非小細胞肺癌差異基因的篩選及預后分析

夏春偉 丁以艷 徐小峰 劉平

原發(fā)性肺癌是我國及世界范圍內發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，嚴重危害人類健康[1]。肺癌的發(fā)病率和死亡率呈明顯上升趨勢，2015 年我國新發(fā)肺癌病例 73.33 萬(男性50.93 萬，女性 22.40 萬)，居惡性腫瘤首位[2]。肺癌可以分為非小細胞肺癌(non small cell lung cancer,NSCLC)和小細胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)兩大類，非小細胞肺癌約占 80%～85%。肺癌的治療已從傳統(tǒng)的手術、放療、化療發(fā)展為包括分子靶向和免疫治療等綜合性治療，肺癌的分型也由單純的病理組織學分類，進一步細分為基于驅動基因的分子亞型[3]，NSCLC已進入精準診斷與治療時代[4]。因此，進一步研究肺癌特異性高的診斷標志物和治療靶點具有重要意義。

目前，高通量測序已經(jīng)廣泛應用于尋找疾病的候選基因，多種生物信息學數(shù)據(jù)庫為腫瘤基因的數(shù)據(jù)挖掘提供了便利[5-6]。本文從GEO數(shù)據(jù)庫中下載原始數(shù)據(jù)，對比NSCLC組織與正常肺組織的基因表達譜，篩選出差異表達基因，并進行預后分析，從而為NSCLC治療及判斷預后提供有價值的信息。

材料與方法

一、下載基因芯片數(shù)據(jù)

Gene Expression Omnibus(GEO, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)是目前最全面的公共基因表達數(shù)據(jù)庫，由美國國立生物技術信息中心NCBI創(chuàng)建并維護[7]。從GEO下載三個基因表達數(shù)據(jù)集(GSE19804、GSE27262、GSE18842)。GSE19804數(shù)據(jù)集由Lu等于2010年發(fā)表，包含60個女性肺癌樣本及配對的癌旁組織[8]。GSE27262包含25例肺癌組織及配對肺組織標本[9]。GSE18842包含46例肺癌組織及45例正常肺組織[10]。三組數(shù)據(jù)集的研究平臺均為GPL570，Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array。

二、篩選差異基因

利用 GEO2R 軟件分別分析三個數(shù)據(jù)集中的肺癌組織與正常肺組織中的差異表達基因。以P≤0.01,log2 FC(fold change)絕對值≥1.5作為標準篩選差異表達基因。

三、GO和KEGG通路富集分析

DAVID(The Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery)是一個強大的生物信息數(shù)據(jù)庫，整合了生物學數(shù)據(jù)和分析工具[11]。KEGG(京都基因與基因組百科全書)用于從高通量實驗技術生成的大規(guī)模分子數(shù)據(jù)集中分析高級功能和生物系統(tǒng)的數(shù)據(jù)庫資源[12]。GO(gene ontology)是基因本體聯(lián)合會所建立的數(shù)據(jù)庫，用于注釋基因并分析這些基因的生物學過程[13]。GO的3個一級功能，它們分別是細胞學組份(Cellular Component)、生物學功能(Biological Process)和分子功能(Molecular Function)。用DAVID分析差異基因的功能及生物學信息，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

四、蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡建設及功能分析

對差異基因通過STRING(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes, http://string-db.org)在線數(shù)據(jù)庫進行PPI網(wǎng)絡分析[14]。將綜合評分>0.4的交互作用被認為具有統(tǒng)計學意義。Cytoscape是一個生物信息學軟件平臺，具有可視化的分子相互作用網(wǎng)絡[15]。通過Cytoscape中的MCODE篩選核心差異基因。選擇的標準是MCODE評分>5分，degree cut-off=2，node score cut-off=0.2，Max depth=100，k-score=2。

五、核心差異基因的生存分析

使用Kaplan-Meier plotter(http://kmplot.com/analysis/)數(shù)據(jù)庫來評估差異基因表達水平與總生存期的關系。每個基因根據(jù)mRNA表達值分為高、低表達兩組進行比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

