TRIM38基因非CpG島DNA甲基化與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤臨床預(yù)后的關(guān)系

殷安安 陸 南 賀亞龍 章 翔 劉玉河

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）是臨床上最常見且惡性程度最高的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，約占所有腦膠質(zhì)瘤的50%[1]?；谔婺虬返臉?biāo)準(zhǔn)治療方案對(duì)GBM治療效果存在巨大差異，原因主要是腫瘤內(nèi)部分子特征的異質(zhì)性。GBM的發(fā)生、發(fā)展伴隨著顯著的DNA 甲基化改變，其中以啟動(dòng)子CpG島超甲基化介導(dǎo)的抑癌基因表達(dá)沉默的研究最多[2，3]。然而，人類基因組中大約有40%的基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域并不包含CpG序列局部富集的CpG島結(jié)構(gòu)，只有散在分布的CpG 位點(diǎn)。這些基因的非CpG島DNA甲基化改變?cè)谀[瘤中作用尚不清楚，特別是GBM[4]。本研究基于課題組前期研究結(jié)果[2]，選取免疫基因TRIM38及其相關(guān)非CpG島DNA甲基化位點(diǎn)作為研究對(duì)象，利用公共數(shù)據(jù)庫信息，探討基因非CpG島DNA甲基化與GBM臨床預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 GBM 及非腫瘤腦組織（non-tumor brain，NTB）對(duì)照組 本研究納入GBM 樣本主要來自于：美國癌癥基因組圖譜計(jì)劃（TCGA；https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/）[5][共354例，其中男212例，女141例；中位年齡61 歲；O6-甲基鳥嘌呤-DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（O6-meth?ylguanine DNA methyltransferase，MGMT）啟動(dòng)子甲基化161例，未甲基化174例]；美國國立圖書館基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫（GEO；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中GSE22891 系列[6]（共50 例，其中男25 例，女24 例；中位年齡58 歲；MGMT 啟動(dòng)子甲基化29 例，未甲基化21 例）；中國膠質(zhì)瘤基因組圖譜計(jì)劃（CGGA；http://www.cgga.org.cn/）[7]（共105例，其中男62例，女43例；中位年齡46歲；MGMT啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)未知）。納入對(duì)照組樣本來自 GSE63347 系列（25 例）[8]、GSE22891系列（4例）及CGGA（8例）數(shù)據(jù)庫。

1.2 TRIM38 基因非CpG 島DNA 甲基化及基因表達(dá)數(shù)據(jù) 基于前期研究[2]，選取距離TRIM38轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)1 500 bp 范圍內(nèi)的獨(dú)立CpG 位點(diǎn)（探針cg22502502）為主要研究對(duì)象，CpG 甲基化數(shù)據(jù)來自Illumina 公司全基因組DNA 甲基化芯片，其水平由探針β值決定。部分納入樣本亦具有全基因組表達(dá)譜數(shù)據(jù)，均經(jīng)過芯片數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理，具體步驟詳見各參考文獻(xiàn)[5～7]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)及生物信息學(xué)分析 應(yīng)用GraphPad Prism及R 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；連續(xù)變量采用Mann-Whit?ney 檢驗(yàn)或t檢驗(yàn)；關(guān)聯(lián)性分析采用Spearman 檢驗(yàn)；生存分析采用生存曲線、log-rank 檢驗(yàn)及多因素Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸模型；分組界值由R 軟件maxstat 包計(jì)算；生物信息學(xué)分析由基因簇富集分析（GSEA）比較；P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TRIM38 基因非CpG 島DNA 甲基化及基因表達(dá)在GBM 中的改變模式 對(duì)比TRIM38 基因非CpG 島DNA 甲基化探針（cg22502502）在GBM 與對(duì)照樣本的數(shù)據(jù)，該探針在GBM 中β值顯著下降（P＜0.05；圖1a），提示該位點(diǎn)在GBM中呈低甲基化改變。同時(shí)，比較GBM 與對(duì)照樣本中TRIM38 基因的表達(dá)水平，其基因mRNA表達(dá)值顯著上升（P＜0.05；圖1b），提示該基因在腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。

2.2 TRIM38 基因非CpG 島DNA 甲基化與基因表達(dá)的關(guān)系 TRIM38 基因在GBM 中呈現(xiàn)的低甲基化狀態(tài)和高表達(dá)狀況，提示該基因可能存在非CpG 島DNA甲基化依賴的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制。為進(jìn)一步驗(yàn)證上述可能，利用Spearman 檢驗(yàn)分析甲基化與表達(dá)譜數(shù)據(jù)之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在不同數(shù)據(jù)庫中，TRIM38基因非CpG 島DNA 甲基化數(shù)據(jù)均與其基因表達(dá)數(shù)據(jù)呈顯著負(fù)向相關(guān)性（Spearman系數(shù)均小于-0.3，圖1c），進(jìn)一步提示非CpG 島DNA 甲基化可能參與TRIM38的表達(dá)調(diào)控。

2.3 TRIM38 基因非CpG 島DNA 甲基化與病人生存時(shí)間（overall survival，OS）的關(guān)系 為了減少單因素分析中其他因素對(duì)GBM 病人OS 數(shù)據(jù)的干擾，選取TCGA及GSE22891數(shù)據(jù)庫中接受替莫唑胺聯(lián)合放化療的原發(fā)GBM進(jìn)行生存分析，并利用maxstat計(jì)算最佳分組界值，將TCGA及GSE22891數(shù)據(jù)庫的GBM樣本分為兩組：TRIM38高甲基化組和低甲基化組。生存分析表明：兩組病例庫中，擁有高甲基化組OS 顯著優(yōu)于低甲基化組（P＜0.05；圖1d）。多因素Cox 回歸分析進(jìn)一步表明TRIM38甲基化水平GBM病人預(yù)后的獨(dú)立影響因素。

