右美托咪定對(duì)機(jī)械拉伸A549細(xì)胞IL-8和PAI-1表達(dá)及細(xì)胞凋亡率的影響

孫 麗,岳 帥,任俊明,郭永清*

(1山西醫(yī)科大學(xué)麻醉教研室,太原 030001;2山西醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院麻醉科;*通訊作者,E-mail:gyq106968@aliyun.com)

機(jī)械通氣已被廣泛應(yīng)用于急性肺損傷的治療,可以提供一定水平的通氣量以改善肺泡通氣,改善氧合。然而,機(jī)械通氣作為一種牽張刺激,長(zhǎng)時(shí)間機(jī)械通氣可將牽張損傷轉(zhuǎn)變?yōu)樯飩?促進(jìn)炎性細(xì)胞因子表達(dá)增多,即機(jī)械通氣所致肺損傷(ventilator-induced lung injury,VILI)[1,2]。臨床研究表明,鹽酸右美托咪定(dexmedetomidine)是一種α2-腎上腺素受體激動(dòng)劑,具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗焦慮的作用,不良反應(yīng)較少,對(duì)重要器官有保護(hù)作用,是一種臨床常用的麻醉輔助藥物[3,4]。

體外培養(yǎng)A549細(xì)胞并連接細(xì)胞應(yīng)力加載裝置進(jìn)行機(jī)械拉伸可模擬機(jī)械通氣所導(dǎo)致肺損傷發(fā)病過(guò)程[5]。據(jù)研究顯示,右美托咪定對(duì)牽拉刺激所導(dǎo)致肺損傷有保護(hù)作用[6],可以降低由于機(jī)械因素引起大量炎性因子的釋放和彌漫性的肺損傷[7,8]。本實(shí)驗(yàn)擬培養(yǎng)A549細(xì)胞株,并連接Flexercell-4000TM細(xì)胞柔性基底加載系統(tǒng),建立體外周期性機(jī)械拉伸所致A549細(xì)胞損傷的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?探討不同濃度右美托咪定對(duì)A549細(xì)胞凋亡率變化和PAI-1、IL-8表達(dá)的影響,在細(xì)胞水平探討右美托咪定對(duì)A549細(xì)胞的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

A549細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院上海庫(kù)),鹽酸右美托咪定(2 ml ∶200 μg江蘇恒瑞制藥有限公司),胎牛血清(Gibco,美國(guó)),二甲基亞砜(北京金泰宏達(dá),中國(guó)),0.25%胰蛋白酶消化液(北京索萊寶,中國(guó)),ELISA試劑盒(上海西唐,中國(guó)),MTT(Sigma美國(guó)),Annexin Ⅴ凋亡檢測(cè)試劑盒(生工生物,上海),BioFlex 6孔培養(yǎng)板(BioFlex公司,美國(guó)),二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Scientific,美國(guó)),Flexercell-4000TM細(xì)胞柔性基底加載裝置(Flexercell International,美國(guó)),BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson,美國(guó))等。

1.2 細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng)

采用A549細(xì)胞株(中國(guó)科學(xué)院上海庫(kù)供),以約0.5×105/m2的密度接種于含10%小牛血清的BioFlex 6孔完全培養(yǎng)基上(BioFlex公司,美國(guó)),置于37 ℃、濕化5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),每天更換培養(yǎng)液,接種48 h后棄去培養(yǎng)皿中培養(yǎng)液,加入胰蛋白酶進(jìn)行消化,制備細(xì)胞懸液。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

①隨機(jī)將A549細(xì)胞隨機(jī)分為非機(jī)械拉伸組和機(jī)械拉伸組,每組分為4個(gè)亞組:0 h組、4 h組、12 h組和24 h組。機(jī)械拉伸組與Flexercell-4000TM拉伸裝置連接,非機(jī)械拉伸組不與拉伸裝置連接。

②隨機(jī)將A549細(xì)胞分為預(yù)處理對(duì)照組和預(yù)處理拉伸組，每組分為4個(gè)亞組，機(jī)械拉伸前20 min滴加不同濃度右美托咪定(0，0.01，0.1，1 μmol/L)預(yù)處理并持續(xù)作用24 h。預(yù)處理拉伸組與體外細(xì)胞應(yīng)力加載裝置連接，預(yù)處理對(duì)照組不與拉伸裝置連接。

