白花蛇舌草水提物對(duì)鼻咽癌細(xì)胞放療增敏的作用及其機(jī)制

劉 暢,鄭榮華,溫 武,朱敏輝*

(1上海市中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院耳鼻喉科,上海 200032;2第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院耳鼻喉科;*通訊作者,E-mail:zhuminhui197915@163.com)

鼻咽癌是發(fā)生于鼻咽腔頂部和側(cè)壁的惡性腫瘤,由多種因素誘發(fā),如遺傳變異、環(huán)境因素和Epstein-Barr(EBV)病毒感染[1]。據(jù)GLOBOCAN數(shù)據(jù)庫(kù)顯示,2012年全世界報(bào)告8萬(wàn)多例鼻咽癌新病例,其中中國(guó)、東南亞、北非和太平洋島嶼的發(fā)病率最高。與大多數(shù)其他惡性腫瘤不同,由于鼻咽癌的解剖位置和放射敏感性,放療是鼻咽癌的主要治療方法[2]。白花蛇舌草是茜草科植物之一,是我國(guó)古代著名的藥用植物。現(xiàn)有證據(jù)表明白花蛇舌草成分具有多種生物功能,包括抗血管生成、抗炎、抗氧化、促凋亡等[3]。更重要的是,白花蛇舌草提取物在許多臨床前癌癥研究中顯示出顯著的抗癌活性[4,5]。然而,白花蛇舌草提取物在鼻咽癌細(xì)胞中潛在作用的相關(guān)研究在文獻(xiàn)檢索范圍內(nèi)鮮有報(bào)道。本研究擬在體外進(jìn)行白花蛇舌草提取物對(duì)鼻咽癌細(xì)胞CNE-1放療增敏的實(shí)驗(yàn)研究,以探討白花蛇舌草提取物在放療增敏中的作用機(jī)制,從而為臨床鼻咽癌放療增敏提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 材料

白花蛇舌草水提物:白花蛇舌草(江西天師中藥集團(tuán)余江制藥廠)30 g加蒸餾水3 000 ml溫火煎煮60 min,加熱沸騰30 min,網(wǎng)篩過(guò)濾去渣,離心取上清液濃縮為300 ml,0.2 μm過(guò)濾除菌,備用。RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清均購(gòu)自Gibco公司;抗LASP1抗體和抗β-actin抗體和辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的二抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司;BCA法蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染試劑盒和CCK-8試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

鼻咽癌細(xì)胞系CNE-1購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所。細(xì)胞培養(yǎng)于添加有10%胎牛血清、青霉素(100 U/ml)、鏈霉素(100 U/ml)的RPMI1640培養(yǎng)基中,且在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞增殖檢測(cè)

采用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的鼻咽癌細(xì)胞CNE-1制成細(xì)胞懸浮液,以1×103個(gè)/孔細(xì)胞的量接種至96孔板內(nèi),重復(fù)3孔。培養(yǎng)24 h后,各孔加入不同濃度白花蛇舌草(100,200,400 μg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)24,48,72 h,或者不同劑量的射線(2,4,6,8 Gy)照射24 h。離心棄去培養(yǎng)液,每孔加入含10%的CCK-8試劑的培養(yǎng)液繼續(xù)震蕩培養(yǎng)20-30 min,450 nm處檢測(cè)各孔OD值并記錄結(jié)果。細(xì)胞活性=(試驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=1-腫瘤細(xì)胞存活率(%)。根據(jù)此實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們進(jìn)一步選擇2 Gy射線及400 μg/ml白花蛇舌草水提物處理細(xì)胞,將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、射線組、白花蛇舌草組、射線+白花蛇舌草組。

1.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CNE-1細(xì)胞(1×103個(gè)/孔)接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,隨機(jī)分為4組:空白對(duì)照組、射線組、白花蛇舌草組、射線+白花蛇舌草組。細(xì)胞分別經(jīng)過(guò)白花蛇舌草、放射線以及白花蛇舌草和放射線聯(lián)合處理24 h后,消化離心收集細(xì)胞,加入5 μl的Annexin Ⅴ-FITC和10 μl的PI染料,輕輕混勻后室溫避光孵育10 min,于流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5 RNA提取與熒光定量PCR

CNE-1細(xì)胞隨機(jī)分為4組:空白對(duì)照組、射線組、白花蛇舌草組、射線+白花蛇舌草組。采用TRIzol法提取各組細(xì)胞中總RNA,檢測(cè)RNA的純度及濃度。以總RNA為模板,利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒擴(kuò)增得到cDNA。采用SYBR Green PCR試劑盒,以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)為內(nèi)參進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)LASP1 mRNA水平。根據(jù)2-ΔΔCt方法計(jì)算LASP1的相對(duì)表達(dá)水平,每組設(shè)置3個(gè)平行。RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及定量PCR條件與反應(yīng)體系均按照對(duì)應(yīng)說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.6 Western blot分析

