FOXP3通過下調(diào)NCKAP1的表達(dá)抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移

韓 俊,張 存,胡艷立,李曉菊,高 源,朱遼遼,徐 盈,張英起*

(1空軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系生物制藥學(xué)教研室,西安 710032;2海軍陸戰(zhàn)隊(duì)醫(yī)院檢驗(yàn)科;*通訊作者,E-mail:zhangyqh@fmmu.edu.cn)

叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子3(FOXP3)是重要的X-連鎖乳腺癌抑癌基因,主要通過調(diào)節(jié)一系列腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)揮其抑癌功能。FOXP3的缺失、突變以及亞細(xì)胞定位的改變是乳腺癌發(fā)生發(fā)展的重要原因之一[1]。研究顯示,相比于野生型小鼠,FOXP3突變的雌性小鼠自發(fā)性和誘導(dǎo)性乳腺癌發(fā)生率均顯著升高,并伴有HER2的高表達(dá)[2];FOXP3可以抑制原癌基因SKP2的轉(zhuǎn)錄進(jìn)而阻滯乳腺癌細(xì)胞分裂[3];FOXP3可以負(fù)向調(diào)控NF-κB信號(hào)通路,促進(jìn)細(xì)胞凋亡[4];FOXP3可以下調(diào)CD44的表達(dá)從而抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移[5];FOXP3能夠抑制VEGF的表達(dá)水平從而抑制乳腺癌血管生成[6]。為了更全面了解乳腺癌中FOXP3的抑癌功能,本研究旨在發(fā)掘新的FOXP3下游分子,并探索其在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞系和主要試劑

人乳腺癌細(xì)胞系T47D、MCF7,人胚腎細(xì)胞293(HEK293)為本實(shí)驗(yàn)室保存。DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)基、RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco公司。Lipofectamine 3000 Reagent購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司。ChIP試劑盒購(gòu)于美國(guó)Millipore公司。報(bào)告基因試劑盒購(gòu)于美國(guó)Promega公司。Matrigel購(gòu)于美國(guó)CORNING公司。Transwell小室購(gòu)于美國(guó)Millipore公司。劃痕實(shí)驗(yàn)所用膠塞購(gòu)于Platypus。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序由廣州基迪奧公司完成。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 T47D細(xì)胞、MCF7細(xì)胞過表達(dá)FOXP3 將T47D或MCF7細(xì)胞接種于6孔板(每孔4×105個(gè)細(xì)胞),37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜;每孔加入2 ml細(xì)胞培養(yǎng)基;實(shí)驗(yàn)分為過表達(dá)組和陰性對(duì)照組,分別轉(zhuǎn)染FOXP3過表達(dá)質(zhì)粒和空載體質(zhì)粒;將2.5 μg質(zhì)粒、5 μl轉(zhuǎn)染試劑P3000加入125 μl OPTIMEM培養(yǎng)基中混勻;吸取7.5 μl轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000 Reagent至125 μl OPTIMEM培養(yǎng)基中,輕輕混勻,將上述兩管液體室溫輕輕混勻并孵育15 min后為轉(zhuǎn)染復(fù)合物;在6孔板中的各孔加入250 μl轉(zhuǎn)染復(fù)合物,放入細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng),6 h后換正常培養(yǎng)基。

1.2.2 沉默T47D細(xì)胞、MCF7細(xì)胞內(nèi)FOXP3和NCKAP1的表達(dá) 將T47D或MCF7細(xì)胞接種于6孔板(每孔4×105個(gè)細(xì)胞),37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜;每孔加入2 ml細(xì)胞培養(yǎng)基;實(shí)驗(yàn)分為siRNA組和陰性對(duì)照組,分別轉(zhuǎn)染目的基因siRNA和陰性對(duì)照siRNA(見表1);將7.5 μmol siRNA加入125 μl OPTIMEM培養(yǎng)基中混勻;吸取7.5 μl轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000 Reagent至125 μl OPTIMEM培養(yǎng)基中,輕輕混勻,將上述兩管液體室溫輕輕混勻并孵育15 min后為轉(zhuǎn)染復(fù)合物;在6孔板中的各孔加入250 μl轉(zhuǎn)染復(fù)合物,放入細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng),6 h后換正常培養(yǎng)基。

表1 本實(shí)驗(yàn)涉及的siRNA序列

Table 1 The siRNA sequences involved in this experiment

基因 sense(5′-3′) antisense(5′-3′)FOXP3GCAGCGGACACUCAAUGAGTTCUCUUUGUGUGUCCGCUGCTTNCKAP1GCAGACGACUUUAUAGAUATTUAUCUAUAAAGUCGUCUGCTT陰性對(duì)照UUCUCCGAACGUGUCACGUTTACGUGACACGUUCGGAGAATT