1.4 A549細(xì)胞機(jī)械拉伸損傷模型

將機(jī)械拉伸組A549細(xì)胞接種于BioFlex 6孔培養(yǎng)板,置于Flexercell-4000TM細(xì)胞牽張拉伸應(yīng)力加載裝置(Flexercell International公司)進(jìn)行拉伸,A549細(xì)胞應(yīng)力加載裝置設(shè)定為拉伸幅度20%,頻率0.3 Hz,波形為正弦波。非機(jī)械拉伸組A549細(xì)胞同樣接種于BioFlex 6孔培養(yǎng)板上并同機(jī)械拉伸組細(xì)胞培養(yǎng)方式相同,但不與拉伸裝置相連。下續(xù)實(shí)驗(yàn)將A549細(xì)胞接種于Bioflex 6孔培養(yǎng)板上,實(shí)驗(yàn)組與體外細(xì)胞應(yīng)力加載裝置連接,對(duì)照組A549細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)方式相同,但不與拉伸裝置連接。將A549細(xì)胞接種于Bioflex 6孔培養(yǎng)板上，預(yù)處理拉伸組與體外細(xì)胞應(yīng)力加載裝置連接，預(yù)處理對(duì)照組A549細(xì)胞與預(yù)處理拉伸組培養(yǎng)方式相同，但不與拉伸裝置連接。

1.5 MTT法測(cè)定A549細(xì)胞存活率

將A549細(xì)胞進(jìn)行消化,反復(fù)吹吸后接種于96孔培養(yǎng)板,每孔加入MTT試劑100 μl,繼續(xù)培養(yǎng),每孔加入DMSO中止反應(yīng)并振蕩10 min,檢測(cè)各組A549細(xì)胞在波長(zhǎng)為570 nm處的吸光度值。

1.6 Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)A549細(xì)胞凋亡率

A549細(xì)胞拉伸完畢后,隨即每孔加入不含EDTA的0.3%胰蛋白酶0.5 ml,消化10-15 min,PBS洗滌2次,收集細(xì)胞,用Binding Buffer緩沖細(xì)胞致0.5×105/m2的密度后,加入5 μl Annexin Ⅴ-F ITC,10 μl PI染液混勻,避光孵育20 min,應(yīng)用流式細(xì)胞儀(山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.7 PAI-1和IL-8表達(dá)的測(cè)定

拉伸完畢后收集A549細(xì)胞上清液，取出相對(duì)應(yīng)的條板并加入標(biāo)準(zhǔn)品和被測(cè)樣品，按照說(shuō)明對(duì)PAI-1和IL-8進(jìn)行檢測(cè)，在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的OD值，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，測(cè)定OD值為縱坐標(biāo)，利用EXCEL在雙對(duì)數(shù)坐標(biāo)上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)被測(cè)樣品的OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示;多組間比較采用單因素方差分析和LSD檢驗(yàn),配伍組間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),以α=0.05,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 機(jī)械拉伸時(shí)間對(duì)A549細(xì)胞存活率的影響

將A549細(xì)胞接種于Bioflex培養(yǎng)板20%機(jī)械拉伸4,12,24 h,機(jī)械拉伸組與各自的非機(jī)械拉伸組相比,A549細(xì)胞存活率表達(dá)水平均下調(diào)(P<0.05),且隨著時(shí)間延長(zhǎng)而機(jī)械拉伸和非機(jī)械拉伸組存活率逐漸降低(P<0.05,見(jiàn)表1)。

表1 不同組間細(xì)胞存活率的比較

Table 1 Comparison of cell viability expression between different groups

組別0 h4 h12 h24 h非機(jī)械拉伸組87.89±0.2073.89±0.56b66.32±2.67b45.89±1.33b機(jī)械拉伸組 87.89±0.2055.89±0.75ab40.99±0.07ab23.89±3.46ab

