聚己內(nèi)酯/聚三亞甲基碳酸酯靜電紡絲支架材料對巨噬細(xì)胞表型極化的影響

秦 燁,李 覃,徐忠偉,張國權(quán),陳 虹,江 濤*

(1武警后勤學(xué)院軍事藥學(xué)教研室,天津 300309;2武警后勤學(xué)院衛(wèi)生勤務(wù)系;*通訊作者,E-mail:jiangtao-wjhq@sina.com)

利用機(jī)體作為生物反應(yīng)器,將生物可降解材料制成的血管假體植入體內(nèi),經(jīng)過材料降解和宿主細(xì)胞的組織重塑獲得新生血管的策略是解決臨床小口徑動脈血管嚴(yán)重緊缺的有效途徑[1]。本研究組在前期工作中,將聚三亞甲基碳酸酯[poly(1,3-trimethylene carbonate),PTMC]與聚己內(nèi)酯[poly(caprolactone),PCL]相結(jié)合,采用靜電紡絲技術(shù)制備出PCL/PTMC復(fù)合支架材料,對其理化性質(zhì)和組織相容性的研究證實,PCL/PTMC復(fù)合支架材料不僅具有良好的力學(xué)性能、易于宿主細(xì)胞長入的纖維多孔性結(jié)構(gòu),而且能在體內(nèi)較快降解,有助于宿主細(xì)胞對支架材料的重塑與改建,可能是一種較為理想的原位組織工程血管支架材料[2,3]。由于以巨噬細(xì)胞為中心的宿主應(yīng)答機(jī)制是原位組織工程研究的一個重要切入點(diǎn)[4],因此,本研究采用體外巨噬細(xì)胞種植實驗和相關(guān)實驗,探討PCL/PTMC復(fù)合靜電紡絲材料對巨噬細(xì)胞表型極化的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

PCL、PTMC材料均購自濟(jì)南岱罡生物工程有限公司;小鼠單核巨噬細(xì)胞系細(xì)胞株(RAW264.7)引自美國模式菌種收集中心(ATCC);胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素、DMEM高糖培養(yǎng)基購自江蘇南京凱基生物公司;TRNzol-A+購自天根生化科技有限公司;Luna通用一步法RT-qPCR試劑盒(E3005S)購自New England Biolabs(NEB)公司;PCR所用引物購自蘇州泓訊科技有限公司;ELISA試劑盒(IL-1β、TNF-α、IL-10)購自武漢六合生物有限公司;Anti-Mouse PE-F4/80、Anti-Mouse FITC-CD11c抗體購自BD Bioscieneces公司;Anti-Mouse FITC-CD206抗體購自Invitrogen公司。

1.2 材料的制備

以二氯甲烷Dichloromethane(DCM),N-二甲基甲酚胺N,N-dimethylformamide(DMF)混合液(3 ∶1,V/V)為溶劑,以PCL(Mn=80 000)、PTMC(Mn=100 000)為溶質(zhì),配制濃度為12%的聚合物溶液,分別為:PCL材料組、3 ∶1 PCL/PTMC材料組(PCL和PTMC質(zhì)量比3 ∶1)、1 ∶1 PCL/PTMC材料組(PCL和PTMC質(zhì)量比1 ∶1)。以上聚合物溶液充分?jǐn)嚢韬蠓謩e裝入帶有20G不銹鋼針頭的5 ml注射器,采用靜電紡絲機(jī)(ss系列,北京永康樂業(yè)科技發(fā)展有限公司),輸出端設(shè)置10 kV,接收端為5 kV,持續(xù)時間60 min,制備膜狀支架材料,真空干燥24 h,去除殘留有機(jī)溶劑和水分,密封包裝,-20 ℃保存待用。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

