早期心肌缺血大鼠心肌中BNP的時序性表達(dá)

翟利琴,郭相杰,靳茜茜,劉明哲,郭華林,高彩榮*

(1山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院病理教研室,太原 030001;2山西省人民醫(yī)院病理科;*通訊作者,E-mail:gaocairong5175@163.com)

心源性猝死是法醫(yī)病理學(xué)鑒定中最常見的死亡,然而,部分心源性猝死僅可見冠狀動脈狹窄,無明確心肌缺血的組織學(xué)表現(xiàn),但尸檢排除其他死因,稱為“冠狀動脈性猝死”。冠狀動脈性猝死的診斷一直是法醫(yī)病理學(xué)的難題[1],尤其在死亡前有用藥史時,其與藥物過敏性猝死的鑒別更是難上加難。

腦鈉尿肽(brain natriuretic peptide,BNP)是主要由心室肌細(xì)胞分泌的一種蛋白,在心衰的診斷中有重要價值[2]。早期心肌缺血時BNP表達(dá)是否發(fā)生變化,能否為缺乏傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)指標(biāo)的早期心肌缺血提供輔助性診斷依據(jù)?為了探討上述問題,我們結(jié)合生物信息分析學(xué),觀察大鼠心肌缺血時BNP隨時間的序貫性表達(dá)變化。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

Trizol裂解液(Invitrogen Corporation,美國),Revert Aid RT Reverse Transcription Kit(Thermo Fisher Scientific Corporation,美國),SYBR?Green PCR Master Mix(Thermo Fisher Scientific Corporation,美國),RIPA裂解液(杭州碧云天生物技術(shù)研究所),BCA蛋白濃度測定試劑盒(杭州碧云天生物技術(shù)研究所),兔抗鼠Anti-BNP antibody(ab19645,Abcam Corporation,英國),山羊抗兔IgG-HRP(BA1054,武漢博士德生物試劑公司),BNP ELISA試劑盒(上海西唐生物科技有限公司),BL-420S生物機(jī)能儀(成都泰盟科技有限公司),TC1000-S常規(guī)PCR儀(大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司),7500 FAST real-time PCR儀(Applied Biosystems Corporation,美國),JY300C通用電泳儀(北京君意電泳設(shè)備有限公司),RM2245型病理切片機(jī)(Leica Corporation,德國)。

1.2 實驗動物

清潔級雄性SD大鼠,10-12周齡,體質(zhì)量200-220 g,由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院動物實驗中心提供,動物生產(chǎn)許可證號SCXK(京)2012-0001。

1.3 生物信息學(xué)分析

在GEO(Gene Expression Omnibus)數(shù)據(jù)庫中輸入檢索詞“acute myocardial infarction/ischemia”,檢索得到編號為GSE4648的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)[3],對該數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,觀察BNP在各組表達(dá)水平,然后進(jìn)一步設(shè)計動物實驗進(jìn)行驗證。

1.4 實驗動物分組

SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組(n=6)、過敏性猝死組(n=6)、假手術(shù)組(n=6)及早期心肌缺血組(n=48)。早期心肌缺血組根據(jù)結(jié)扎左冠狀動脈前降支后處死的時間點進(jìn)一步分為0.5 h組、1 h組、2 h組、4 h組、8 h組、12 h組、24 h組和48 h組,每組6只。

1.5 大鼠心肌缺血模型制備

48只SD大鼠常規(guī)消毒、麻醉后經(jīng)口氣管插管。插管成功后,連接小動物呼吸機(jī),調(diào)節(jié)潮氣量3 ml/100 g,呼吸頻率60次/min,呼吸比1 ∶1,四肢連接BL-420S生物機(jī)能儀導(dǎo)聯(lián),記錄心電圖。參照文獻(xiàn)[4]的方法,沿胸骨中線左側(cè)1 cm處縱向剪開皮膚,在第4、5肋間心尖搏動最強(qiáng)處鈍性分離皮下組織及肌層,擠壓兩側(cè)胸壁,擠出心臟。用棉簽輕輕推開左心耳,在肺動脈圓錐與左心耳間距離主動脈根部3-4 mm處、沿左冠狀靜脈走行,用7-0號縫線結(jié)扎左冠狀動脈前降支,進(jìn)針深度約1.5 mm、寬度約2 mm,打結(jié),縫合,關(guān)閉胸腔,復(fù)張肺組織,拔出氣管內(nèi)插管。根據(jù)文獻(xiàn)[5]報道,出現(xiàn)以下條件之一者判斷為大鼠心肌缺血造模成功:①心電圖ST段向上偏移≥0.1 mV;②T波高聳超過同導(dǎo)聯(lián)R波高度的1/2。同時肉眼觀察大鼠左心室前壁結(jié)扎點下方心肌顏色由粉紅變?yōu)樯n白。

