缺氧誘導(dǎo)下骨肉瘤細(xì)胞中腎上腺髓質(zhì)素的表達(dá)

戴 星,楊康平,尹戰(zhàn)海,馬 巍,楊益民,張黨鋒,周曉玲,姚 璐,2*

(1西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科,西安 710061;2西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系;*通訊作者,E-mail:lyao1117@xjtu.edu.cn)

腎上腺髓質(zhì)素(adrenomedullin,ADM)作為一種內(nèi)源性血管活性肽,最早從人嗜鉻性細(xì)胞瘤中發(fā)現(xiàn)并分離出來[1],屬于降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene related peptide,CGRP)家族成員[2],在人體中分布廣泛,幾乎各個(gè)組織器官中都可以找到它的身影[3]。ADM的生理作用表現(xiàn)為強(qiáng)大的血管擴(kuò)張作用,靜注ADM可引起全身血管阻力下降且呈劑量依賴性,這種降壓作用在ADM處于生理濃度時(shí)就表現(xiàn)出來[4]。但在病理狀態(tài)下,實(shí)體腫瘤由于生長迅速使得腫瘤組織內(nèi)部氧分壓極低,腫瘤組織的缺氧狀態(tài)是否激活A(yù)DM的過度分泌,而ADM如何促進(jìn)腫瘤微血管的增生,從而帶來更多的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)改善腫瘤微循環(huán),目前尚不明確。本研究中,我們將通過缺氧誘導(dǎo)條件下培養(yǎng)MG-63骨肉瘤細(xì)胞,觀察在缺氧條件下骨肉瘤細(xì)胞中ADM表達(dá)情況,并同時(shí)檢測血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達(dá),分析兩者之間的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及試劑

MG-63骨肉瘤細(xì)胞系,由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室凍存,復(fù)蘇后使用。1640培養(yǎng)基、胎牛血清、DMSO和Trizol購自Gibco公司(美國)。0.25%胰酶,RIPA裂解液,購自碧云天生物科技研究所。PrimeScript?RT reagent Kit購自TaKaRa公司(日本)。ADM抗體、VEGF抗體和GAPDH抗體,購自Abcam公司(英國)。

1.2 MG-63細(xì)胞培養(yǎng)及缺氧誘導(dǎo)

MG63細(xì)胞使用DMEM高糖培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清,1%青鏈霉素),放置在37 ℃,5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%-80%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取處于對數(shù)生長期的MG-63細(xì)胞,光鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)正常后,將其消化并傳代,待其鋪滿整個(gè)瓶底面積50%-60%時(shí),分為4組:正常培養(yǎng)組、6 h缺氧誘導(dǎo)組、12 h缺氧誘導(dǎo)組和24 h缺氧誘導(dǎo)組。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)瓶,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。即當(dāng)實(shí)驗(yàn)開始時(shí),把正常培養(yǎng)組置于普通培養(yǎng)箱中,同時(shí)把24 h缺氧誘導(dǎo)組細(xì)胞置于缺氧培養(yǎng)箱(Electrotk公司,英國),12 h后再將12 h缺氧誘導(dǎo)組細(xì)胞置于缺氧培養(yǎng)箱,18 h后在將6 h缺氧誘導(dǎo)組細(xì)胞置于缺氧培養(yǎng)箱,缺氧培養(yǎng)箱條件設(shè)定為:5% CO2,94% N2和1% O2。待實(shí)驗(yàn)開始24 h后統(tǒng)一取出各組細(xì)胞,預(yù)冷PBS緩沖液洗滌3次后裂解細(xì)胞,提取細(xì)胞總RNA和總蛋白待進(jìn)一步檢測。

1.3 real-time PCR法檢測MG-63細(xì)胞中ADM和VEGF mRNA表達(dá)