RAW264.7巨噬細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素混合液),5% CO2,37 ℃常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)。將制備完成的薄膜狀材料分別經(jīng)過75%酒精、PBS(200 mmol/L)浸泡8 h后取對數(shù)生長期RAW264.7細(xì)胞,按1.6×104/cm2密度種植于各材料組表面72 h,收集上述各組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)RT-qPCR實驗;收集材料進(jìn)行SEM檢測,收集培養(yǎng)上清進(jìn)行ELISA檢測。實驗分組如下:空白對照組(正常培養(yǎng))、PCL材料組、3 ∶1 PCL/PTMC材料組、1 ∶1 PCL/PTMC材料組。

1.4 SEM觀察材料形態(tài)

收集未種植材料和體外種植細(xì)胞72 h后的材料進(jìn)行掃描電鏡(scanning electron microscope,SEM)檢測,運(yùn)用“光—色—熱—質(zhì)—元—化”聯(lián)用的檢測技術(shù),置于TESCAN VEGA3鎢燈絲掃描電鏡(LMH/LMU),觀察各組材料的微觀形貌、孔道結(jié)構(gòu)等形態(tài)學(xué)特征。

1.5 流式細(xì)胞分析巨噬細(xì)胞表型

按前述培養(yǎng)細(xì)胞,4組樣品分別設(shè)立空白對照、PE-F4/80單染對照、FITC-CD11c單染對照、FITC-CD206單染對照、PE-F4/80和FITC-CD11c雙染、PE-F4/80和FITC-CD206雙染6組細(xì)胞。將各組膜材料表面細(xì)胞收集于EP管中,PBS清洗,離心后加入100 μl PBS(200 mmol/L)緩沖液。按照分組,以10 μl/ml為終濃度加入熒光染色抗體后冰浴孵育30 min,重懸后在流式細(xì)胞儀(Beckman,CA,USA)上機(jī)檢測,使用CytExpert 2.0軟件分析結(jié)果。

1.6 RT-qPCR檢測IL-10、IL-1β、TNF-α基因表達(dá)

用TRNzol-A+試劑提取各組細(xì)胞RNA,按照Luna通用一步法RT-qPCR試劑盒說明書操作,實時熒光定量PCR儀(CFX Connect,Bio-Rad)上機(jī)檢測,使用CFX Manager3.1軟件進(jìn)行擴(kuò)增結(jié)果分析。PCR引物基因序列見表1。PCR擴(kuò)增條件為:95 ℃逆轉(zhuǎn)錄10 min,95 ℃預(yù)變性1 min,95 ℃變性10 s,60 ℃延伸30 s并循環(huán)45次?；虮磉_(dá)量(處理組/空白對照組)按2-ΔΔCt法計算,其中ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)處理組-(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)空白對照組。以GAPDH作為內(nèi)參照。

表1 PCR引物基因序列

Table 1 Primer gene sequence for PCR

引物名稱上游引物序列 下游引物序列 產(chǎn)物大小(bp)GAPDHIL-1βTNF-αIL-105′-TGGAGAAACCTGCCAAGTATG-3′5′-AACGTGTGGGGGATGAATTG-3′5′-CTCCAGCTGGAAGACTCCTCCCAG-3′5′-GGTTGCCAAGCCTTATCGGA-3′5′-GGGTGGTCCAGGGTTTCTTA-3′5′-TTCCCTCCGCATTGACACAG-3′5′-CCCGACTACGTGCTCCTCACC-3′5′-ACCTGCTCCACTGCCTTGCT-3′280130171191

1.7 ELISA檢測培養(yǎng)上清中IL-10、IL-1β、TNF-α的含量

收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清,按照試劑盒說明操作,雙抗體夾心ELISA法檢測巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-10、IL-1β、TNF-α的含量,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各細(xì)胞因子含量。由于正常培養(yǎng)液中不含細(xì)胞因子,因此培養(yǎng)上清中的細(xì)胞因子含量可側(cè)面表達(dá)巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子的分泌量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 SEM觀察結(jié)果

