阿爾茨海默病認(rèn)知障礙和全基因組甲基化的關(guān)系

劉桂花,李容英,任夢洋,楊曉娟

(山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院老年病科,太原 030001;*通訊作者,E-mail:yxj2011bs@126.com)

世界人口老齡化加劇,癡呆癥已經(jīng)成為日益嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題,其中阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是導(dǎo)致癡呆的主要原因，約占60%-70%[1]。預(yù)計2050年,全球AD患者將近1.3億,嚴(yán)重威脅人類健康,并造成沉重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。表觀遺傳調(diào)控衰老和AD的基因表達(dá)是目前研究熱點[2],尤其對DNA甲基化的研究,可用于分析AD患者遺傳因素和環(huán)境危險因素之間的關(guān)系。本研究選取山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院收治的AD患者為研究對象,觀察AD患者外周血全基因組甲基化水平變化情況。

1 對象和方法

1.1 對象

選擇2015-06～2018-10來自山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院年齡60-85歲的AD患者60例,其中輕度、中度和重度AD組各20例。采用NINCDS—ADRDA標(biāo)準(zhǔn)[3,4],診斷AD,排除嚴(yán)重心肺腦等內(nèi)科疾病患者。對照組選取同時期年齡、性別及教育水平等相匹配的健康體檢老年人60例。本研究對象均簽署知情同意書,由山西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 一般資料收集 收集基本信息,包括:年齡、性別、教育水平及血壓、血糖和血脂水平。

1.2.2 認(rèn)知水平評估 由神經(jīng)內(nèi)科門診認(rèn)知評估師統(tǒng)一完成。采用簡易精神狀態(tài)量表(MMSE)進(jìn)行癡呆的篩查，篩選標(biāo)準(zhǔn)：量表總分文盲≤17分，小學(xué)≤20分，初中及以上≤24分可考慮有癡呆。應(yīng)用臨床癡呆評定量表(CDR)進(jìn)行癡呆嚴(yán)重程度的分級，劃分標(biāo)準(zhǔn)：輕度癡呆CDR=0.5-1；中度癡呆CDR=2；重度癡呆CDR=3。

1.2.3 全基因組甲基化測定 從AD患者外周血中提取DNA,將DNA濃度調(diào)整為200 μg/L。依據(jù)全基因組甲基化檢測試劑盒(購于美國Epigentek集團(tuán)公司)檢測DNA的甲基化水平。首先使用陽性對照樣品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,算出斜率,根據(jù)公式計算全基因組甲基化水平:

其中,X*為人基因組DNA的GC含量為41%。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組基本資料比較

由表1可知,對照組、輕度AD組、中度AD組、重度AD組在年齡、性別、教育年限及高血壓、高脂血癥、糖尿病的患病比例方面差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 AD患者與對照組基本情況比較

Table 1 Comparison of basic conditions between AD patients and controls

分組n年齡(歲)性別[男,例(%)]教育年限(年)高血壓[是,例(%)]高脂血癥[是,例(%)]糖尿病[是,例(%)]對照組6073.37±10.439(65.0)9.45±2.9527(45.0)25(41.7)6(10.0)輕度AD組2072.10±9.8313(65.0)9.85±3.5112(60.0)10(50.0)3(15.0)中度AD組2072.90±9.7214(70.0)8.75±3.2713(65.0) 9(45.0)4(20.0)重度AD組2074.00±8.2313(65.0)9.55±2.7614(70.0)11(55.0)3(15.0) F/χ20.1380.1850.4615.2531.2421.442 P0.9370.9800.7100.1540.7430.696

2.2 兩組MMSE評分及全基因組甲基化率比較

對照組和AD組的全基因組甲基化率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=18.627,P<0.001)。進(jìn)一步兩兩分析結(jié)果顯示:輕度AD組、中度AD組和重度AD組全基因組甲基化率低于對照組,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);中度和重度AD組全基因組甲基化率低于輕度AD組,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);中度AD組和重度AD組之間全基因組甲基化率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。對照組和AD組的MMSE總分值差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=59.738,P<0.001),進(jìn)一步兩兩分析結(jié)果顯示,MMSE總分值組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見表2)。

表2 AD患者與對照組MMSE評分及全基因組甲基化率比較

Table 2 Comparison of MMSE score and whole genome methylation rate between AD patients and normal controls

分組n MMSE總分 全基因組甲基化率(%)最小值最大值x±s 對照組6026.83±2.7911.4341.8822.0±7.1輕度AD組2022.30±3.55a10.3437.1718.2±5.9a中度AD組2015.35±7.21ab5.3426.6613.1±5.7ab重度AD組20 8.35±10.62abc5.9422.8311.7±5.1ab F-59.738 --18.627 P-<0.001--<0.001