術(shù)后常規(guī)飼料及飲水,結(jié)扎冠狀動脈后0.5,1,2,4,8,12,24,48 h脫臼處死大鼠,開胸取出心臟,生理鹽水沖洗,取冠狀動脈結(jié)扎點平面以下左心室前壁缺血區(qū)心肌,部分心肌液氮凍存,部分心肌10%中性甲醛固定、保存。

假手術(shù)組縫合線只穿過心肌組織,而不結(jié)扎冠狀動脈,脫臼處死大鼠,開胸取出心臟,生理鹽水沖洗,取左心室前壁心肌組織,部分心肌液氮凍存,部分心肌10%中性甲醛固定、保存。

1.6 大鼠過敏性猝死模型制備

參照文獻(xiàn)[6]制備大鼠過敏性猝死模型。實驗第1天6只SD大鼠腹腔內(nèi)注射5%雞卵清蛋白0.8 ml和4%氫氧化鋁佐劑0.5 ml致敏。實驗第18天經(jīng)大鼠尾靜脈注射10%雞卵清蛋白2 ml,誘發(fā)過敏性休克,取左心室前壁心肌組織,部分心肌液氮凍存,部分心肌10%中性甲醛固定、保存。

1.7 實時熒光定量PCR檢測

提取心肌組織總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,設(shè)計并合成引物,根據(jù)說明書配置反應(yīng)體系,反應(yīng)條件如下:95 ℃預(yù)變性5 min,然后95 ℃變性10 s,60 ℃退火、延伸30 s,共40個循環(huán)。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后,反應(yīng)體系溫度按照每5 s升高1 ℃繼續(xù)從60 ℃緩慢升高到95 ℃,采集PCR產(chǎn)物的熔解曲線。BNP及內(nèi)參引物序列見表1。

表1 BNP引物序列

Table 1 Primer sequence of BNP

基因名稱引物序列 產(chǎn)物長度beta-actinF:5′-TGTTACCAACTGGGACGACA-3′104 bpR:5′-CTGGGTCATCTTTTCACGGT-3′BNPF:5′-TGTTTCTGCTTTTCCTTTATCTGTC-3′136 bpR:5′-CTCCGACTTTTCTCTTATCAGCTC-3′

1.8 Western印跡分析

取50 mg心肌組織,采用裂解法提取總蛋白,SDS-PAGE凝膠電泳,然后轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上,室溫封閉2 h,用TBST緩沖液漂洗3次。加入兔抗鼠Anti-BNP單克隆一抗1 ∶500稀釋液5 ml,4 ℃下?lián)u床孵育過夜,TBST漂洗3次。加入山羊抗兔IgG-HRP二抗1 ∶500稀釋液5 ml,室溫下?lián)u床孵育2 h,HRP-ECL發(fā)光法成像,并保存圖像。以GADPH為內(nèi)參,BNP蛋白條帶光密度與內(nèi)參蛋白條帶光密度比值作為BNP蛋白表達(dá)水平的參數(shù)。

1.9 大鼠心肌組織免疫組織化學(xué)染色

大鼠心肌組織經(jīng)10%中性甲醛固定24 h后沿水平面切取心肌組織,石蠟包埋,常規(guī)3 μm厚度切片,HE染色,光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)變化。同時,切取2 μm厚度切片,采用EnVision二步法進(jìn)行抗BNP蛋白單克隆抗體免疫組化染色。分別對每張免疫組化染色切片進(jìn)行評分,評分標(biāo)準(zhǔn)如下:先分別計數(shù)陽性細(xì)胞百分比(A)及陽性著色程度(B)。陽性細(xì)胞百分比:無陽性細(xì)胞為0,陽性細(xì)胞比例1%-10%為1,陽性細(xì)胞比例11%-50%為2,陽性細(xì)胞比例51%-80%為3,陽性細(xì)胞比例81%-100%為4。陽性著色程度:陰性著色為0,弱陽性為1,中度陽性為2,強(qiáng)陽性為3。再以A×B作為綜合評分,評分范圍為0-12分,其中0-1分為陰性著色(-),2-3分為弱陽性著色(+),4-6分為陽性著色(++),7-9分為中度陽性著色(+++),10-12分為強(qiáng)陽性著色(++++)。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 GEO數(shù)據(jù)庫生物信息學(xué)分析結(jié)果