六、核心差異基因在NSCLC中的表達

在oncomine數(shù)據(jù)庫中(https//www.oncomine.org/)檢索差異基因在NSCLC組織與正常肺組織的表達差異。同時選取我院標本庫10例NSCLC術后組織標本，采用實時熒光定量PCR(QPCR)檢測目的基因在NSCLC和正常肺組織中的表達，本研究獲得我院倫理委員會批準。使用Trizol試劑提取組織中總RNA，按照試劑盒提供說明書步驟進行。取一定量的RNA提取物，用RNase-Free ddH2O稀釋，取稀釋液進行OD260/OD280測定，比值在1.8～2.1之間可繼續(xù)用于下一步實驗。采用逆轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄成cDNA，-20℃保存cDNA備用。采用 TaKaRa SYBR Premix Ex Taq Ⅱ進行定量檢測，20ul 反應 體系中包括1μl cDNA，10μl SYBR Green，100 μM ASPM引物。QPCR的反應條件：95℃預變性3 min；95℃ 15 sec、60℃ 45 sec，40個循環(huán)。ASPM上游引物：5′-GGAAGTGAGCCCGACCGA-3′；下游引物：5′-GCAAAGGAAAGGAGACC-3′。以GAPDH 為內參，上游引物：5′-AGATCCCTCCAAAATCAAGTGG-3′；下游引物：5′-GGCAGAGATGATGACCCTTTT-3′。反應結束后確認 Real Time PCR 的擴增曲線和融解曲線。GAPDH 為內參基因，mRNA 的相對表達水平用 2-△△CT計算。

結 果

一、NSCLC差異基因的篩選

GSE18842從54675個基因中篩選出2054個基因，GSE27262從54675個基因中篩選出1470個基因，GSE19804從25248個基因中篩選出699個基因。對三個數(shù)據(jù)集取交集共包含401個差異基因(見圖1)。

表1 差異基因的GO及KEGG富集分析結果

二、差異基因GO和KEGG富集分析

用DAVID分析差異基因的生物學分類、功能及生物學信息。GO分析顯示生物學功能(BP)發(fā)生變化的主要表現(xiàn)在血管生成、損傷反應、細胞粘附、調節(jié)細胞增殖等。細胞學組份(CC)發(fā)生變化主要富集在細胞外區(qū)域部分、細胞表面和細胞質膜部分。分子功能(MF)主要富集在生長因子結合、碳水化合物結合、膜式結合、多糖結合和細胞因子活性。KEGG信號通路主要富集在細胞外基質受體相互作用、粘著斑和細胞粘附分子等通路(見表1)。

三、蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡分析

利用STRING進行差異基因間的蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡分析，將數(shù)據(jù)導入Cytoscape進行可視化，PPI網(wǎng)絡共涉及個346節(jié)點和1415條邊(圖2)。同時用Cytoscape中MCODE模塊進行進一步篩選，共篩選出29個節(jié)點386條邊，這29個即為最重要的差異基因(圖3)。

圖1 從GSE19804、GSE27262、GSE18842三個數(shù)據(jù)集，以P<0.01,log2FC絕對值>1.5為標準，這三個數(shù)據(jù)集顯示了401個差異基因的重疊

圖2 Cytoscape進行差異基因的PPI網(wǎng)絡分析

圖3 PPI網(wǎng)絡分析篩選出的29個差異基因

四、生存分析

選取PPI網(wǎng)絡中連通度(degree)排序靠前的基因，使用Kaplan-Meier plotter對其進行預后分析。其中，ASPM、CDC20、CENPF、DLGAP5、NUSAP1、TOP2A、TPX2、RRM2、ANLN基因的高表達均影響肺癌患者的總體生存率(見圖4)。

五、ASPM 在肺癌組織中的表達。

在oncomine數(shù)據(jù)庫中Selamat數(shù)據(jù)集中[16]，對58例肺癌標本及58例正常肺組織進行研究，發(fā)現(xiàn)ASPM表達在肺癌組織中明顯上調(P<0.001，圖5A)。選取10例正常肺組織及肺癌組織通過QPCR檢測ASPM，其表達水平分別為0.97±0.04、2.83±0.59，差異有統(tǒng)計學意義，P<0.01(圖5B)。