與非機(jī)械拉伸組相比,aP<0.05;與0 h組相比,bP<0.05

2.2 不同機(jī)械拉伸時(shí)間對(duì)A549細(xì)胞中PAI-1和IL-8表達(dá)水平的影響

應(yīng)用ELISA檢測(cè)細(xì)胞IL-8結(jié)果顯示,與非機(jī)械拉伸組相比,4,12,24 h機(jī)械拉伸組IL-8表達(dá)水平明顯上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),且隨拉伸時(shí)間的延長(zhǎng),非機(jī)械拉伸組和機(jī)械拉伸組炎性因子IL-8表達(dá)水平逐漸升高(P<0.05,見(jiàn)表2)。

表2 不同組間IL-8表達(dá)水平的比較

Table 2 Comparison of IL-8 expression between different groups

組別0 h4 h12 h24 h非機(jī)械拉伸組3.79±0.237.83±0.29b9.23±0.25b12.75±1.09b機(jī)械拉伸組 3.79±0.2336.76±0.23ab91.88±0.98ab151.67±2.51ab

與非機(jī)械拉伸組相比,aP<0.05;與0 h組相比,bP<0.05

應(yīng)用ELISA檢測(cè)細(xì)胞PAI-1結(jié)果顯示,機(jī)械拉伸4 h和12 h,機(jī)械拉伸組與非機(jī)械拉伸組相比,PAI-1表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但機(jī)械拉伸24 h組PAI-1表達(dá)上升近一倍(P<0.05)。隨著拉伸時(shí)間延長(zhǎng),非機(jī)械拉伸組PAI-1表達(dá)上調(diào)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),但機(jī)械拉伸組24 h時(shí)PAI-1表達(dá)水平顯著升高(P<0.05,見(jiàn)表3)。

表3 不同組間PAI-1表達(dá)水平的比較

Table 3 Comparison of PAI-1 expression between different groups

組別0 h4 h12 h24 h非機(jī)械拉伸組0.51±0.360.52±0.360.52±0.020.52±0.02機(jī)械拉伸組 0.51±0.360.54±0.260.79±0.030.98±0.49ab

與非機(jī)械拉伸組相比,aP<0.05;與0 h組相比,bP<0.05

2.3 不同濃度右美托咪定預(yù)處理對(duì)24 h機(jī)械拉伸A549細(xì)胞凋亡率的影響

采用Annexin-V/PI檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,預(yù)處理對(duì)照組采用0，0.01，0.1，1 μmol/L右美托咪定處理后A549細(xì)胞凋亡率分別為(12.99±0.27)%，(4.78±0.81)%，(2.71±0.66)%和(2.09±1.36)%；預(yù)處理拉伸組0，0.01，0.1，1 μmol/L右美托咪定處理后細(xì)胞凋亡率依次為(23.67±1.52)%，(15.72±0.06)%，(13.11±1.41)%和(3.68±0.75)%。預(yù)處理對(duì)照組和預(yù)處理拉伸組內(nèi)與0 μmol/L比較，0.01，0.1，1 μmol/L右美托咪定處理后A549細(xì)胞凋亡率明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。預(yù)處理拉伸各濃度組細(xì)胞凋亡率較各自預(yù)處理對(duì)照組升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，且隨右美托咪定濃度的增加細(xì)胞凋亡率逐漸減少，呈現(xiàn)劑量依賴性，以1 μmol/L為著(見(jiàn)圖1)。

圖1 不同濃度右美托咪定對(duì)細(xì)胞凋亡的影響Figure 1 Effect of different concentrations of dexmedetomidine on cells apoptosis in two groups

2.4 不同濃度右美托咪定預(yù)處理對(duì)24 h機(jī)械拉伸A549細(xì)胞PAI-1和IL-8表達(dá)水平的影響

ELISA法測(cè)定結(jié)果顯示,預(yù)處理拉伸組內(nèi)與0 μmol/L比較，0.01，0.1，1 μmol/L預(yù)處理后PAI-1和IL-8的表達(dá)均明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；隨著右美托咪定濃度增加，PAI-1、IL-8的表達(dá)逐漸下調(diào)，呈現(xiàn)劑量依賴性，以1 μmol/L最顯著。預(yù)處理對(duì)照組不同劑量右美托咪定預(yù)處理后PAI-1表達(dá)有明顯下調(diào)(P<0.05)，但I(xiàn)L-8表達(dá)變化不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。預(yù)處理拉伸各濃度組A549細(xì)胞PAI-1和IL-8表達(dá)均高于各自預(yù)處理對(duì)照組(P<0.05見(jiàn)圖2)。

