美洲大蠊提取物對人胚胎皮膚成纖維細胞增殖的影響*

劉榮榮，李麗娟，王楠，張海珠

（大理大學 1.公共衛(wèi)生學院，2.云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室，3.藥學與化學學院，云南 大理 671000）

創(chuàng)傷、燒燙傷及手術切口等均可導致傷口愈合異常，引起病理性瘢痕的產(chǎn)生，增生性瘢痕（hypertrophic scars,HS）是病理性瘢痕的一種，可引起組織潮紅、瘙癢、疼痛等癥狀，影響美觀，造成局部組織或器官功能障礙，甚至發(fā)生畸形，嚴重影響患者身心健康及生存質(zhì)量[1-2]。HS 的形成主要是以成纖維細胞的異常增殖、細胞外基質(zhì)大量沉積及膠原蛋白表達異常為特征[3]。目前其治療方法主要有藥物、手術、放射、激光及壓迫等，但均無特效的治療方法[4-5]。因此，尋找預防和治療的有效方法調(diào)控瘢痕使其增生至適當程度，已成為醫(yī)學研究領域的熱點。美洲大蠊含有多種化學成分，具有抗肝纖維化、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗氧化、抗炎鎮(zhèn)痛，增強免疫、保肝，促進血管增生、組織修復等作用[6-10]。本研究以體外培養(yǎng)人胚胎皮膚成纖維細胞為研究對象，采用美洲大蠊提取物進行干預，觀察美洲大蠊提取物對人胚胎皮膚成纖維細胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞株與藥物

人胚胎皮膚成纖維細胞株（CCC-ESF-1，編號：BNCC339675）購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院，美洲大蠊提取物（乙醇提?。〦nto-A（黃褐色濃稠 膏狀）、Ento-B、Ento-C 和Ento-D（褐色濃稠膏狀）、Ento-E（黃褐色凍干粉末）、Ento-F（褐色液體）為云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室自制。

1.2 試劑與耗材

H-DMEM 培養(yǎng)基（美國Gibco 公司），碳酸氫鈉（NaHCO3）、Hepes（北京索萊寶科技有限公司），胎牛血清（美國Gibco 公司），0.25%胰蛋白酶（美國Millipore 公司），噻唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）（美國Sigma 公司），雙抗青鏈霉素混合液（美國Millipore 公司），磷酸鹽緩沖液（PBS）（美國Hyclone公司）。

1.3 儀器

低速離心機（SC-2546）（安徽中科中佳科學儀器有限公司），多功能酶標儀（Spectra Max M2）（美國Molecular Devices 公司），立式壓力蒸汽滅菌器（YXQLS-50SII）（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠），電熱恒溫水浴鍋（HWS-12 型）（上海一恒科技有限公司），水套式二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司），潔凈工作臺（SW-CJ-1FD）（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司），冰箱（BCD-232MB/A）（廣東容聲電器股份有限公司），立式超低溫保存箱（DW-86L386）（青島海爾股份有限公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 細胞培養(yǎng) CCC-ESF-1 于H-DMEM（含1%雙抗、10%胎牛血清）完全培養(yǎng)液中，置于37℃、5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細胞長滿瓶底80%以上，用PBS 沖洗2 次，加入1ml 0.25%胰蛋白酶常溫消化1～2min，輕拍瓶壁使細胞脫落，加入2 倍體積的完全培養(yǎng)基終止消化，移至15ml 離心管，1000r/min 離心6min，去上清液，沉淀加入適量完全培養(yǎng)基制成單細胞懸液，調(diào)整濃度，取生長狀況良好的對數(shù)生長期成纖維細胞用于實驗。

1.4.2 美洲大蠊提取物對CCC-ESF-1增殖活性的影響 取對數(shù)生長期的CCC-ESF-1 以1×105個/ml 接種于96 孔培養(yǎng)板培養(yǎng)，每孔接種90μl，置于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24h 后取出設立美洲大蠊提取物不同濃度的實驗組，同時設不加藥的陰性對照組（含等量細胞重懸液）和只加培養(yǎng)液的空白組。實驗組分別加入美洲大蠊提取物10μl/孔，使其終濃度分別為300、100、30、10 和3μg/ml，每種濃度至少設3 個復孔，振蕩均勻后繼續(xù)培養(yǎng)，于24、48、72 及96h 后取出加MTT（20μl/孔），繼續(xù)培養(yǎng)4h 后加入DMSO 150μl/孔，振蕩2min，于酶標儀490 nm 波長處測各孔的吸光度（A）值。細胞增殖抑制率公式：抑制率%=[1-（實驗組A 值-空白組A 值）/（陰性對照組A 值-空白組A 值）]×100%，即抑制率%=（陰性對照組A 值-實驗組A 值）/（陰性對照組A 值-空白組A 值）×100%。

1.5 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件和Excel 軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組不同時間點的比較采用重復測量設計的方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度美洲大蠊提取物作用24 h 對CCCESF-1 細胞形態(tài)的影響