與對照組相比,aP<0.05;與輕度AD組相比,bP<0.05;與中度AD組相比,cP<0.05

2.3 全基因組甲基化率與MMSE評分相關(guān)性分析

全基因組甲基化率與MMSE評分相關(guān)性分析結(jié)果顯示,兩者之間存在正相關(guān)關(guān)系,即隨著全基因組甲基化率的升高,MMSE總分值也隨之升高,兩者相關(guān)系數(shù)為0.493(P<0.001,見圖1)。

圖1 60例AD患者全基因甲基化率與MMSE評分散點圖Figure 1 Scatter plot of whole genome methylation rate and MMSE score in sixty AD patients

3 討論

阿爾茨海默病患病率不斷上升,但AD的診斷還存在很多的分歧,能否準(zhǔn)確并及時地診斷是對AD進(jìn)行干預(yù)的前提。Mastroeni等[2]研究證實:在衰老和AD患者中DNA甲基化水平降低。最新研究表明,AD患者在學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的腦域，比如顳葉皮層[5]和海馬[6]呈全基因低甲基化水平、CpG島DNA呈高甲基化水平[7]，但另有研究在AD患者相同腦區(qū)卻觀察到相反的DNA甲基化結(jié)果[8,9]，雖然不同研究觀察到的甲基化水平不同，但無疑這些結(jié)果都顯示出基因甲基化與AD存有密切關(guān)系。但另有研究在AD患者相同腦區(qū)卻觀察到相反的DNA甲基化結(jié)果[8,9],進(jìn)而導(dǎo)致認(rèn)知障礙。需要指出的是:DNA甲基化的檢測具有組織特異性,也就是說腦組織和外周血中的檢測有差別,而在臨床中我們只能觀察外周血的甲基化水平變化情況。但有學(xué)者認(rèn)為AD患者外周血中相應(yīng)基因的表達(dá)水平與腦組織中的表達(dá)具有平行性[10]。外周血全基因組甲基化檢測,操作簡易,類ELISA法,是一種非侵入性的、易于測量的外周生物標(biāo)志物,將在人群診斷篩選中具有重大的實用價值。

在遲發(fā)型AD(LOAD)中,表觀遺傳修飾發(fā)揮作用。在一項系統(tǒng)回顧分析中指出[11]:48項研究中,67%的研究證實了DNA甲基化與認(rèn)知水平呈正相關(guān),并預(yù)測外周血DNA甲基化將會成為判斷癡呆發(fā)生及加劇的生物標(biāo)志物。本次實驗檢測的是AD患者的外周血,采用的是全基因甲基化檢測試劑盒,結(jié)果提示AD患者外周血全基因組甲基化率降低,并隨著AD認(rèn)知水平的減退,全基因組甲基化率持續(xù)下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用Pearson相關(guān)性分析,隨著全基因組甲基化率的降低,MMSE總分值也隨之降低,兩者相關(guān)系數(shù)為0.493(P<0.001)。Chouliaras等[12]發(fā)現(xiàn):在AD患者海馬組織中,DNA甲基化(5mC)和羥甲基化(5hmC)是降低的。Condliffe等[13]進(jìn)一步證實了在AD患者的內(nèi)嗅皮層和小腦內(nèi)5-hmC也是減少的。Bollati等[14]發(fā)現(xiàn),AD外周血中LINE-1基因甲基化與認(rèn)知水平成正相關(guān)。在體外細(xì)胞研究中,Chen等[15]提出:全基因組甲基化減低,可能與AD相關(guān)的特定基因(如APP,BACE1基因等)甲基化降低有關(guān),APP基因、BACE1基因甲基化降低,會加速轉(zhuǎn)錄,β-淀粉樣蛋白增加，導(dǎo)致Aβ腦內(nèi)沉積，另一方面，Aβ增多也能促進(jìn)全基因組甲基化的降低，進(jìn)而形成惡性循環(huán)。這些實驗都支持本次實驗結(jié)果，但Di Francesco等[16]使用熒光甲基化分析法檢測AD患者外周血全基因甲基化水平卻升高。這可能與樣本量少、實驗處理方法不同有關(guān)。

課題組前期動物實驗研究結(jié)果表明:應(yīng)用麥芽酚鋁制備AD大鼠,發(fā)現(xiàn)大鼠海馬組織全基因組甲基化率降低,使用葉酸干預(yù)后,全基因甲基化率有所改善[17]。提示全基因組甲基化降低也是AD重要的可干預(yù)危險因素。葉酸的缺乏和高同型半胱氨酸導(dǎo)致全基因組低甲基化,而在補(bǔ)充葉酸后部分低甲基化能逆轉(zhuǎn)[14]。在AD病情進(jìn)展過程中,我們可以通過干預(yù)提高致病基因的甲基化和降低抑病基因的甲基化水平,即通過控制DNA適度甲基化來起到防治AD的目標(biāo)。

因此,我們在臨床及研究工作中,檢測外周血全基因組甲基化差別可以對AD進(jìn)行預(yù)防、早診斷及治療。但是,我們的研究結(jié)果還需要通過增大樣本量和采用焦磷酸測序儀來進(jìn)一步的驗證。