在GEO數(shù)據(jù)庫中查詢到標(biāo)題為“Earliest Changes in the Left Ventricular Transcriptome Post-Myocardial Infarction”的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù),該數(shù)據(jù)編號為GSE4648,采用結(jié)扎大鼠左冠狀動脈前降支的方法造成大鼠急性心肌梗死模型,分別于造模成功后15 min,60 min,4 h,12 h,24 h,48 h取左心室前壁缺血區(qū)心肌、缺血區(qū)周圍及室間隔心肌組織,每個時間點包含2個樣本。另設(shè)立假手術(shù)組,分別于術(shù)后15 min,60 min,4 h,12 h,24 h,48 h取左心室前壁及室間隔心肌組織,每個時間點包含2個樣本。正常對照組含6只未作任何處理的大鼠,取左心室前壁及室間隔心肌。心肌缺血組在缺血4 h時,BNP熒光信號強(qiáng)度上升,之后隨缺血時間延長,信號持續(xù)上升,在缺血24 h信號強(qiáng)度達(dá)到峰值,缺血48 h信號減弱(見圖1)。

2.2 大鼠心肌缺血模型觀察

早期心肌缺血組48只SD大鼠在結(jié)扎成功后短時間內(nèi)即出現(xiàn)ST段向上偏移,或T波高聳、尖銳,部分大鼠T波與R波融合(見圖2)。假手術(shù)組6只SD大鼠均未出現(xiàn)上述改變。結(jié)扎左冠狀動脈過程中,急性心肌缺血組13只、假手術(shù)組2只大鼠在手術(shù)線穿過心肌組織后數(shù)秒內(nèi)出現(xiàn)一過性Q波變化,表現(xiàn)為Q波增寬加深,但這種變化出現(xiàn)短暫,持續(xù)數(shù)秒后恢復(fù)正常。

圖1 BNP基因在不同分組、不同時間點熒光信號強(qiáng)度比較Figure 1 Fluorescence signal intensity of BNP in different groups at different time point after myocardial ischemia

圖2 早期心肌缺血組SD大鼠左冠狀動脈前降支結(jié)扎后心電圖Figure 2 The electrocardiogram of SD rats in EMI group after the left anterior descending coronary artery was ligated

2.3 大鼠過敏性猝死模型觀察

過敏性猝死組6只SD大鼠在接受抗原攻擊后3-7 min內(nèi)陸續(xù)出現(xiàn)躁動、豎毛、搔抓、口唇紫紺,12-15 min開始出現(xiàn)呼吸困難、鼻翼扇動、站立不穩(wěn)等過敏性休克癥狀,30 min內(nèi)死亡。

2.4 實時熒光定量PCR結(jié)果

與對照組相比,大鼠過敏性猝死組、假手術(shù)組左心室前壁心肌及缺血0.5 h組、1 h組缺血區(qū)心肌BNP mRNA水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與對照組相比,缺血2 h組BNP mRNA水平升高(P<0.05);缺血4 h組、缺血8 h組BNP mRNA水平都較前更進(jìn)一步升高(P<0.01);缺血12 h組BNP mRNA水平與缺血8 h組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);BNP mRNA表達(dá)水平在缺血24 h時達(dá)到峰值(P<0.01);缺血48 h組BNP mRNA表達(dá)較缺血24 h組下降(P<0.05),但仍高于對照組及缺血1 h組、2 h組和4 h組(P<0.01,見表2)。以上結(jié)果表明,缺血區(qū)心肌BNP mRNA表達(dá)水平呈現(xiàn)緩慢上升,平臺維持,然后緩慢下降的趨勢。

表2 各組左心室前壁心肌組織BNP mRNA相對表達(dá)量的比較

Table 2 The relative level of BNP mRNA in left ventricular anterior wall myocardium in different groups

組別BNP mRNA(x±s)對照組1.00±0.11過敏性猝死組1.06±0.14假手術(shù)組1.12±0.18缺血0.5 h組1.21±0.26缺血1 h組1.33±0.31缺血2 h組1.55±0.27?缺血4 h組1.87±0.28??缺血8 h組2.52±0.42??缺血12 h組2.76±0.43??缺血24 h組3.28±0.45??缺血48 h組2.93±0.32??#

