于防治花生地下害蟲，同時(shí)對(duì)苗期的花生蚜具有防治作用，但吡蟲啉等新煙堿類殺蟲劑在花生田中的應(yīng)用相對(duì)比棉田少而導(dǎo)致其抗性水平還沒(méi)有升高， 從而出現(xiàn)了在棉花花生間作田中，花生蚜和棉蚜對(duì)吡蟲啉抗藥性存在一定差異的現(xiàn)象。

綜上，如在間作農(nóng)田中對(duì)2 種作物上一致施藥，不僅會(huì)導(dǎo)致花生田中農(nóng)藥的浪費(fèi)，同時(shí)會(huì)對(duì)天敵產(chǎn)生不利影響，并且會(huì)加速花生蚜對(duì)吡蟲啉抗藥性的發(fā)生。 因此，建議在防治棉花花生間作農(nóng)田中蚜蟲時(shí)，應(yīng)針對(duì)2 種作物分別施藥，并且施藥時(shí)間和施藥次數(shù)都要有所差異，或者選擇其他可替代的新煙堿類殺蟲劑輪流使用，以此來(lái)降低吡蟲啉等化學(xué)藥劑對(duì)花生蚜的選擇壓，同時(shí)保護(hù)天敵、非靶標(biāo)生物，并且減少環(huán)境污染和對(duì)植物的藥害等，以科學(xué)有效防治該類間作農(nóng)田中的蚜蟲。