1.2.3 高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 在MCF7細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染FOXP3過表達(dá)質(zhì)粒或空載體質(zhì)粒,將細(xì)胞樣本送至廣州基迪奧生物科技有限公司進(jìn)行真核有參轉(zhuǎn)錄組測(cè)序并進(jìn)行基因差異表達(dá)研究。

1.2.4 染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞固定及超聲破碎:直徑10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入37%的甲醛(甲醛終濃度為1%),輕輕混勻,37 ℃孵育10 min,用以固定其中乳腺癌T47D細(xì)胞;加濃度為0.125 mol/L的甘氨酸至平皿,混勻,室溫靜置5 min;棄去培養(yǎng)基,用預(yù)冷的PBS小心清洗細(xì)胞2次;用細(xì)胞刮將細(xì)胞刀收集于15 ml離心管中,4 ℃,1 000 r/min離心5 min;棄去上清,根據(jù)細(xì)胞量(每1×106個(gè)細(xì)胞加100 μl)加入含蛋白酶抑制復(fù)合物的SDS Lysis Buffer;按照如下條件進(jìn)行超聲破碎:25%功率,4.5 s沖擊,9 s間隙,共15次,始終保持樣品在冰水混合物內(nèi);超聲結(jié)束后,4 ℃,10 000 r/min離心10 min,去除不溶物質(zhì)。

沉淀免疫復(fù)合物:取300 μl超聲裂解產(chǎn)物,等分100 μl并編號(hào)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ,Ⅰ為實(shí)驗(yàn)組,Ⅱ?yàn)閷?duì)照組,Ⅲ用于質(zhì)檢,加終濃度為0.2 mol/L的NaCl,65 ℃解交聯(lián)2.5-3 h,瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)超聲破碎效果,超聲裂解產(chǎn)物中加900 μl ChIP Dilution Buffer;每管加入60 μl Protein A,4 ℃旋轉(zhuǎn)孵育1 h;4 ℃離心1 min收上清,吸取20 μl作為input;實(shí)驗(yàn)組加入anti-FOXP3抗體,對(duì)照組加同型IgG抗體,4 ℃旋轉(zhuǎn)孵育12 h;每管加入60 μl Protein A,4 ℃旋轉(zhuǎn)孵育2 h,之后再靜置10 min沉淀,4 ℃,700 r/min離心1 min,除去上清;每管加250 μl洗脫buffer,充分混勻15 min,靜置離心,收上清。

DNA樣品的回收及定量分析:每管加1 μl RNA酶,37 ℃孵育1 h;每管加10 μl的0.5 mol/L EDTA,20 μl的1 mol/L Tris-HCL,2 μl 10 mg/ml蛋白酶K,45 ℃處理2 h;將液體轉(zhuǎn)移至DNA分離柱,收集DNA片段;隨后將提取出來(lái)的DNA片段進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè),驗(yàn)證相對(duì)于陰性對(duì)照IgG抗體,FOXP3與NCKAP1啟動(dòng)子是否更具親和力。

1.2.5 報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 將NCKAP1啟動(dòng)子和FOXP3質(zhì)粒及內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK共同轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,分別為對(duì)照組(報(bào)告基因質(zhì)粒200 ng,pcDNA3.1質(zhì)粒200 ng,pRL-TK內(nèi)參質(zhì)粒10 ng)、FOXP3-100 ng組(報(bào)告基因質(zhì)粒200 ng,pcDNA3.1-FOXP3質(zhì)粒100 ng,pcDNA3.1質(zhì)粒100 ng,pRL-TK內(nèi)參質(zhì)粒10 ng)和FOXP3-200 ng組(報(bào)告基因質(zhì)粒200 ng,pcDNA3.1-FOXP3質(zhì)粒200 ng,pRL-TK內(nèi)參質(zhì)粒10 ng);每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,保證每組轉(zhuǎn)染的質(zhì)?？偭烤鶠?10 ng;轉(zhuǎn)染48 h,吸去培養(yǎng)液,PBS洗滌3次,每次5 min;加入一定量的細(xì)胞裂解液室溫裂解15 min;收取細(xì)胞裂解液,4 ℃,13 000 r/min離心1 min,收上清去除細(xì)胞殘?jiān)?將上清收集到新的離心管中;吸取5 μl細(xì)胞裂解上清加入到10 μl Luciferase Assay BufferⅡ(LARⅡ)中,快速混勻,放入到熒光照度儀中檢測(cè);完畢后,快速加入10 μl Stop & Glo Reagent,快速混勻,在熒光照度儀中進(jìn)行第二次檢測(cè);按如下公式計(jì)算:相對(duì)熒光強(qiáng)度=第一熒光讀值(螢火蟲)/第二熒光讀值(海腎)。相對(duì)熒光強(qiáng)度越高,證明啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性越強(qiáng)。