低倍光學電子顯微鏡下觀察可見，陰性對照組CCC-ESF-1 細胞似長梭形或三角形，生長狀態(tài)良好。30μg/ml 美洲大蠊提取物Ento-C 作用細胞24h 后，細胞狀態(tài)較陰性對照組無變化。3μg/ml 美洲大蠊提取物Ento-B、Ento-E 和300μg/ml 美洲大蠊提取物Ento-F分別作用細胞24h 后，與陰性對照組比較，細胞數(shù)有少量減少，細胞形態(tài)有皺縮，發(fā)生變形，三者細胞狀態(tài)相似。10μg/ml 美洲大蠊提取物Ento-D 作用細胞24h 后，細胞數(shù)有一定減少，細胞形態(tài)皺縮，間隙變大，棱角變鈍，散布存在。3μg/ml 美洲大蠊提取物Ento-A 作用細胞24h 后，細胞數(shù)變少明顯，細胞形態(tài)變短，細胞纖維樣逐漸消失，甚至可以看到漂浮的細胞（見圖1）。

2.2 美洲大蠊提取物對CCC-ESF-1 細胞增殖的抑制作用

不同濃度美洲大蠊提取物給藥后24、48、72 及96h 細胞增殖抑制率比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①CCC-ESF-1 細胞在美洲大蠊提取物Ento-A 作用下，不同時間點間的細胞增殖抑制率有差異（F=7.790，P=0.000）；不同藥物濃度的美洲大蠊提取物對CCC-ESF-1 細胞增殖抑制率有差異（F=13.351，P=0.000）；作用時間與藥物濃度存在交互作用，藥物作用時間隨藥物濃度的變化有差異（F=5.042，P=0.000）。②CCC-ESF-1 細胞在美洲大蠊提取物Ento-B 作用下，不同時間點的細胞增殖抑制率有差異（F=22.485，P=0.000）；不同藥物濃度的美洲大蠊提取物對CCC-ESF-1 細胞增殖抑制率有差異（F=12.091，P=0.000）；作用時間與藥物濃度存在交互作用，藥物作用時間隨藥物濃度的變化有差異（F=3.678，P=0.000）。③CCC-ESF-1 細胞在美洲大蠊提取物Ento-C 作用下，不同時間點的細胞增殖抑制率有差異（F=7.251，P=0.000）；不同藥物濃度的美洲大蠊提取物對CCC-ESF-1 細胞增殖抑制率無差異（F=2.061，P=0.102）；作用時間與藥物濃度存在交互作用，藥物作用時間隨藥物濃度的變化有差異（F=2.600，P=0.003）。④CCC-ESF-1 細胞在美洲大蠊提取物Ento-D 作用下，不同時間點的細胞增殖抑制率有差異（F=5.940，P=0.000）；不同藥物濃度的美洲大蠊提取物對CCC-ESF-1 細胞增殖抑制率有差異（F=13.176，P=0.000）；作用時間與藥物濃度存在交互作用，藥物作用時間隨藥物濃度的變化有差異（F=3.126，P=0.000）。⑤CCC-ESF-1 細胞在美洲大蠊提取物Ento-E 作用下，不同時間點的細胞增殖抑制率有差異（F=7.553，P=0.000）；不同藥物濃度的美洲大蠊提取物對CCC-ESF-1 細胞增殖抑制率有差異（F=6.183，P=0.001）；作用時間與藥物濃度不存在交互作用，藥物作用時間隨藥物濃度的變化無差異（F=1.585，P=0.096）。⑥CCC-ESF-1 細胞在美洲大蠊提取物Ento-F 作用下，不同時間點的細胞增殖抑制率無差異（F=0.824，P=0.484）；不同藥物濃度的美洲大蠊提取物對CCC-ESF-1 細胞增殖抑制率無差異（F=0.961，P=0.459）；作用時間與藥物濃度不存在交互作用，藥物作用時間隨藥物濃度的變化無差異（F=1.700，P=0.067）。見表1。

圖1 不同濃度美洲大蠊提取物作用24 h CCC-ESF-1 細胞的形態(tài)（光學電子顯微鏡×40）

與陰性對照組比較，終濃度為3 及10μg/ml 美洲大蠊提取物Ento-A 在不同作用時間（24、48、72 及 96h）對CCC-ESF-1 細胞增殖均有抑制作用（P＜0.05），且3μg/ml 作用24h 時細胞增殖抑制率（53.691± 4.539）%最突出；終濃度為3μg/ml 美洲大蠊提取物Ento-B 在不同作用時間（24、48、72 及96h）對CCC-ESF-1 細胞增殖均有抑制作用（P＜0.05），且3μg/ml 作用72h 時細胞增殖抑制率（56.609±9.161）%最明顯；終濃度為3 及10μg/ml 美洲大蠊提取物Ento-C 在作用72 和96h 時對CCC-ESF-1 細胞增殖均 有抑制作用（P＜0.05），且10μg/ml 作用96h 時細胞增殖抑制率為（36.555±17.423）%；終濃度為3μg/ml 美洲大蠊提取物Ento-D 在不同作用時間（24、48、72 及96h）對CCC-ESF-1 細胞增殖均有抑制作用（P＜ 0.05），10μg/ml 作用96h 時細胞增殖抑制率（42.367± 2.257）%最明顯；終濃度為3μg/ml 美洲大蠊提取物Ento-E 在不同作用時間（24、48、72 及96h）對CCC-ESF-1 細胞增殖均有抑制作用（P＜0.05），且3μg/ml作用96h時細胞增殖抑制率（50.820±16.563）%最明顯；美洲大蠊提取物Ento-F 對CCC-ESF-1 細胞增殖的抑制作用不明顯。見表1。