1.3.1 Tri-Zol法提取細(xì)胞總RNA 取各處理組細(xì)胞,預(yù)冷PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次后,按每10 cm2面積加1 ml Trizol試劑的比例,加入Trizol裂解細(xì)胞,反復(fù)吹吸震蕩多次。Trizol與氯仿按5 ∶1比例加入氯仿,劇烈振蕩15 s后于室溫放置3 min。4 ℃,12 000 r/min離心15 min,混合物分為兩相;將上層透明溶液移至新離心管中,上層液加入等量異丙醇后于室溫放置10 min;4 ℃,12 000 r/min離心15 min。管側(cè)和管底可見膠狀沉淀形成。棄去上清,加入1 ml 75%乙醇,劇烈渦旋震蕩混勻。4 ℃,75 000 r/min離心5 min,棄去上清,室溫下晾干沉淀;50-100 μl RNA溶解液溶解沉淀。紫外分光光度儀測定RNA濃度,樣品于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物設(shè)計(jì)和real-time PCR 使用PrimeScript?RT reagent Kit(TaKaRa,日本)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,建立如下的反應(yīng)體系:5×buffer 2 μl,RT Enzyme Mix 0.5 μl,Random 6 mers(100 μmol/L) 0.5 μl,Oligo dT Primer(50 μmol/L) 0.5 μl,Total RNA 2 μl,最后加入Rnase Free dH2O至總體積為10 μl。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下:37 ℃,15 min(反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)),共3次,85 ℃,5 s。然后將得到的RT反應(yīng)液加入到下一步的real time PCR反應(yīng)體系。

依次加入下列試劑,建立如下的反應(yīng)體系:SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ 10 μl,PCR Forward Primer(10 μmol/L)0.8 μl,PCR Reverse Primer(10 μmol/L)0.8 μl,ROX Reference Dye or Dye Ⅱ(50×)0.4 μl,RT反應(yīng)液2 μl,最后加入Rnase Free dH2O至總體積為20 μl。按如下引物序列進(jìn)行擴(kuò)增(見表1)。

表1 引物序列

Table 1 Primer sequences

基因上游引物 下游引物 擴(kuò)增片段(bp)ADM5′-TGCCCAGACCCTTATTCGG-3′5′-AGTTGTTCATGCTCTGGCGG-3′115VEGF5′-GCACCCATGGCAGAAGG-3′5′-GGGGTACCCCTCACCGCCTCGGCTTGTC-3′105GAPDH5′-CAAATTCCATGGCACCGTC-3′5′-CCCATCTGATTTTGGAGGGA-3′101

按兩步法實(shí)施PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序。預(yù)變性反應(yīng)條件:95 ℃,30 s,重復(fù)1個(gè)循環(huán);PCR反應(yīng)條件:95 ℃,3 s;80 ℃,30 s,重復(fù)40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完成后電腦上直接讀取Ct值,按照2-ΔΔCt法計(jì)算并相對定量。計(jì)算公式為:ΔΔCt=(Ct目的基因-CtGAPDH)實(shí)驗(yàn)組-(Ct目的基因-CtGAPDH)對照組。每實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔并設(shè)置陰性對照,實(shí)驗(yàn)在相同條件下重復(fù)3次。

1.4 Western blotting檢測ADM和VEGF蛋白表達(dá)

預(yù)冷PBS緩沖液洗滌細(xì)胞后,每瓶細(xì)胞加入400 μl RIPA混合裂解液,冰上放置10 min后,使用細(xì)胞刮收集細(xì)胞裂解物。4 ℃,14 000 r/min離心20 min,提取細(xì)胞中的總蛋白。取10 μl蛋白用于BCA法的蛋白含量測定。將標(biāo)準(zhǔn)品0,1,2,4,8,12,16,20 μl分別加入至96孔板,每管中另加入200 μl BCA工作液。用酶標(biāo)儀檢測A562的OD值,根據(jù)得到的OD值編制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算樣本的蛋白濃度。

將已定量的蛋白樣品5份加1份6×loading buffer充分混合,使100 ℃加熱5 min,讓蛋白變性。制備聚丙烯酰胺凝膠用于SDS-PAGE電泳,上樣量為50 μg待測蛋白溶液體積,設(shè)置電泳條件:時(shí)間1.5-2 h,電壓90-120 V,至溴酚蘭跑出即可終止電泳。采用濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,完畢后放置5%脫脂牛奶中,搖床孵育1 h。

將ADM兔抗人單克隆抗體及VEGF兔抗人單克隆抗體用TBST配制的5%脫脂牛奶稀釋至1 ∶1 000,同時(shí)將兔抗人β-actin單克隆單抗用TBST稀釋至1 ∶2 500后分別與含有目的條帶的PVDF膜4 ℃孵育過夜。同法稀釋制備鼠抗兔二抗(1 ∶5 000)室溫孵育2 h。將化學(xué)發(fā)光試劑盒中的A、B兩種試劑等體積混合與二抗孵育TBST洗滌后的膜充分接觸。采用凝膠圖像處理系統(tǒng)采集并分析條帶的光密度值以明確目的蛋白的表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 缺氧誘導(dǎo)對ADM和VEGF mRNA表達(dá)的影響