與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01;與缺血24 h組比較,#P<0.05

2.5 Western印跡結(jié)果

Western blot顯示,過敏性猝死組、假手術(shù)組BNP蛋白表達(dá)與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,見表3)。早期心肌缺血組BNP蛋白表達(dá)呈緩慢上升趨勢,具體表現(xiàn)為:缺血0.5 h組、1 h組和2 h組BNP蛋白表達(dá)與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);缺血4 h組,BNP蛋白表達(dá)增高,高于對照組、缺血0.5 h組、1 h組和2 h組(P<0.05);缺血8 h組,BNP蛋白表達(dá)進(jìn)一步增高,高于缺血0.5 h組、1 h組、2 h組和4 h組(P<0.01);BNP蛋白表達(dá)最大值出現(xiàn)在缺血12 h組和24 h組(P<0.01);缺血48 h組BNP蛋白表達(dá)下降,與缺血12 h組、24 h組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),但仍明顯高于缺血0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h組(P<0.01,見表3)。

表3 實驗各組左心室前壁心肌組織BNP蛋白相對表達(dá)量

Table 3 The relative level of BNP protein in left ventricular anterior wall myocardium in different groups

組別BNP蛋白(x±s)對照組0.109±0.019過敏性猝死組0.105±0.028假手術(shù)組0.112±0.015缺血0.5 h組0.116±0.018缺血1 h組0.123±0.024缺血2 h組0.145±0.020缺血4 h組0.247±0.071?缺血8 h組0.406±0.113??缺血12 h組0.668±0.166??缺血24 h組0.775±0.112??缺血48 h組0.558±0.087??#

與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01;與缺血12 h和24 h組比較,#P<0.05

1.對照組;2.過敏性猝死組;3.假手術(shù)組;4.缺血0.5 h組;5.缺血1 h組;6.缺血2 h組;7.缺血4 h組;8.缺血8 h組;9.缺血12 h組;10.缺血24 h組;11.缺血48 h組圖3 Western blot檢測BNP蛋白在實驗各組左心室前壁心肌組織中的表達(dá)Figure 3 BNP protein expression in left ventricular anterior wall myocardium in different groups by Western blot

2.6 免疫組化染色結(jié)果

對照組、過敏性猝死組及假手術(shù)組BNP左心室前壁心肌免疫組化染色均為陰性。心肌缺血組缺血0.5,1,2 h時BNP免疫組化染色陰性,缺血區(qū)心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)無或僅有極少量棕黃色顆粒(見圖4),染色評分與對照組相比染色差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,見圖5);缺血4,8,12 h缺血區(qū)少部分心肌細(xì)胞BNP免疫組化染色胞漿內(nèi)出現(xiàn)淡棕黃色顆粒(見圖4),染色評分高于對照組(P<0.01,見圖5);缺血24 h缺血區(qū)大部分心肌細(xì)胞BNP免疫組化染色胞漿內(nèi)出現(xiàn)強(qiáng)棕黃色顆粒(見圖4),染色評分高于對照組(P<0.01,見圖5);缺血48 h組,BNP免疫組化染色陽性減弱,但仍有部分心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)淡黃色顆粒(見圖4),染色評分低于缺血12 h和24 h(P<0.01,見圖5),但高于對照組(P<0.01,見圖5)。

A.對照組;B.心肌缺血0.5 h組;C.心肌缺血4 h組;D.心肌缺血12 h組;E.心肌缺血24 h組;F.心肌缺血24 h組圖4 SD大鼠左心室前壁心肌BNP免疫組化染色 (×200)Figure 4 The immunohistochemical staining of BNP in left ventricular anterior wall myocardium (×200)

與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01;與缺血24 h組比較,##P<0.01圖5 實驗各組左心室前壁心肌組織BNP免疫組化染色評分Figure 5 The score of BNP immunohistochemical staining in left ventricular anterior wall myocardium in different groups

3 討論

冠狀動脈性猝死是心臟性猝死的一種,多發(fā)生在冠狀動脈粥樣硬化的基礎(chǔ)上,由于冠狀動脈粥樣硬化并發(fā)血栓形成、斑塊內(nèi)出血等導(dǎo)致冠狀動脈嚴(yán)重狹窄引起急性心肌缺血或相對供血不足,局部心肌電生理紊亂,最終引起心室纖顫等嚴(yán)重心律失常而死亡?？砂l(fā)生于某種誘因如勞累、情緒激動、飲酒和體力活動后。其發(fā)生屬于早期心肌缺血,病理學(xué)上缺乏缺血的組織形態(tài)學(xué)改變,所以是法醫(yī)病理學(xué)診斷的難點,尤其與過敏性猝死的鑒別更是難上加難,探尋形態(tài)學(xué)之外的客觀診斷依據(jù)是法醫(yī)病理學(xué)新的研究方向。

