IL-8及SPB蛋白在兔海水及淡水淹溺型急性肺損傷模型中的表達

喬永平 劉軼寧

淹溺型急性肺損傷指因海水或淡水淹溺，液體經(jīng)口鼻進入肺泡組織，導(dǎo)致廣泛肺組織水腫，肺通氣量短時間內(nèi)下降，導(dǎo)致機體出現(xiàn)呼吸功能障礙，嚴重患者可在短時內(nèi)腦死亡[1-2]。海水，淡水因溶質(zhì)成分、理化性質(zhì)差異，引起急性肺損傷的機制通路有所不同，但兩者進入肺組織后除直接損失作用外，均引發(fā)肺組織廣泛炎癥因子分泌增多，炎癥反應(yīng)發(fā)生，同時可致低氧血癥，酸中毒等并發(fā)癥發(fā)生，故臨床認為淹溺型急性肺損傷患者損傷機制與炎癥發(fā)生有直接關(guān)聯(lián)[3-4]。IL-8屬于細胞白介素家族成員，是一種細胞炎癥因子，通常由干擾素α(TNF-α)調(diào)節(jié)其分泌激活過程，其具有促進白細胞趨化，粘附的作用，是炎癥反應(yīng)啟動的重要因子[5]。馮繼峰等人在研究中證實其在機械性急性肺損傷中分泌可增加，對肺組織炎癥發(fā)生有直接關(guān)聯(lián)[6]。SPB是一種屬于表面活性蛋白家族，是肺表面活性成分的主要組成部分，具有穩(wěn)定肺泡膜表面磷脂單分子層的作用，能有效降低表面張力維持肺泡結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；部分研究還認為SPB能在低氧情況下保護肺組織[7-8]。研究認為急性肺損傷發(fā)生過程中，因肺水腫、肺廣泛炎癥反應(yīng)作用，肺泡磷脂単分子層受到破壞，炎癥反應(yīng)可影響SPB分子活性加重肺損傷[9]。本研究擬探究IL-8與SPB蛋白在淹溺型肺損傷中的表達情況，試探究其在淹溺型肺損傷中的表達意義。

資料與方法

一、一般資料

取由大連醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心飼養(yǎng)健康成年新西蘭兔36只，采用隨機數(shù)表分組，將其分海水組，淡水組與對照組，各組實驗兔為雌、雄各6只。三組兔均在SPF級動物房飼養(yǎng)一周后行麻醉下氣管插管，氣管插管完成后，海水組兔經(jīng)氣管插管向氣管內(nèi)注射3 mL/kg配置海水，淡水組經(jīng)氣管插管向氣管內(nèi)注射18 mL/kg配置淡水，對照組兔僅行麻醉氣管插管操作。手術(shù)操作完成后，持續(xù)插管通氣4h，通氣結(jié)束后處死各組實驗兔，收集肺組織。三組實驗兔體重，年齡等一般資料數(shù)據(jù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，P>0.05(見表1)。本研究已經(jīng)動物實驗倫理委員會審核并通過。

表1 三組實驗兔基線指標對比

二、干預(yù)方法

取于動物實驗中心養(yǎng)殖健康成年新西蘭兔36只，采用隨機數(shù)表分組，將其分海水組，淡水組與對照組。選擇入組后均在SPF級動物飼養(yǎng)房中飼養(yǎng)一周，于手術(shù)前一天禁食禁水。手術(shù)過程：取實驗兔，耳緣靜脈完成靜脈置管后，予戊巴比妥鈉30 mg/kg緩慢推注，待動物疼痛反射消失后取其置于操作架上，經(jīng)口插入氣管導(dǎo)管，調(diào)整呼吸機參數(shù)維持呼吸頻率20～30次/分。取購置于第三海洋研究所，按我國東部沿海地區(qū)海水成分配置的人工海水，以3 mL/kg標準經(jīng)氣管導(dǎo)管注入海水組實驗兔肺內(nèi)；取取自本地符合水質(zhì)三級標準淡水，以18 mL/kg標準經(jīng)氣管導(dǎo)管注入淡水組實驗兔肺內(nèi)。對照組實驗兔僅行麻醉插管操作。完成操作后于耳緣靜脈注射50 mL空氣，處死實驗兔。

三、觀察指標

1 比較三組實驗兔肺組織干濕重比：取處死實驗兔肺組織直接稱重，稱取肺組織濕質(zhì)量，后將肺組織置于烘箱內(nèi)，設(shè)置烘箱參數(shù)80℃，持續(xù)烘干肺組織72 h后取出，稱取烘干后肺組織質(zhì)量，為肺組織干質(zhì)量，比較三組實驗兔肺組織兩次稱重比值大小。