表面形態(tài)是靜電紡絲材料的重要特征之一。SEM結(jié)果顯示,PCL靜電紡絲支架材料具有纖維多孔性結(jié)構(gòu),纖維直徑粗細(xì)不等,直徑均值為(352±127)nm(見圖1)。PCL/PTMC(3 ∶1)組、PCL/PTMC(1 ∶1)組與PCL組材料表面形態(tài)相似,同樣具有纖維多孔性結(jié)構(gòu),但隨著材料中PTMC含量的增加,纖維直徑及纖維間孔隙逐漸變小,且直徑分布較為均勻,其直徑均值分別為(323±109)nm、(307±78)nm(見圖1)。巨噬細(xì)胞體外種植實驗顯示,經(jīng)過巨噬細(xì)胞體外種植72 h后,RAW264.7細(xì)胞在PCL、PCL/PTMC(3 ∶1)、PCL/PTMC(1 ∶1)3種材料表面均能良好生長,細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)明顯區(qū)別,在PCL支架材料表面生長的RAW264.7細(xì)胞為較規(guī)則的圓形,無核部分均勻鋪展,匯聚成簇,但不發(fā)生融合(見圖1)。而同樣條件培養(yǎng)于PCL/PTMC(3 ∶1)、PCL/PTMC(1 ∶1)表面的RAW264.7細(xì)胞形態(tài)明顯變得細(xì)長,細(xì)胞表面皺褶增多,伸出較多凸起,形成偽足,細(xì)胞與材料支架結(jié)合更為緊密,可觀察到融合的RAW264.7細(xì)胞,即異物巨細(xì)胞(foreign body giant cells,FBGCs)(見圖1);PCL/PTMC(1 ∶1)組較之PCL/PTMC(3 ∶1)組這些特征更為明顯,且細(xì)胞數(shù)量更多,形成細(xì)胞緊密、均勻覆蓋于材料表面的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)(見圖1)。

2.2 巨噬細(xì)胞M1/M2表型變化

F4/80熒光抗體可以標(biāo)記成熟巨噬細(xì)胞表面相關(guān)抗體,M1型巨噬細(xì)胞表面有CD11c抗體、M2巨噬細(xì)胞表面有CD206抗體。Q1象限代表F4/80、CD11c/CD206雙標(biāo)記陽性為M1/M2型巨噬細(xì)胞占區(qū)域內(nèi)細(xì)胞總數(shù)的百分比,Q1與Q2象限之和代表所有成熟巨噬細(xì)胞所占百分比,因此兩者之比就是M1/M2型巨噬細(xì)胞的含量。PCL、PCL/PTMC(3 ∶1)、PCL/PTMC(1 ∶1)3種材料中,M1細(xì)胞含量分別為18.9%±1.5%,19.8%±1.7%和17.2%±2.1%,均小于空白對照組(26.6%±1.9%,P<0.05,n=3,見圖2),3種材料組間無明顯差異;PCL、PCL/PTMC(3 ∶1)、PCL/PTMC(1 ∶1)3種材料的M2細(xì)胞含量分別為36.8%±2.3%,27.8%±1.3%,26.4%±1.7%,均大于空白對照組(18.1%±0.9%),且PCL/PTMC(3 ∶1)、PCL/PTMC(1 ∶1)材料組表面M2細(xì)胞明顯少于PCL組(P<0.05,n=3,見圖3)。

圖1 PCL-PTMC靜電紡絲材料的SEM分析結(jié)果Figure 1 The SEM image of electrospun materials PCL/PTMC

圖2 流式細(xì)胞檢測M1型巨噬細(xì)胞結(jié)果Figure 2 Flow cytometry of M1 macrophage

圖3 流式細(xì)胞檢測M2型巨噬細(xì)胞結(jié)果Figure 3 Flow cytometry of M2 macrophage

2.3 IL-1β、TNF-α、IL-10的基因表達(dá)水平

RT-qPCR結(jié)果顯示,與空白對照組相比,PCL組、PCL/PTMC(3 ∶1)組、PCL/PTMC(1 ∶1)組材料表面生長的RAW264.7細(xì)胞中IL-1β、TNF-α的基因表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01,n=3),IL-10的基因表達(dá)顯著增加(P<0.01,n=3,見圖4),且PCL組高于PCL/PTMC(3 ∶1)組和PCL/PTMC(1 ∶1)組。