與預(yù)處理對(duì)照組相比，#P<0.05;與0 μmol/L組相比，*P<0.05圖2 不同濃度右美托咪定組間PAI-1和IL-8表達(dá)水平的比較Figure 2 Comparison of PAI-1 and IL-8 expression between different concentrations of dexmedetomidine groups

3 討論

目前機(jī)械通氣可誘發(fā)機(jī)械牽張肺損傷,促進(jìn)各種炎性細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)表達(dá)增多,并釋放細(xì)胞因子和炎性介質(zhì),誘發(fā)炎性反應(yīng)的級(jí)聯(lián)瀑布效應(yīng),通過(guò)直接或間接的途徑造成機(jī)械通氣肺損傷(ventilator-induced lung injury)[9,10]。不恰當(dāng)機(jī)械力不僅可造成氣壓傷和肺不張,還可以引起各類酶原激活,細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)的大量釋放,甚至導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[11,12]。大量基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)表明右美托咪定通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡,抑制交感神經(jīng)活性和炎癥反應(yīng)多種途徑發(fā)揮對(duì)腦、心臟、肺等發(fā)揮保護(hù)作用[13]。本實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞水平通過(guò)對(duì)細(xì)胞凋亡和PAI-1、IL-8測(cè)定,檢測(cè)右美托咪定對(duì)機(jī)械拉伸肺損傷的保護(hù)作用。

本研究以A549細(xì)胞為研究對(duì)象,應(yīng)用Flexercell-4000TTM細(xì)胞牽拉應(yīng)力加載裝置建立離體細(xì)胞周期性機(jī)械拉伸肺損傷模型[14]。結(jié)果顯示,與非機(jī)械拉伸組相比,機(jī)械拉伸組A549細(xì)胞存活率顯著下調(diào),隨著拉伸時(shí)間延長(zhǎng),細(xì)胞存活率逐漸下降,PAI-1和IL-8表達(dá)隨機(jī)械拉伸時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸上調(diào),以機(jī)械拉伸24 h組上調(diào)最明顯,提示機(jī)械拉伸誘發(fā)A549細(xì)胞損傷,且隨著拉伸時(shí)間延長(zhǎng),存活率和炎性因子表達(dá)變化逐漸顯著。用右美托咪定預(yù)處理后,再以同樣條件對(duì)A549細(xì)胞施以機(jī)械拉伸,可下調(diào)A549細(xì)胞凋亡率、PAI-1和IL-8表達(dá),隨著右美托咪定濃度增加,A549細(xì)胞凋亡率逐漸減低,PAI-1和IL-8表達(dá)上調(diào)逐漸減低,以1 μmol/L組表達(dá)水平為著。本實(shí)驗(yàn)證明,右美托咪定可減輕機(jī)械拉伸誘導(dǎo)下細(xì)胞凋亡和炎性因子PAI-1和IL-8的募集和表達(dá),抑制炎癥反應(yīng)啟動(dòng),減輕機(jī)械拉伸肺上皮細(xì)胞損傷,從而對(duì)A549細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上,本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了A549細(xì)胞體外周期性機(jī)械拉伸損傷模型,從細(xì)胞力學(xué)層面研究機(jī)械拉伸誘發(fā)肺上皮細(xì)胞損傷過(guò)程,探討右美托咪定對(duì)人肺Ⅱ型上皮細(xì)胞的保護(hù)作用,觀察不同濃度的右美托咪定對(duì)機(jī)械拉伸時(shí)A549細(xì)胞中細(xì)胞凋亡率和PAI-1、IL-8表達(dá)的影響。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示右美托咪定對(duì)抑制機(jī)械拉伸所致肺損傷有重要作用,能部分阻斷肺部和全身的炎癥反應(yīng)從而減輕肺損傷,對(duì)肺臟起到一定保護(hù)作用,但與右美托咪定的應(yīng)用劑量相關(guān)。然而,其分子機(jī)制目前尚未完全明確,有待進(jìn)一步研究。