2 比較三組實驗兔肺泡灌注液中IL-8及SPB蛋白水平：取處死實驗兔左上肺組織，以10 mL生理鹽水經(jīng)支氣管灌洗肺組織，回收灌洗液，后靜置回收液，置入離心機3000r離心后，取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定灌洗液中IL-8及SPB蛋白表達情況。檢測試劑盒購于R&D公司，具體操作按說明書進行。

3 比較三組實驗兔肺組織IL-8及SPB蛋白表達情況：取處死實驗兔左上肺組織，研磨后加入蛋白裂解液，置入離心機3000r離心后，取上清液加入40μg總蛋白，行凝膠電泳，將結(jié)果轉(zhuǎn)移至含有IL-8及SPB蛋白抗體的PVDF膜上，加入洗脫液洗膜后室溫下孵育1～2 h，使用Western bolt檢測肺組織內(nèi)IL-8及SPB蛋白表達情況，試劑盒采購于自碧云天生物技術(shù)研究所。

四、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、三組實驗兔肺組織干濕重比對比情況

海水組與淡水組W/D較對照組均明顯上升，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且兩組兔肺組織W/D無明顯差異(P>0.05)(見表2)。

表2 三組實驗兔肺組織干濕重比(W/D)

注：與對照組相比，*P<0.05,與海水組相比，兩組無明顯差異，#P>0.05

二、三組實驗兔肺泡灌洗液IL-8及SPB蛋白水平

海水組與淡水組肺泡灌洗液中IL-8水平較對照組表達均上升，SPB蛋白較對照組明顯下降，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且兩組兔肺泡灌洗液中IL-8及SPB蛋白水平無明顯差異(P>0.05)(見表3)。

表3 三組實驗兔肺泡灌洗液IL-8及SPB蛋白表達情況

注：與對照組相比，*P<0.05,與海水組相比，兩組無明顯差異，#P>0.05

三、三組實驗兔肺組織IL-8及SPB蛋白表達情況

海水組與淡水組肺組織中IL-8水平較對照組表達均上升，SPB水平較對照組明顯下降，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且兩組兔肺組織中IL-8及SPB蛋白表達無明顯差異(P>0.05)(見圖1)。

圖1 三組實驗兔肺組織IL-8及SPB蛋白表達

討 論

淹溺死亡是常見的死亡因素，近年來流行病學(xué)統(tǒng)計顯示，淹溺型急性肺損傷所致死亡事件以上升至各意外死亡事件中第二位，特別對于兒童患者，淹溺所致急性肺部損傷已成為兒童意外死亡主要原因之一，兒童因低氧耐受時間短，肺泡組織發(fā)育不完全等因素，導(dǎo)致兒童淹溺型急性肺損傷發(fā)生速度快，癥狀更嚴重，死亡率更高，故該病治療及其損傷通路研究是臨床研究熱點問題[10-11]。

淹溺型肺損傷主要可分為海水所致肺損傷與淡水所致肺損傷兩種類型，因海水與淡水主要溶質(zhì)成分、理化性質(zhì)不同，損傷機制也有所差異：一般認為高滲透海水能直接破壞肺上皮細胞，破壞該處通透性，導(dǎo)致肺水腫發(fā)生，而淡水型肺損傷主因低滲透壓液體滲入肺泡組織內(nèi)，導(dǎo)致肺水腫發(fā)生，同時可被血液循環(huán)吸收，從而引起免疫激活以及溶血反應(yīng)發(fā)生，進一步可致彌漫性血管炎癥發(fā)生[12-13]。兩者發(fā)生機制雖有不同，但都直接損傷肺組織，導(dǎo)致肺水腫發(fā)生，肺泡表面穩(wěn)定性下降，影響肺通氣換氣功能，同時均引起廣泛炎癥發(fā)生，導(dǎo)致肺組織進一步受損，引起不可能肺部損傷，最終致使低氧血癥，呼吸衰竭發(fā)生[14-15]。

IL-8屬細胞白介素成員，是一種多源性細胞炎癥因子，是由單核細胞，巨噬細胞等炎癥細胞所分泌的，其具有白細胞趨化作用，且能誘導(dǎo)其他趨化因子，黏附因子合成，特別是對于T淋巴細胞及中心粒細胞，其具有強趨化激活作用，能夠使其在局部聚集，產(chǎn)生大量炎癥活性物質(zhì)，引起炎癥反應(yīng)發(fā)生[16-17]。表面活性蛋白家族(SP)是一種由肺泡內(nèi)皮細胞分泌的，構(gòu)成肺表面活性物質(zhì)的主要蛋白結(jié)構(gòu)，SPB為其主要分泌蛋白，其能保持肺泡穩(wěn)定性，降低表面張力，維持通氣血流平衡，在急性肺損傷過程中，表面活性物質(zhì)質(zhì)量與性質(zhì)改變與病程發(fā)展直接相關(guān)[18]。研究發(fā)現(xiàn)SPB蛋白能維持表面活性物質(zhì)中磷脂分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，其能調(diào)節(jié)單分子與雙分子層結(jié)構(gòu)與形態(tài)，使表面張力穩(wěn)定在合適范圍內(nèi)，避免肺不張發(fā)生，其還可在低氧環(huán)境下保證肺通氣換氣過程正常進行，起到肺組織保護作用[19]。