與空白對照組相比,**P<0.01圖4 RAW264.7細(xì)胞中IL-1β、TNF-α、IL-10 mRNA表達(dá)水平 (n=3)Figure 4 The mRNA level of IL-1β, TNF-α and IL-10 in RAW264.7 cells in four groups (n=3)

2.4 巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-10、IL-1β、TNF-α含量

ELISA結(jié)果顯示,與空白對照組相比,PCL、PCL/PTMC(3 ∶1)、PCL/PTMC(1 ∶1)各組材料植入巨噬細(xì)胞后細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β、TNF-α的含量明顯減少(P<0.05或P<0.01,n=3),IL-10含量顯著增加(P<0.05或P<0.01,n=3,見圖5),且PCL組高于PCL/PTMC(3 ∶1)組和PCL/PTMC(1 ∶1)組。

與空白對照組相比,*P<0.05,**P<0.01圖5 巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β、TNF-α、IL-10的含量 (n=3)Figure 5 The levels of IL-1β, TNF-α and IL-10 in cell culture supernatants in four groups (n=3)

3 討論

長期以來,巨噬細(xì)胞被認(rèn)為是相對均一的細(xì)胞群體,主要發(fā)揮吞噬及組織修復(fù)等作用,然而,近年的研究指出,巨噬細(xì)胞能夠通過改變自身表型從而參與到組織炎癥、抗炎及修復(fù)過程之中,并不僅僅扮演一個清道夫的角色[5]。巨噬細(xì)胞既能促炎又可以抗炎概念的建立,使其成為生物材料植入研究領(lǐng)域的亮點(diǎn),這些研究的核心目的是如何在生物材料植入中調(diào)節(jié)管理巨噬細(xì)胞,平衡炎癥反應(yīng),允許生物材料的功能性組織重建[6]。

采用靜電紡絲技術(shù)制備的PCL人工血管已經(jīng)得到廣泛研究,但由于其在體內(nèi)降解過于緩慢,往往因為自體細(xì)胞及毛細(xì)血管難以長入支架,或嚴(yán)重的鈣化而不能最終形成不含支架材料的自體血管[7]。PTMC與PCL相似,同屬線性脂肪族聚酯。由于生物材料的化學(xué)組成和物理特性能夠影響巨噬細(xì)胞的表型及功能,產(chǎn)生不同的巨噬細(xì)胞群體,因此,本研究在前期工作的基礎(chǔ)上,以PCL為對照材料,通過巨噬細(xì)胞體外種植實驗,研究PCL/PTMC支架材料對于巨噬細(xì)胞表型及功能,為PCL/PTMC復(fù)合支架材料作為原位組織工程血管支架材料提供可靠的實驗依據(jù)。