提取各處理組MG-63細(xì)胞總RNA,real-time PCR檢測其ADM和VEGF mRNA的表達(dá)情況如下:反應(yīng)的擴(kuò)增曲線提示曲線拐點(diǎn)清楚,指數(shù)期明顯,擴(kuò)增曲線整體平行性好,基線平無上揚(yáng)現(xiàn)象(見圖1);曲線與曲線間平行性非常好,說明各反應(yīng)管擴(kuò)增效率相近。反應(yīng)的溶解曲線顯示無異常峰的存在,擴(kuò)增產(chǎn)物單一,無引物二聚體等其他非目的性產(chǎn)物(見圖2)。正常培養(yǎng)組和不同的缺氧誘導(dǎo)組的MG-63細(xì)胞均有ADM和VEGF mRNA的表達(dá)(見表2)。將正常培養(yǎng)組的ADM和VEGF mRNA表達(dá)量設(shè)置為“1”。與正常培養(yǎng)組相比,缺氧6 h組的ADM mRNA表達(dá)已有明顯增加。缺氧誘導(dǎo)時(shí)間延長至24 h時(shí),ADM mRNA表達(dá)最強(qiáng)。ADM mRNA的表達(dá)強(qiáng)度與作用時(shí)間呈非線性的正相關(guān)關(guān)系,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與ADM的表達(dá)類似,在缺氧的刺激下MG-63細(xì)胞的VEGF mRNA表達(dá)增強(qiáng),并隨著缺氧時(shí)間延長而進(jìn)一步加強(qiáng),在24 h時(shí)間點(diǎn)達(dá)到正常組表達(dá)量的2.46倍,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 Real time PCR反應(yīng)檢測ADM和VEGF mRNA的擴(kuò)增曲線Figure 1 Amplification curve of ADM and VEGF mRNA detected by real time PCR

圖2 Real time PCR反應(yīng)檢測ADM和VEGF mRNA的溶解曲線Figure 2 Dissolution curve of ADM and VEGF mRNA detected by real time PCR

表2 RT-PCR檢測缺氧下MG-63細(xì)胞ADM和VEGF mRNA相對表達(dá)量

Table 2 Relative expression of ADM and VEGF mRNA in MG-63 cells by RT-PCR

組別ADM mRNA相對值VEGF mRNA相對值正常培養(yǎng)組 1.00±0 1.00±0缺氧6 h組 1.28±0.06 1.22±0.16缺氧12 h組 1.96±0.14? 1.77±0.19?缺氧24 h組 3.03±0.18? 2.46±0.23?

與正常培養(yǎng)組相比,*P<0.05

2.2 缺氧誘導(dǎo)下ADM和VEGF蛋白表達(dá)增強(qiáng)

提取各組MG-63細(xì)胞的總蛋白,Western blotting檢測MG-63細(xì)胞中ADM和VEGF蛋白的表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)各組細(xì)胞均有ADM蛋白表達(dá),相對于正常培養(yǎng)組,缺氧誘導(dǎo)各組細(xì)胞的ADM蛋白表達(dá)增強(qiáng)(見圖3)。其中缺氧誘導(dǎo)24 h組細(xì)胞表達(dá)ADM的量為最強(qiáng),組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與ADM的表達(dá)類似,在缺氧的刺激下MG-63細(xì)胞的VEGF蛋白表達(dá)增強(qiáng),并隨著缺氧時(shí)間的延長進(jìn)一步增強(qiáng),在24 h缺氧時(shí)VEGF表達(dá)最強(qiáng),組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。檢測各組細(xì)胞ADM和VEGF蛋白的相對表達(dá)量,將正常培養(yǎng)組的ADM和VEGF蛋白表達(dá)量設(shè)置為“1”。結(jié)果表明在缺氧誘導(dǎo)培養(yǎng)下,可刺激MG-63細(xì)胞中ADM和VEGF的表達(dá),并且隨著缺氧誘導(dǎo)時(shí)間的延長,兩者的表達(dá)同步增強(qiáng)(見圖3)。

與正常培養(yǎng)比較,*P<0.05圖3 Western blotting檢測缺氧誘導(dǎo)不同時(shí)間MG-63細(xì)胞的ADM和VEGF蛋白表達(dá)情況Figure 3 ADM and VEGF protein expression in MG-63 cells induced by hypoxia at different time points by Western blotting