BNP于1988年首次從豬腦組織中提取得來[7]。后來逐漸證實人心室肌細(xì)胞是其主要來源,是心室在應(yīng)對張力增大時分泌的一種心源性激素,在臨床醫(yī)學(xué)中具有重要價值,檢測血BNP濃度可以幫助診斷充血性心力衰竭[8]。除了在心衰的診斷中有決定性作用外,逐漸有研究發(fā)現(xiàn)BNP在急性心梗時也存在表達(dá)變化[9]。作為主要由心室肌細(xì)胞分泌的蛋白,高通量研究發(fā)現(xiàn)BNP在早期心肌缺血中也有表達(dá)變化[3],但是并沒有進(jìn)一步通過其他實驗手段進(jìn)行驗證。本研究主要觀察、驗證早期心肌缺血時BNP mRNA及蛋白表達(dá)是否存在變化,能否為冠狀動脈性猝死與過敏性猝死的鑒別提供依據(jù)。

結(jié)果顯示,大鼠左心室前壁心肌在缺血2 h時,缺血區(qū)心肌BNP mRNA表達(dá)開始升高,此后一段時間內(nèi)隨缺血時間延長,BNP mRNA表達(dá)量逐漸上升,并于缺血24 h時達(dá)到峰值,缺血48 h時缺血區(qū)心肌BNP mRNA表達(dá)量下降,但仍高于對照組。Western印跡法證實缺血4 h時BNP蛋白表達(dá)增高,之后隨缺血時間延長,表達(dá)持續(xù)升高,并于缺血12 h、24 h時達(dá)到峰值,48 h時光密度值出現(xiàn)下降。免疫組化染色顯示,缺血4 h時缺血區(qū)少量心肌細(xì)胞出現(xiàn)陽性,之后陽性逐漸增強(qiáng),缺血24 h時出現(xiàn)強(qiáng)陽性,缺血48 h時陽性減弱,但仍有部分心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)淡黃色顆粒。以上結(jié)果證實急性心肌缺血時,心肌組織BNP mRNA及蛋白表達(dá)增高,呈現(xiàn)序貫性變化趨勢,隨缺血時間延長表達(dá)逐漸上升,達(dá)到峰值后平臺維持一段時間,之后緩慢下降。與充血性心衰時心室壁張力變化刺激心室肌細(xì)胞分泌BNP不同,有研究[10]表明心肌缺血能夠直接促進(jìn)心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、合成BNP蛋白。對體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞進(jìn)行的一項缺血研究[11]發(fā)現(xiàn),缺血缺氧刺激能夠上調(diào)心肌細(xì)胞內(nèi)TGF-β1/Smad2信號通路,通過增加炎癥性細(xì)胞因子IL-6的表達(dá)來上調(diào)BNP蛋白的轉(zhuǎn)錄與合成。這可能是心肌缺血導(dǎo)致心室肌細(xì)胞分泌BNP的機(jī)制。本實驗觀察到大鼠心肌缺血48 h時,缺血區(qū)心肌BNP mRNA及蛋白表達(dá)下降,分析可能是由于當(dāng)心肌缺血48 h時,心肌細(xì)胞已經(jīng)出現(xiàn)壞死,結(jié)構(gòu)已經(jīng)破壞、功能已經(jīng)喪失,因此BNP表達(dá)水平開始下降。在法醫(yī)學(xué)實踐中,當(dāng)出現(xiàn)明顯心肌缺血的組織學(xué)改變時,可以不依賴分子改變,而通過光鏡下觀察形態(tài)作出心肌缺血的診斷。

本實驗觀察到過敏性猝死大鼠左心室前壁心肌BNP mRNA及蛋白表達(dá)無變化,這可能是由于過敏性猝死不存在引起心肌缺血的機(jī)制。

本實驗證實在心肌缺血早期,心肌組織BNP mRNA及蛋白表達(dá)增高,而過敏性猝死并不存在這一現(xiàn)象。檢測心肌BNP mRNA及蛋白表達(dá)有助于鑒別冠狀動脈性猝死與過敏性猝死。理論層面,BNP mRNA增高的時間點更早,對早期心肌缺血更為敏感。但是在法醫(yī)學(xué)實踐中,考慮到尸體保存條件及死后降解等因素的影響,檢測蛋白mRNA并不是最佳方法,還有必要尋找更敏感、更穩(wěn)定的指標(biāo)。