收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液,離心后加入蛋白裂解液反應(yīng)30 min,提取細(xì)胞總蛋白。BCA法測(cè)定蛋白濃度,采用SDS-PAGE分離等量的蛋白質(zhì),采用濕法將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上。經(jīng)5%脫脂牛奶/TBST封閉,一抗過(guò)夜孵育后,TBST清洗后加入二抗,室溫下孵育90 min。加入ECL顯色劑后置于凝膠成像儀檢測(cè)目標(biāo)蛋白水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析,組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)和Tukey檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白花蛇舌草水提物對(duì)鼻咽癌細(xì)胞CNE-1的抑制作用

鼻咽癌細(xì)胞CNE-1經(jīng)不同濃度(100,200,400 μg/ml)白花蛇舌草水提物分別處理24,48,72 h后,CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)白花蛇舌草對(duì)CNE-1細(xì)胞的抑制作用。結(jié)果顯示,隨著白花蛇舌草水提物濃度增加,其對(duì)CNE-1細(xì)胞活性的抑制率逐漸增加(見圖1),表明白花蛇舌草水提物對(duì)CNE-1細(xì)胞活性的抑制具有濃度依賴性。在同一濃度下隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng),其對(duì)CNE-1細(xì)胞活性的抑制率也逐漸增加(見圖1),表明白花蛇舌草水提物對(duì)CNE-1細(xì)胞活性的抑制具有時(shí)間依賴性。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中,我們選擇400 μg/ml白花蛇舌草水提物處理細(xì)胞24 h,研究其在射線影響鼻咽癌細(xì)胞活性中的作用。

與100 μg/ml相比,*P<0.05;與24 h相比,#P<0.05圖1 白花蛇舌草水提物對(duì)鼻咽癌細(xì)胞CNE-1的抑制作用Figure 1 The effect of Hedyotis Diffusa on CNE-1 cell proliferation

2.2 白花蛇舌草水提物增強(qiáng)射線對(duì)細(xì)胞活性的抑制

CNE-1細(xì)胞經(jīng)2,4,6,8 Gy射線單獨(dú)處理24 h后,CCK-8試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活性發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,2,4,6,8 Gy射線照射后相對(duì)細(xì)胞活性分別為94.7%±1.6%,85.0%±1.7%,78.2%±1.6%,71.6%±3.1%,表明射線單獨(dú)處理細(xì)胞可抑制細(xì)胞活性。隨后,將CNE-1細(xì)胞分為4組:對(duì)照組、射線組、白花蛇舌草水提物組、射線+白花蛇舌草組,然后檢測(cè)白花蛇舌草水提物結(jié)合射線對(duì)細(xì)胞活性的影響。結(jié)果顯示射線聯(lián)合白花蛇舌草水提物處理細(xì)胞后,對(duì)細(xì)胞活性的抑制作用顯著增強(qiáng),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖2)。

與對(duì)照組相比,*P<0.05;與射線組相比,#P<0.05圖2 白花蛇舌草水提物聯(lián)合射線對(duì)細(xì)胞活性的影響Figure 2 The effect of Hedyotis Diffusa combined with irradiation on cell proliferation

2.3 白花蛇舌草水提物結(jié)合射線對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

將CNE-1細(xì)胞分為4組:對(duì)照組、射線組、白花蛇舌草水提物組、射線+白花蛇舌草水提物組,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。射線和白花蛇舌草單獨(dú)處理細(xì)胞時(shí),均可促進(jìn)細(xì)胞凋亡,聯(lián)合處理顯著增加細(xì)胞凋亡率,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖3)。

圖3 白花蛇舌草水提物結(jié)合射線對(duì)細(xì)胞凋亡的影響Figure 3 The effect of Hedyotis Diffusa combined with irradiation on cell apoptosis

2.4 白花蛇舌草水提物結(jié)合射線對(duì)LIM和SH3蛋白1(LASP1)蛋白表達(dá)的影響

熒光定量PCR檢測(cè)和Western blot分別檢測(cè)不同處理組細(xì)胞中LASP1 mRNA和蛋白表達(dá)變化。結(jié)果顯示,射線和白花蛇舌草水提物單獨(dú)處理細(xì)胞可不同程度增加LASP1的表達(dá),聯(lián)合處理可顯著增加LASP1的表達(dá)水平,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖4)。