2.3 同一濃度美洲大蠊提取物作用不同時間對CCC-ESF-1 細胞增殖的抑制作用

美洲大蠊提取物（Ento-A、Ento-B、Ento-C、Ento-D、Ento-E、Ento-F）對CCC-ESF-1 細胞的增殖有 抑制作用，其中低濃度（3 和10 μg/ml）Ento-B、Ento-C、Ento-D、Ento-E 作用72 和96 h 時抑制效果較好；低濃度（3 和10 μg/ml）Ento-A 作用24 h 時抑制效果最好；中高濃度（30～300 μg/ml）Ento-F 作用24 h 時抑制效果較好。

表1 各組不同作用時間的CCC-ESF-1 細胞增殖抑制率的比較（±s）

表1 各組不同作用時間的CCC-ESF-1 細胞增殖抑制率的比較（±s）

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續(xù)表1

2.4 同一時間不同濃度美洲大蠊提取物對CCCESF-1 細胞增殖的抑制作用

美洲大蠊提取物Ento-A、Ento-B、Ento-C、Ento- D、Ento-E、Ento-F 對CCC-ESF-1 細胞的增殖有抑制 作用，其中Ento-A、Ento-B、Ento-C、Ento-D、Ento-E 在低濃度（3 及10 μg/ml）時抑制效果較好；Ento-F在中高濃度（30～300 μg/ml）時抑制效果較好。

3 討論

瘢痕形成和創(chuàng)面愈合機制是一個相當復雜的生物學過程，其機制尚未完全清楚，一般認為增生性瘢痕的成因來源于成纖維細胞的生物學特性異常，由于成纖維細胞增殖、生長失控，膠原過度沉積導致真皮纖維化。增生性瘢痕的治療方法有中藥療法、抗腫瘤藥治療、手術治療、壓力治療、放射治療、激光治療、基因治療等，目前尚無特效的治療方法。盡管增生性瘢痕屬于良性病變[11-14]，但由于影響體表美觀，關節(jié)部位的瘢痕還可影響關節(jié)活動，降低生活質(zhì)量，易復發(fā)，因此是目前臨床上亟待解決的課題[15]。

許多中藥被用來治療增生性瘢痕，中藥中的昆蟲藥具有資源廣、活性高、作用強、劑量小等優(yōu)點，被廣泛用于治療各種疑難雜癥。美洲大蠊是蜚蠊科大蠊屬動物，具有散瘀、消積、解毒、利水、消腫等功效，主治兒童疳積、扁桃體炎、身體包塊和癰等。近年來以大理大學李樹楠教授為代表的專家學者對美洲大蠊的藥理作用和臨床應用進行深入的研究，取得良好的社會效益和經(jīng)濟效益。大量研究顯示，美洲大蠊提取物對多種細胞增殖都有一定的抑制作用[16-21]，其對機體的創(chuàng)傷愈合有修復作用[22-23]。本課題組前期發(fā)現(xiàn)，美洲大蠊提取物具有減輕瘢痕和使瘢痕增生的雙向作用，但減輕瘢痕的增生及修復瘢痕才具有臨床實際應用價值，因此藥物的最佳用量及增生的時期成為關鍵因素。本研究發(fā)現(xiàn)，美洲大蠊提取物對CCC-ESF-1增殖有抑制作用，美洲大蠊提取物Ento-A、Ento-B、Ento-C、Ento-D、Ento-E 在3 和10 μg/ml 時對CCC- ESF-1 細胞的增殖抑制作用效果較好，美洲大蠊提取物Ento-F 在300 μg/ml 時對CCC-ESF-1 細胞的增殖有抑制作用，且藥物Ento-F 對CCC-ESF-1 細胞的增殖抑制作用均弱于其他5 種。提示美洲大蠊提取物能抑制體外CCC-ESF-1 的增殖，可能起到抑制瘢痕增生的作用，有成為治療增生性瘢痕藥物的可能性，其實際臨床療效尚需經(jīng)過動物實驗或結合臨床開展進一步研究。該結論為美洲大蠊提取物應用于動物實驗或者其他成纖維細胞實驗的研究提供依據(jù)，也為增生性瘢痕的臨床治療提供新的思路，為進一步研究制備美洲大蠊相應藥物制劑奠定基礎。