本研究擬探究IL-8與SPB蛋白在淹溺型肺損傷中的表達情況，試探究其在淹溺型肺損傷中的表達意義。建模采用動物實驗中心飼養(yǎng)成年新西蘭兔，麻醉氣管插管完成后，經(jīng)氣管插管向氣管內(nèi)注射3 mL/kg配置海水完成海水組建模，經(jīng)氣管插管向氣管內(nèi)注射18 mL/kg配置淡水完成淡水組建模。既往實驗認為，海水中溶質(zhì)與淡水溶質(zhì)差異大，海水組使用與淡水組兔相同劑量建模時，已造成模型多器官損傷發(fā)生，造成非實驗影響因素增加，實驗誤差增加，在既往報道中認為，該建模方式兩組新西蘭兔單純肺部損傷、低氧、組織炎癥發(fā)生程度相似，故本文采用此建模方式[12]。

實驗結(jié)果顯示，海水組與淡水組W/D較對照組均明顯上升(P<0.05)，且兩組兔肺組織W/D無明顯差異(P>0.05)；提示兩組模型肺損傷程度相近。同時海水組與淡水組肺泡灌洗液中IL-8表達量較對照組表達均上升，SPB蛋白較對照組明顯下降(P<0.05)，且兩模型組兔肺泡灌洗液中IL-8及SPB蛋白表達無明顯差異(P>0.05)；海水組與淡水組肺組織中IL-8水平較對照組表達均上升，SPB水平較對照組明顯下降，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且兩組兔肺組織中IL-8及SPB蛋白表達無明顯差異(P>0.05)。

既往文獻報道及結(jié)合本文實驗結(jié)果，3 mL海水與18 mL淡水造模兩組兔肺損傷程度相近，兩組建模具有對比價值[2]。既往文獻報道兩種模型中的淹溺型急性肺損傷可能存在機制差異，但本文結(jié)果提示，在損傷程度相近時，兩組實驗兔IL-8及SPB蛋白在兩種損傷模型中的表達情況情況相近，故可認為不同機制下，淹溺型急性肺損傷實驗兔肺組織內(nèi)IL-8及SPB蛋白均出現(xiàn)異常表達，可能參與急性肺損傷形成過程[17]。

我們認為出現(xiàn)以上結(jié)果原因是：1)淹溺型急性肺損傷發(fā)生，無論是海水導(dǎo)致還是淡水導(dǎo)致，其重要機制均為廣泛肺部炎癥發(fā)生，在海水型淹溺肺損傷實驗中，高滲性海水直接破壞肺泡壁完整性，導(dǎo)致肺上皮細胞受損，炎癥因子分泌增加，故導(dǎo)致IL-8濃度明顯上升，而在淡水型淹溺肺損傷實驗中，低滲性淡水直接進入血管，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)激活，IL-8分泌增加，引起炎癥趨化作用發(fā)生；2)在海水型淹溺肺損傷實驗中，高滲性海水破壞肺泡完整性，導(dǎo)致肺上皮組織功能障礙，SP主要由肺上皮細胞分泌，SPB為其主要活性成分，故SPB在海水型淹溺肺損傷中表達明顯下降，而淡水型淹溺肺損傷實驗中，低滲性淡水直接進入肺泡，導(dǎo)致肺泡內(nèi)低滲透壓，液體進入肺泡組織，導(dǎo)致肺水腫發(fā)生，影響肺上皮細胞分泌功能，導(dǎo)致SPB分泌減少；3)兩型淹溺肺損傷均造成肺部廣泛炎癥發(fā)生，直接破壞肺上皮細胞功能，也導(dǎo)致SPB分泌較對照組明顯減少。另外我們注意到盡管海水與淡水致肺損傷機制并不完全相同，但實驗結(jié)果相近，這可能是因為盡管兩者致?lián)p原因不同，但均是引發(fā)炎癥浸潤，破壞正常肺組織，故兩者肺損傷病理結(jié)果相近，且IL-8與SPB蛋白均在該病理變化過程中承擔重要作用，病理標本中IL-8與SPB蛋白表達量相近。

海水組及淡水組淹溺型急性肺損傷實驗兔肺泡灌洗液 及肺組織IL-8及SPB蛋白表達量水平均明顯上升，SPB水平均明顯下降，提示IL-8表達增多及SPB蛋白表達下調(diào)參與該損傷發(fā)生過程密切相關(guān)。