與對(duì)照組相比,*P<0.05;與射線組相比,#P<0.05圖4 白花蛇舌草水提物結(jié)合射線對(duì)LASP1 mRNA水平和蛋白表達(dá)的影響Figure 4 The effect of Hedyotis Diffusa combined with irradiation on LASP1 mRNA and protein levels

3 討論

鼻咽癌是鼻咽組織形成的惡性腫瘤,是一種罕見的頭頸癌,在中國(guó)南部和東南亞尤為常見。與其他以手術(shù)為主的頭頸部腫瘤不同,鼻咽癌的主要治療策略是放療。放射治療、人群篩查和有效的全身用藥等方面的進(jìn)展顯著降低了鼻咽癌的死亡率。特別是調(diào)強(qiáng)適形放療的應(yīng)用,大大改善腫瘤控制,降低毒副作用[6]。然而,耐輻射誘導(dǎo)的局部失效仍然是鼻咽癌治療失敗的主要原因。此外,對(duì)治療的反應(yīng)因腫瘤細(xì)胞遺傳背景的個(gè)體間差異和變異而異。例如,總劑量為70-80 Gy射線照射后,部分患者鼻咽癌殘余病灶仍然存在,而其他患者僅照射40 Gy后,鼻咽癌完全緩解。因此,鼻咽癌的耐藥機(jī)制亟待闡明,以制定耐藥逆轉(zhuǎn)策略和增加生物標(biāo)志物以指導(dǎo)個(gè)體化治療。

草藥已在亞洲多個(gè)國(guó)家得到應(yīng)用,已有大量研究報(bào)道天然草藥提取物的體外抗癌活性。白花蛇舌草是一種有價(jià)值的具有抗癌活性的傳統(tǒng)藥用植物。研究發(fā)現(xiàn),白花蛇舌草可顯著抑制肝癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和促進(jìn)凋亡,且白花蛇舌草通過(guò)調(diào)節(jié)肝功能、葡萄糖代謝和轉(zhuǎn)移來(lái)增強(qiáng)抗腫瘤作用[7,8]。白花蛇舌草通過(guò)抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-9和細(xì)胞間黏附分子-1的表達(dá)和ERK1/2 MAPK途徑抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能,誘導(dǎo)其凋亡[9]。近來(lái),Song等[10]通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討白花蛇舌草對(duì)前列腺癌的潛在作用機(jī)制,發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草可靶向多種分子抑制前列腺癌,如VEGFA、STAT3和CXCL8等。還有研究發(fā)現(xiàn),白花蛇舌草的多糖可通過(guò)EGFR/Akt/ERK信號(hào)通路抑制肺腺癌A549細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能[11]。然而,白花蛇舌草在鼻咽癌細(xì)胞中的作用尚不清楚。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著白花蛇舌草水提物濃度增加和作用時(shí)間延長(zhǎng),其對(duì)CNE-1細(xì)胞活性的抑制率逐漸增加,表明白花蛇舌草水提物對(duì)CNE-1細(xì)胞活性的抑制作用具有濃度依賴性和時(shí)間依賴性。射線單獨(dú)處理細(xì)胞可抑制細(xì)胞活性,而射線聯(lián)合白花蛇舌草水提物處理細(xì)胞,對(duì)細(xì)胞活性的抑制作用顯著增強(qiáng)。射線和白花蛇舌草單獨(dú)處理細(xì)胞時(shí),均可促進(jìn)細(xì)胞凋亡,聯(lián)合處理顯著增加細(xì)胞凋亡率。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),射線和白花蛇舌草水提物聯(lián)合處理顯著增加LASP1的表達(dá)水平。也有研究表明,白花蛇舌草對(duì)鼻咽癌細(xì)胞株CNE1有顯著的增殖抑制作用,其中以親脂類提取物的作用最為明顯[12]。

LIM和SH3結(jié)構(gòu)域蛋白1(LASP1)是LIM蛋白和肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白家族的成員,是依賴cAMP和cGMP的信號(hào)蛋白,可以在細(xì)胞膜延伸處與肌動(dòng)蛋白骨架結(jié)合。最近的研究表明,LASP1在多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào),如肝癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌和腎癌[13]。LASP1已被證明與鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移與侵襲有[14,15]。本研究結(jié)果顯示,射線和白花蛇舌草水提物聯(lián)合處理可顯著增加LASP1的表達(dá)水平,表明LASP1可能參與白花蛇舌草水提物對(duì)鼻咽癌細(xì)胞放療增敏的作用。

綜上所述,本研究證實(shí)白花蛇舌草對(duì)鼻咽癌細(xì)胞具有放射增敏作用,且LASP1可能參與白花蛇舌草水提物對(duì)鼻咽癌細(xì)胞放療增敏的作用。