1.2.6 Transwell實(shí)驗(yàn) 用培養(yǎng)液稀釋基質(zhì)膠,稀釋比為1∶8,并按照每個(gè)Transwell小室100 μl的量將稀釋好的基質(zhì)膠均勻鋪于Transwell小室上層,并置于37 ℃培養(yǎng)箱2 h;隨后按照每個(gè)Transwell小室5×104個(gè)細(xì)胞的量,分別將單獨(dú)沉默F(xiàn)OXP3的T47D細(xì)胞、同時(shí)沉默F(xiàn)OXP3和NCKAP1的T47D細(xì)胞和陰性對(duì)照T47D細(xì)胞的單細(xì)胞懸液接種在基質(zhì)膠上層(用于重懸細(xì)胞的培養(yǎng)液為無(wú)血清、無(wú)雙抗);再往下室(24孔板)加入含10%血清的正常培養(yǎng)基,常規(guī)培養(yǎng)48 h;之后取出Transwell小室,經(jīng)95%乙醇固定5 min、0.1%結(jié)晶紫染色15 min,并適當(dāng)清洗Transwell小室;隨后顯微鏡下取5個(gè)隨機(jī)視野,統(tǒng)計(jì)穿過小室的細(xì)胞數(shù)。穿過小室的細(xì)胞數(shù)越多,細(xì)胞的侵襲能力越強(qiáng)。

1.2.7 劃痕實(shí)驗(yàn) 事先將膠塞置于96孔板內(nèi),分別接種3×104個(gè)單獨(dú)沉默F(xiàn)OXP3的T47D細(xì)胞、同時(shí)沉默F(xiàn)OXP3和NCKAP1的T47D細(xì)胞和陰性對(duì)照T47D細(xì)胞,待細(xì)胞融合率達(dá)70%-80%時(shí),依據(jù)實(shí)驗(yàn)步驟垂直拔掉膠塞。用無(wú)菌PBS輕輕沖洗細(xì)胞3次。加入無(wú)血清培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng),分別在0 h和48 h時(shí)拍照,最終計(jì)算細(xì)胞的遷移面積。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 NCKAP1可能是FOXP3的下游分子

高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示,與陰性對(duì)照組相比,MCF7細(xì)胞過表達(dá)FOXP3后,NCKAP1的表達(dá)水平明顯降低(見圖1)。由于NCKAP1與乳腺癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān),結(jié)合測(cè)序結(jié)果,提示FOXP3可能通過調(diào)控NCKAP1的表達(dá)水平從而抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移。

2.2 FOXP3下調(diào)NCKAP1的表達(dá)水平

實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示,與轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA的細(xì)胞相比,T47D細(xì)胞和MCF7細(xì)胞沉默F(xiàn)OXP3的表達(dá)后,NCKAP1的mRNA水平升高(P<0.001或P<0.01,見圖2)。與轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒的細(xì)胞相比,T47D細(xì)胞和MCF7細(xì)胞過表達(dá)FOXP3后,NCKAP1的mRNA水平明顯降低(P<0.05,見圖2)。以上結(jié)果表明,FOXP3能夠下調(diào)NCKAP1的表達(dá)。

圖1 NCKAP1是FOXP3的下游分子Figure 1 NCKAP1 might be one of the downstream molecules of FOXP3