本研究中,SEM觀察到,RAW264.7細(xì)胞在PCL、PCL/PTMC(3 ∶1)、PCL/PTMC(1 ∶1)3種材料表面均能良好生長,但細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)明顯區(qū)別,在PCL支架材料表面生長的RAW264.7細(xì)胞為較規(guī)則的圓形,無核部分均勻鋪展,匯聚成簇,但不發(fā)生融合。而同樣條件培養(yǎng)于PCL/PTMC(3 ∶1)、PCL/PTMC(1 ∶1)表面的RAW264.7細(xì)胞形態(tài)明顯變的細(xì)長數(shù)量,細(xì)胞表面皺褶增多,伸出較多凸起,形成偽足,細(xì)胞與材料支架結(jié)合更為緊密,可觀察到融合的RAW264.7細(xì)胞,即異物巨細(xì)胞(FBGCs);PCL/PTMC(1 ∶1)組較之PCL/PTMC(3 ∶1)組這些特征更為明顯,且細(xì)胞數(shù)量更多,細(xì)胞緊密、均勻覆蓋于材料表面。出現(xiàn)上述形態(tài)學(xué)差異的主要原因可能與3種材料的降解性質(zhì)不同有關(guān)。PCL在體內(nèi)的降解經(jīng)歷兩個過程:首先是酯基非酶性的水解分裂,當(dāng)聚合物水解至分子量小于3 000時,PCL片段被巨噬細(xì)胞或成纖維細(xì)胞吞噬[8],最后通過三羧酸循環(huán)在體內(nèi)完全吸收。與PCL體內(nèi)降解過程不同,PTMC不經(jīng)歷非酶性的水解過程,而直接進(jìn)入由M1型巨噬細(xì)胞/異物巨細(xì)胞介導(dǎo)的侵蝕降解過程,因而具有較快的降解速度[9]。SEM實驗結(jié)果提示具有較快降解速度的PCL/PTMC支架材料可能影響巨噬細(xì)胞的行為,其影響行為的能力與PTMC材料在PCL/PTMC中的質(zhì)量比呈正相關(guān),能夠使黏附于表面的巨噬細(xì)胞處于更高的激活狀態(tài)。

單核細(xì)胞遷移至炎癥部位能夠分化成為不同表型和功能的細(xì)胞亞型。Mills等[10]首先提出巨噬細(xì)胞成熟的二元概念,認(rèn)為巨噬細(xì)胞可極化為兩種表型、功能分離的亞型:促炎的M1巨噬細(xì)胞和抗炎促愈合的M2巨噬細(xì)胞。這一概念的提出主要基于巨噬細(xì)胞依賴的輔助性T細(xì)胞1(Th1)或輔助性T細(xì)胞2(Th2)分化為具有不同代謝和功能的細(xì)胞表型。隨著研究的不斷深入,巨噬細(xì)胞極化的簡單二元概念已被逐漸擴(kuò)展。目前,M2巨噬細(xì)胞被進(jìn)一步分為4種或更多亞型,分別稱作M2a,b,c,d及其他[11]。有學(xué)者指出,巨噬細(xì)胞表型的極化是一個連續(xù)的狀態(tài),而此狀態(tài)的兩個極端則被稱為M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞,而巨噬細(xì)胞則可以成為此狀態(tài)內(nèi)的任意一種形態(tài),即M1與M2的表型之間可以互相轉(zhuǎn)變[12,13]。本研究在靜電紡絲材料體外種植巨噬細(xì)胞72 h后收集黏附于材料表的細(xì)胞,重懸之后用F4/80、CD11c雙陽性標(biāo)記M1巨噬細(xì)胞;用F4/80、CD206雙陽性標(biāo)記M2巨噬細(xì)胞,流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示,PCL、PCL/PTMC(3 ∶1)、PCL/PTMC(1 ∶1)三組材料中,M1型巨噬細(xì)胞含量均小于空白對照組,而各組材料間無明顯差異;M2細(xì)胞含量均大于空白對照組,且PCL/PTMC(3 ∶1)、PCL/PTMC(1 ∶1)材料組表面M2細(xì)胞明顯少于PCL材料組。上述結(jié)果提示,PCL、PCL/PTMC(3 ∶1)、PCL/PTMC(1 ∶1)3種支架材料能夠影響RAW264.7的細(xì)胞表型分化,且極化為M1巨噬細(xì)胞表型的數(shù)量較少,而極化為M2巨噬細(xì)胞的數(shù)量較多;PCL/PTMC(3 ∶1)、PCL/PTMC(1 ∶1)材料組表面M2型細(xì)胞明顯少于PCL材料組則提示巨噬細(xì)胞對于PCL/PTMC(3 ∶1)、PCL/PTMC(1 ∶1)材料的降解可能抑制RAW264.7向M2巨噬細(xì)胞表型極化,從而產(chǎn)生更多處于M1和M2中間狀態(tài)的巨噬細(xì)胞表型。