2.4 基于TRIM38甲基化分組的生物信息學(xué)分析 分別將TCGA 數(shù)據(jù)庫中TRIM38 高甲基化及低甲基化組GBM 樣本的全基因組表達(dá)譜數(shù)據(jù)帶入GSEA 分析，結(jié)果顯示低甲基化樣本（預(yù)后較差組）顯著富集免疫功能調(diào)控及Toll樣受體通路相關(guān)基因簇（表1）。

3 討論

GBM 內(nèi)部的分子異質(zhì)性是導(dǎo)致其臨床治療效果欠佳的主要原因之一[5]。表觀遺傳學(xué)，特別是DNA 甲基化，作為重要的分子調(diào)控機(jī)制廣泛參與腫瘤異質(zhì)性的形成。早在20世紀(jì)80年代，就有學(xué)者研究DNA 甲基化異常改變?cè)谀[瘤疾病中的意義。腫瘤特異的啟動(dòng)子區(qū)域CpG 島超甲基化，通過表觀遺傳機(jī)制沉默抑癌基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展[4]。然而，人類基因組中大約一半的基因，其轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域并不包含CpG 序列局部富集的CpG 島結(jié)構(gòu)，只有散在分布的CpG位點(diǎn)，被稱為非CpG島區(qū)域DNA甲基化位點(diǎn)[4]。目前，關(guān)于這些區(qū)域的DNA 甲基化改變?cè)诩膊√貏e是腫瘤中的作用及意義尚不清楚。我們的前期研究中，通過全基因組多組學(xué)數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)非CpG 島區(qū)域DNA 甲基化改變可能與免疫基因的表達(dá)及GBM病人預(yù)后廣泛相關(guān)[2]。

表1 TCGA 數(shù)據(jù)庫中富集于TRIM38 低甲基化樣本的代表性基因簇

圖1 TCGA 的腫瘤甲基化數(shù)據(jù)與GSE63347 的對(duì)照樣本進(jìn)行比較分析TRIM38非CpG島DNA甲基化在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的改變模式以及與基因表達(dá)、臨床預(yù)后的關(guān)系

TRIM38 來自TRIM 蛋白家族中最大的C-IV 亞組 ，包 括 RING 區(qū) 、BBox 區(qū) 及 PRY/SPRY 區(qū)[9]。TRIM38 能夠通過E3 泛素化連接酶、類泛素化酶以及其他作用方式廣泛參與固有免疫及炎癥反應(yīng)調(diào)控[9]?；谥叭蚪MDNA甲基化數(shù)據(jù)分析結(jié)果[2]，本文結(jié)果顯示TRIM38非CpG島甲基化位點(diǎn)在GBM中發(fā)生低甲基化改變，而基因水平發(fā)生高表達(dá)改變；關(guān)聯(lián)分析證實(shí)TRIM38非CpG島DNA甲基化水平與其基因表達(dá)呈強(qiáng)負(fù)向相關(guān)關(guān)系。這提示非CpG 島DNA 甲基化可能直接參與TRIM38的表達(dá)調(diào)控。因此，基因非CpG島甲基化，很可能和啟動(dòng)子CpG島相似，通過調(diào)控功能基因的表達(dá)，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。本文生存分析結(jié)果顯示，TRIM38甲基化程度與GBM病人OS顯著相關(guān)，多因素Cox比例回歸風(fēng)險(xiǎn)模型分析進(jìn)一步證實(shí)其為獨(dú)立預(yù)后影響因子。這些述結(jié)果提示基因非CpG島甲基化亦可能是用于預(yù)測(cè)腫瘤預(yù)后或治療反應(yīng)的獨(dú)立生物標(biāo)記物。為了尋找TRIM38甲基化預(yù)后分組背后的生物學(xué)背景，我們對(duì)GBM 樣本的全基因組表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行GSEA 分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲基化分組所帶來的預(yù)后差異很可能與其亞組之間重要功能基因簇表達(dá)程度的差異有關(guān)，其中具有代表性的基因簇包括免疫功能調(diào)節(jié)及Toll 樣受體通路相關(guān)的基因簇。Toll 樣受體通路是機(jī)體重要的免疫調(diào)控通路，能夠通過識(shí)別外源性或內(nèi)源性相關(guān)分子模式激活下游效應(yīng)因子，參與機(jī)體炎癥反應(yīng)和固有免疫反應(yīng)[10]。對(duì)于腫瘤，特別是GBM，Toll 樣受體通路被認(rèn)為是聯(lián)系腫瘤細(xì)胞增殖侵襲和免疫抑制活動(dòng)的重要信號(hào)樞紐[10]。既往研究表明，TRIM38 能夠通過多種方式（酶依賴或非酶依賴）調(diào)控Toll 受體通路下游信號(hào)蛋白及效應(yīng)因子激活狀態(tài)，從而影響Toll 樣受體通路依賴的病理生理過程[9]。因此，TRIM38 甲基化導(dǎo)致的預(yù)后差異很可能與TRIM38 基因異常表達(dá)和對(duì)Toll 樣受體通路的調(diào)控所帶來的腫瘤免疫活動(dòng)的影響有關(guān)。

總之，TRIM38可能通過非CpG島低甲基化介導(dǎo)的基因異常表達(dá)上調(diào)，參與GBM 發(fā)生、發(fā)展；TRIM38非CpG島甲基化可作為指導(dǎo)GBM預(yù)后評(píng)價(jià)的潛在生物標(biāo)記物；TRIM38甲基化導(dǎo)致的預(yù)后差異很可能與Toll樣受體通路及免疫調(diào)節(jié)的差異有關(guān)。