2.3 FOXP3通過與NCKAP1的啟動(dòng)子結(jié)合降低其轉(zhuǎn)錄活性

Jaspar數(shù)據(jù)庫(kù)顯示,NCKAP1的啟動(dòng)子區(qū)域存在6個(gè)FOXP3的潛在結(jié)合位點(diǎn)(見圖3A)。ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與陰性對(duì)照IgG相比,FOXP3與NCKAP1的啟動(dòng)子具有較強(qiáng)的結(jié)合能力(P<0.01,見圖3A),證實(shí)FOXP3與NCKAP1的啟動(dòng)子結(jié)合。報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示,與轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒相比,轉(zhuǎn)染FOXP3過表達(dá)質(zhì)?？山档蚇CKAP1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性(P<0.001,見圖3B),證實(shí)FOXP3對(duì)NCKAP1啟動(dòng)子具有轉(zhuǎn)錄抑制作用;與轉(zhuǎn)染100 ng FOXP3過表達(dá)質(zhì)粒相比,轉(zhuǎn)染200 ng FOXP3過表達(dá)質(zhì)?？蛇M(jìn)一步降低NCKAP1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性(P<0.05,見圖3B),證實(shí)FOXP3對(duì)NCKAP1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄抑制作用具有劑量依賴性。以上結(jié)果表明,作為轉(zhuǎn)錄因子,FOXP3可以通過與NCKAP1的啟動(dòng)子結(jié)合從而降低其轉(zhuǎn)錄活性,抑制NCKAP1表達(dá)。

與對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001圖2 FOXP3下調(diào)NCKAP1的表達(dá)水平Figure 2 FOXP3 down-regulates the expression of NCKAP1

2.4 FOXP3通過下調(diào)NCKAP1來(lái)抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移侵襲

劃痕和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,相比于陰性對(duì)照組,沉默F(xiàn)OXP3的T47D細(xì)胞劃痕遷移面積顯著增加(P<0.01,見圖4A),遷移能力增強(qiáng);沉默F(xiàn)OXP3的T47D細(xì)胞穿過小室的數(shù)目顯著增加(P<0.001,見圖4B),侵襲能力增強(qiáng)。以上結(jié)果證明FOXP3抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移。相比于沉默F(xiàn)OXP3的T47D細(xì)胞,同時(shí)沉默F(xiàn)OXP3和NCKAP1的T47D細(xì)胞劃痕遷移面積顯著減小(P<0.001,見圖4A),遷移能力降低;同時(shí)沉默F(xiàn)OXP3和NCKAP1的T47D細(xì)胞穿過小室的數(shù)目顯著減小(P<0.001,見圖4B),侵襲能力降低。以上結(jié)果表明FOXP3通過下調(diào)NCKAP1的表達(dá)抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移。

圖3 FOXP3通過與NCKAP1的啟動(dòng)子結(jié)合降低其轉(zhuǎn)錄活性Figure 3 FOXP3 reduces the transcriptional activity of NCKAP1 promoter by binding to it

與對(duì)照組比較,**P<0.01,***P<0.001;與si-FOXP3組比較,###P<0.001圖4 FOXP3通過下調(diào)NCKAP1來(lái)抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移侵襲Figure 4 FOXP3 inhibits migration and invasion of breast cancer cells by down-regulating NCKAP1

2.5 NCKAP1的表達(dá)與乳腺癌患者預(yù)后的相關(guān)性分析

我們?cè)贕EPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中統(tǒng)計(jì)了257例高表達(dá)NCKAP1和257例低表達(dá)NCKAP1的乳腺癌病人的生存期。結(jié)果顯示,相較于NCKAP1表達(dá)水平低的乳腺癌患者,高表達(dá)NCKAP1的乳腺癌患者生存期顯著縮短(P=0.027,見圖5),證實(shí)NCKAP1的高表達(dá)和乳腺癌的不良預(yù)后密切相關(guān)。

2.6 乳腺癌患者FOXP3與NCKAP1的表達(dá)相關(guān)性分析

我們分析了TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中1 222例乳腺癌病人的FOXP3和NCKAP1表達(dá)水平,證實(shí)乳腺癌中FOXP3和NCKAP1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P<0.001,見圖6)。在GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)乳腺癌病例進(jìn)行分析,結(jié)果也驗(yàn)證了乳腺癌病人的FOXP3和NCKAP1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P<0.01,見圖6)。通過臨床數(shù)據(jù),我們證明了FOXP3對(duì)NCKAP1的表達(dá)抑制作用。

圖5 高表達(dá)NCKAP1的乳腺癌患者預(yù)后差Figure 5 Breast cancer patients with high NCKAP1 expression had poor prognosis

圖6 乳腺癌組織內(nèi)FOXP3與NCKAP1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)Figure 6 FOXP3 is negatively correlated with NCKAP1 in breast cancer tissues

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,近年來(lái)在我國(guó)的發(fā)病率一直呈上升趨勢(shì)[7]。乳腺癌的發(fā)生發(fā)展涉及一系列病理性過程,包括早期的導(dǎo)管過度增生,后續(xù)原位癌的形成,以及后期的原位侵襲和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移[8]。約有10%左右的乳腺癌患者在確診時(shí)就已發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移。大量研究數(shù)據(jù)表明,轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者死亡的最主要原因[9]。因此,深入研究乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制是非常必要的。