已有研究表明,M1巨噬細(xì)胞具有較強(qiáng)的吞噬作用,能夠分泌大量炎癥急性相細(xì)胞因子,如lL-1β、IL-6、IL-12、IL-23,以及TNF-α等,并增加iNOS表達(dá),促進(jìn)精氨酸向NO和ROS代謝轉(zhuǎn)換,從而促進(jìn)急性炎癥反應(yīng)。M2巨噬細(xì)胞能夠高表達(dá)IL-10、TGF-β(轉(zhuǎn)化生長因子-β)、IL-13、VEGF(血管內(nèi)皮生長因子)等細(xì)胞因子抑制炎癥反應(yīng),同時也具有較強(qiáng)的吞噬作用、產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)成分和血管生成因子,具有促進(jìn)組織修復(fù)、重建、纖維化等多種作用[14]。本研究中,RT-qPCR顯示,黏附于各組材料表面生長的RAW264.7細(xì)胞IL-1β、TNF-α的mRNA的基因表達(dá)量少于空白對照組;而IL-10的mRNA表達(dá)和分泌,高于空白對照組。同時,ELISA實驗的結(jié)果在與RT-qPCR結(jié)果高度相似的基礎(chǔ)上,細(xì)胞因子IL-10的分泌存在差別,PCL組相比于PCL/PTMC3 ∶1組和1 ∶1組分泌IL-10的量更多。由于IL-1β、TNF-α主要由M1型巨噬細(xì)胞合成分泌,IL-10主要由M2型巨噬細(xì)胞合成分泌,可見RT-qPCR和ELISA實驗結(jié)果與流式細(xì)胞檢測結(jié)果相一致,同樣提示PCL、PCL/PTMC(3 ∶1)、PCL/PTMC(1 ∶1)3種靜電紡絲支架材料都能抑制初始狀態(tài)的巨噬細(xì)胞(M0)向M1表型分化,促進(jìn)向M2表型的分化。另外,相比于PCL,PCL/PTMC(3 ∶1)、PCL/PTMC(1 ∶1)材料的降解可能影響RAW264.7向M2巨噬細(xì)胞表型極化,從而產(chǎn)生更多處于M1和M2中間狀態(tài)的巨噬細(xì)胞表型?？山到馍锊牧献鳛檎嘉换蛑Ъ懿牧媳恢踩霗C(jī)體,允許宿主組織在一定空間范圍內(nèi)長入和填充,趨向于被M1巨噬細(xì)胞或異物巨細(xì)胞降解和吞噬。目前多數(shù)研究認(rèn)為,可降解生物材料周圍持續(xù)的M1應(yīng)答反應(yīng)是過度瘢痕形成的原因,促M(fèi)2應(yīng)答策略,主要包括干細(xì)胞治療、化學(xué)組成調(diào)節(jié)、生物材料結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)及表面特性和包被物的調(diào)節(jié)被證實有益于材料被宿主組織所替代[15,16]。需要注意的是,促M(fèi)2應(yīng)答策略造成的材料降解減少和M2細(xì)胞數(shù)量增加同樣具有促纖維化作用,刻意地促進(jìn)可降解材料周圍巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)镸2表型可能并不可取。

綜上所述,PCL-PTMC復(fù)合紡絲材料與PCL相似,能夠改變周圍巨噬細(xì)胞M1/M2的比例,以巨噬細(xì)胞極化為M2型巨噬細(xì)胞為主,且由于降解速率快于PCL,也不至于產(chǎn)生過多M2型巨噬細(xì)胞,有助于減少植入材料纖維化的發(fā)生,可能是一種較為理想的原位組織工程血管支架材料。