圖4 差異基因的預后分析

圖5 ASPM在NSCLC中表達上調 A.oncomine數(shù)據(jù)庫中Selamat數(shù)據(jù)集，ASPM在肺癌組織中高表達。B.QPCR 顯示ASMP在肺癌組織中的表達較正常組織顯著增加。

討 論

GEO 數(shù)據(jù)庫中存在大量的測序數(shù)據(jù)，通過生物信息學方法挖掘具有研究價值的基因，為進一步深入研究提供了方向。本研究從三個數(shù)據(jù)集中共篩選出401個差異基因。進行GO及KEGG富集分析，通過PPI網(wǎng)絡分析篩選出29個差異基因。使用Kaplan-Meier plotter 對重要的核心基因進行預后分析，發(fā)現(xiàn)ASPM等基因其低表達患者的總生存期較高表達患者明顯延長。通過oncomine數(shù)據(jù)庫檢索，ASPM表達在肺癌組織中較正常組織明顯上調，進一步行QPCR驗證，ASPM在肺癌組織中高表達，差異有統(tǒng)計學意義。

人類異常紡錘體樣小頭畸形相關蛋白基因(Human Abnormal Spindle-like Microcephaly-associated,ASPM)，位于染色體1q31，全長65kb, 編碼區(qū)長10434bp，由28個外顯子構成。ASPM參與所有分裂細胞的紡錘體組織，紡錘體定位和胞質分裂，并且蛋白質的極端C-末端是ASPM定位和功能所必需的[17]。ASPM在胚胎期神經(jīng)形成中起重要作用，與常染色體隱性遺傳小頭畸形的發(fā)病相關[18]。研究發(fā)現(xiàn)，ASPM在胎兒和成人組織中廣泛表達，并在增殖旺盛的組織及腫瘤組織中高表達[19]。

Wang等的研究首次證明，ASPM在是胰腺導管腺癌(PDAC)細胞系及腫瘤組織中表達上調，并與患者預后相關。進一步研究發(fā)現(xiàn)，ASPM通過維持PDAC細胞的Wnt-β-catenin信號傳導促進PDAC的侵襲性[20]。Bikeye等研究了175個膠質瘤樣本中的mRNA表達，發(fā)現(xiàn)ASPM的表達與腫瘤分級密切相關，并且在腫瘤復發(fā)時表達增加，表明ASPM參與膠質瘤的惡性進展，并且是潛在的治療靶點[21]。Xu 通過TCGA數(shù)據(jù)庫收集6個膀胱癌微陣列mRNA表達數(shù)據(jù)集，并進行RT-PCR分析，研究中發(fā)現(xiàn)膀胱癌組織中ASPM mRNA表達高于癌旁正常組織，ASPM mRNA表達與膀胱癌的分期和腫瘤轉移顯著相關[22]。Pai VC的研究發(fā)現(xiàn)[23]，ASPM的表達在原發(fā)性和轉移性前列腺癌(PCA)中逐漸上調，ASPM表達的下調顯著減弱了PCA細胞的增殖，克隆形成和侵入行為。腫瘤中ASPM高表達細胞的比例與PCA患者的無復發(fā)存活率成反比。ASPM與經(jīng)典Wnt信號傳導的上游調節(jié)因子Dvl-3相互作用，是PCA中Wnt信號傳導和腫瘤干細胞的必需調節(jié)因子，具有重要的臨床和治療意義。

多項研究證實ASPM在多種腫瘤組織中高表達，可以促進腫瘤細胞的增殖、侵襲，但其在肺癌中的研究較少，具體促癌機制的研究未見報道，值得進一步研究。綜上所述，本研究對NSCLC芯片數(shù)據(jù)進行生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)ASPM在肺癌組織中高表達，可能是 NSCLC 的潛在治療靶基因，下一步仍然需要更多的研究來驗證。