正常人體細(xì)胞的增殖和凋亡均受到嚴(yán)格的調(diào)控,當(dāng)受到內(nèi)因或外因的影響后,細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程發(fā)生改變,從而打破生理平衡,使得細(xì)胞無(wú)限增殖,形成腫瘤。作為X-連鎖抑癌基因,FOXP3表達(dá)異常導(dǎo)致一系列癌基因和抑癌基因的表達(dá)紊亂從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。為了更全面地了解FOXP3抑制乳腺癌的功能,本研究旨在發(fā)掘新的FOXP3下游分子并探索其在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

通過分析高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)FOXP3可以下調(diào)NCKAP1的表達(dá)。NCKAP1是NCK相關(guān)蛋白基因,是酪氨酸激酶結(jié)合蛋白家族中的一員,通過與CYFIP1相互作用參與形成WASP家族富含脯氨酸的同源蛋白復(fù)合體(Wiskott-Aldrich syndrome proteins verprolin homologous proteins,WAVE),從而參與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架通路[10],調(diào)控細(xì)胞遷移[11-13]。WAVE家族成員NCKAP1的表達(dá)水平在乳腺癌中顯著上調(diào)[14],并與乳腺癌細(xì)胞的形成、侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[15-17]。通過病例數(shù)據(jù)分析,我們發(fā)現(xiàn)NCKAP1的表達(dá)水平與乳腺癌病人的預(yù)后呈負(fù)相關(guān),與之前文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相一致[18]。包含NCKAP1分子的WAVE復(fù)合體可作為治療靶位用于抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移[16,19]。乳腺癌細(xì)胞過表達(dá)FOXP3后,NCKAP1的表達(dá)水平降低,WAVE復(fù)合體的穩(wěn)定性受到影響,導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力明顯下降。本研究通過細(xì)胞行為學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了FOXP3通過調(diào)控NCKAP1的表達(dá)抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移,進(jìn)一步的病例數(shù)據(jù)分析也發(fā)現(xiàn)乳腺癌病人體內(nèi)FOXP3與NCKAP1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。

作為轉(zhuǎn)錄因子,FOXP3常通過與基因的調(diào)控序列直接結(jié)合從而發(fā)揮對(duì)基因的調(diào)控作用。FOXP3對(duì)HER2、CD44的下調(diào)作用就是通過直接結(jié)合HER2、CD44基因的啟動(dòng)子并抑制啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性而實(shí)現(xiàn)的[2,5]。FOXP3還能夠與去乙?；?/4(HDAC2/4)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合P21基因內(nèi)含子1上的特定序列,通過抑制HDAC1/4與該位點(diǎn)的結(jié)合來(lái)增加該位點(diǎn)組蛋白H3的乙?；?促進(jìn)p21的表達(dá),從而使細(xì)胞周期停滯,抑制細(xì)胞增殖[20]。FOXP3對(duì)SATB1的沉默不僅通過直接結(jié)合SATB1基因啟動(dòng)子進(jìn)行作用,也可以通過與miR-7和miR-155的調(diào)控序列結(jié)合促進(jìn)miR-7和miR-155的表達(dá)進(jìn)行作用[21]?；谝陨衔墨I(xiàn)的提示,我們從FOXP3直接調(diào)控基因表達(dá)的角度,探索FOXP3作為轉(zhuǎn)錄因子是否與NCKAP1基因的調(diào)控序列結(jié)合并進(jìn)行表達(dá)調(diào)控作用。生物信息學(xué)分析顯示,NCKAP1基因的啟動(dòng)子上存在FOXP3潛在的結(jié)合位點(diǎn),于是我們通過ChIP和報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證明了FOXP3直接與NCKAP1的啟動(dòng)子結(jié)合并抑制其轉(zhuǎn)錄活性,從而調(diào)控NCKAP1的表達(dá)。

基于以上研究,我們發(fā)現(xiàn),作為乳腺癌的抑癌基因,FOXP3可以通過下調(diào)NCKAP1的表達(dá)來(lái)抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移,提高乳腺癌患者的預(yù)后。本研究為FOXP3抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移提供了新的機(jī)制,也為乳腺癌提供了新的治療靶位。FOXP3還可能通過其他途徑發(fā)揮抑制乳腺癌發(fā)生發(fā)展的作用,但這些未知的機(jī)制仍待發(fā)現(xiàn)與深入研究。