3 討論

腫瘤在宿主內(nèi)通常具有誘導(dǎo)新生血管生成能力,腫瘤組織可以產(chǎn)生和分泌血管擴(kuò)張與血管生成性物質(zhì),而這可能是腫瘤生存所必需的方式[5]。通常正常組織的氧分壓在24-60 mmHg[6],而在實(shí)體性腫瘤中,由于腫瘤的快速增長超過了腫瘤血管的供應(yīng)能力,常常使腫瘤中心部位處于缺氧狀態(tài),此時(shí)腫瘤組織的氧分壓只有5 mmHg左右[7],缺氧狀態(tài)有可能刺激腫瘤細(xì)胞過度產(chǎn)生和分泌ADM。

本實(shí)驗(yàn)在缺氧的條件下培養(yǎng)MG-63細(xì)胞,在不同的缺氧誘導(dǎo)時(shí)間點(diǎn),分別使用real time-PCR和Western blotting檢測ADM mRNA和蛋白的表達(dá)情況,相對于常氧條件下,缺氧誘導(dǎo)的各組細(xì)胞的ADM表達(dá)更強(qiáng),缺氧誘導(dǎo)6 h后ADM表達(dá)即有明顯差異,隨著缺氧時(shí)間的延長,ADM表達(dá)在24 h達(dá)到最強(qiáng),ADM的表達(dá)與缺氧誘導(dǎo)的時(shí)間呈正相關(guān)關(guān)系,蛋白水平和基因水平的檢測得到了相似的結(jié)果。ADM是一種強(qiáng)效而持久的血管擴(kuò)張肽,但深入的研究發(fā)現(xiàn)它的作用不僅僅局限于擴(kuò)張血管。ADM可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡,促進(jìn)新生的血管生成,并影響血管的張力和滲透性[8]。ADM通過介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞,激活蛋白激酶B,分裂素活化蛋白激酶、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2以及成簇黏附激酶而發(fā)揮血管生成作用[9]。先前的研究一直認(rèn)為只有血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)、血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor,PDGF)和血管生成素(angiopoietin)才對血管生成有明顯的促進(jìn)作用[10],但是如今ADM作為潛在的腫瘤血管生長因子已經(jīng)引起了研究者的關(guān)注。

Dong等[11]的研究發(fā)現(xiàn),觀察去勢以后大鼠的前列腺組織,發(fā)現(xiàn)使用ADM后,其前列腺組織的血流明顯增強(qiáng)。進(jìn)一步的深入研究還發(fā)現(xiàn)如果使用特異性ADM抗體,則前列腺組織的血流明顯增強(qiáng)的作用將不復(fù)存在[12]。外源性添加VEGF也能得到相似的結(jié)果,同樣的ADM抗體也可以阻斷VEGF的這種血流增強(qiáng)效果[13]。Benyahia等[14]在人體外培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞,通過添加外源性的ADM發(fā)現(xiàn)可明顯增強(qiáng)VEGF誘導(dǎo)的毛細(xì)血管生成。以上的研究發(fā)現(xiàn)都支持ADM能夠增強(qiáng)腫瘤組織的血管化,因此我們提出科學(xué)假設(shè):ADM可能通過上調(diào)VEGF的表達(dá)實(shí)現(xiàn)促進(jìn)血管生成和新生血管形態(tài)形成,從而達(dá)到緩解腫瘤組織的缺氧狀態(tài)。

目前關(guān)于骨肉瘤細(xì)胞在缺氧狀態(tài)下ADM的表達(dá)情況,尚無相關(guān)研究。故本實(shí)驗(yàn)采用缺氧誘導(dǎo)培養(yǎng)MG-63細(xì)胞,從蛋白和基因水平檢測結(jié)果來看,隨著ADM的表達(dá)增強(qiáng)VEGF呈現(xiàn)相同的表達(dá)趨勢,缺氧誘導(dǎo)6 h后相比對照組VEGF表達(dá)即有明顯差異,隨著缺氧時(shí)間的延長,VEGF的表達(dá)在24 h達(dá)到最強(qiáng)。初步證明了骨肉瘤細(xì)胞中ADM在缺氧條件下表達(dá)被激活,并且隨著缺氧誘導(dǎo)時(shí)間的延長,ADM和VEGF的表達(dá)同步增強(qiáng),為下一步驗(yàn)證科學(xué)假設(shè)(ADM通過上調(diào)VEGF的表達(dá)參與腫瘤新生血管的生成)奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。