NFKB1基因新位點(diǎn)突變導(dǎo)致EB病毒淋巴增殖疾病的臨床免疫和遺傳特征

林 麗 王 瑩 王文婕 劉璐瑤 孫金嶠 王曉川

1 病例資料

女，12歲，2019年6月因“反復(fù)發(fā)熱6月”到復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院(我院)就診，最高體溫40℃，發(fā)熱每天1～2次，偶有咳嗽，無寒戰(zhàn)。2019年2～6月，多次因“不明原因發(fā)熱”、“EBV感染”、“肝功能異?！痹谕庠壕驮\，ALT最高達(dá)699 IU·L-1，AST最高達(dá)849 IU·L-1，保肝藥物治療后肝功能基本正常?？共《局委熜Ч患眩珽BV載量持續(xù)陽(yáng)性。否認(rèn)家族遺傳病史，父母及哥哥身體健康。自2019年6月以來，患兒一直在我院門診隨訪、住院評(píng)估治療。

體格檢查：神志清楚，無皮疹，雙側(cè)頸部可及黃豆大小淋巴結(jié)，無壓痛，活動(dòng)可。雙眼瞼無水腫。咽紅，扁桃體Ⅰ度腫大，無滲出。雙肺呼吸音粗，未及明顯干濕啰音。腹軟，肝肋下1 cm，脾肋下未及。

實(shí)驗(yàn)室和影像檢查：圖1顯示，血常規(guī)提示W(wǎng)BC增高明顯，以淋巴細(xì)胞為主，異淋>10%。各EBV相關(guān)抗體均升高，外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)和血漿EBV DNA載量近半年來持續(xù)陽(yáng)性。外院曾行外周血淋巴細(xì)胞分選，提示T/B/NK細(xì)胞中EBV-DNA均為陽(yáng)性?？紤]患兒為慢性活動(dòng)性EBV感染的可能。凝血因子Ⅺ和Ⅻ活性分別為32.3%和42.3%(參考值范圍50%～150%)，APTT 56.3 s(參考值為34 s)。骨髓穿刺提示，骨髓增生明顯活躍，粒紅比例減低，偶見噬血細(xì)胞。肺炎支原體IgM弱陽(yáng)性。未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌和真菌病原體。余檢查未見異常。腹部B超提示肝肋下26 mm，劍突下長(zhǎng)50 mm；上腹部CT提示肝、脾增大。

圖1患兒白細(xì)胞水平的變化、免疫球蛋白、淋巴細(xì)胞亞群、EB病毒載量及抗體和治療過程
注 兩條黃色虛線為白細(xì)胞正常參考值上下限[(4～10)×109·L-1]

免疫學(xué)檢測(cè)：①通過免疫比濁法檢測(cè)免疫球蛋白IgG、IgM和IgA的水平，通過UniCAP檢測(cè)IgE水平。淋巴細(xì)胞亞群通過BD Multitest IMK試劑盒檢測(cè)。多次免疫球蛋白檢測(cè)都顯示IgM正常，IgG、IgA和IgE顯著升高；淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)最明顯的改變是NK細(xì)胞異常增高，CD4/CD8比例升高，B細(xì)胞增多；T、B細(xì)胞的相對(duì)計(jì)數(shù)均明顯降低。②淋巴細(xì)胞亞群精細(xì)分型，取患兒肝素抗凝全血50 μL，加入抗體后室溫避光孵育30 min，加入紅細(xì)胞裂解液，水浴離心后棄上清，加入PBS重懸混勻后上機(jī)檢測(cè)(BD FACSCanto Ⅱ)。圖2顯示，總B細(xì)胞下降，其中記憶性B細(xì)胞下降，幼稚B細(xì)胞增多；T細(xì)胞明顯下降，其中CD8+T細(xì)胞各項(xiàng)均正常，CD4+T細(xì)胞增多，CD4+幼稚細(xì)胞減少，效應(yīng)記憶性CD4+T細(xì)胞增多；γδT細(xì)胞明顯減少。③多次細(xì)胞因子微球檢測(cè)技術(shù)(CBA)發(fā)現(xiàn)炎癥因子IL-6均明顯升高，IL-2、TNF-α、IL-4和IL-10水平正常。

基因檢測(cè)：行全外顯子測(cè)序(WES)。采集患兒及父母全血，抽取DNA(QIGEN)，基因組DNA經(jīng)超聲打斷、末端修復(fù)、接頭連接和雜交捕獲構(gòu)建文庫(kù)，采用Illumina公司HiSeq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行序列檢測(cè)，人類基因組hg19(GRCh37)為參考序列進(jìn)行比對(duì)分析。患兒4號(hào)染色體NFKB1基因突變，突變點(diǎn)為NM_003998：exon 22:c.2430dupA，在國(guó)內(nèi)外數(shù)據(jù)庫(kù)中尚無報(bào)道。取患兒、哥哥和父母的基因組DNA，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(EmeraldAmp? PCR Master Mix，日本寶日醫(yī)生物公司)。正向引物序列：5'-3'CAGCATTATCCAGGGTCTAC；反向引物序列：5'-3'GGCAATGACTGGTTTTCTTC。圖3顯示，患兒父母與哥哥均未攜帶突變，患兒為新發(fā)變異。圖4顯示，之前報(bào)道的絕大部分NFKB1基因突變位于N末端RHD區(qū)域，本文患兒的突變位于蛋白C端的死亡結(jié)構(gòu)域，預(yù)測(cè)將導(dǎo)致移碼突變，第811位谷氨酰胺變?yōu)樘K氨酸，氨基酸翻譯在此后的第4位提前終止(Q811Tfs*4)，使蛋白質(zhì)序列縮短(圖3)，經(jīng)mutationtaster軟件預(yù)測(cè)為致病突變。蛋白免疫印跡方法：RIPA裂解細(xì)胞提取患兒和健康對(duì)照的總蛋白，在10%的SDS-PAGE凝膠上分離(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，孵育一抗NF-kappaB p105/p50抗體、GAPDH抗體和二抗羊抗兔IgG (H+L) HRP(Affinity)，通過卓越型ECL發(fā)光底物(上海圣爾生物科技有限公司)顯影。與正常對(duì)照比較，患兒p50表達(dá)下降明顯(圖5A)。熒光定量PCR將患兒和健康對(duì)照的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過染料法進(jìn)行定量PCR檢測(cè)(ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix，南京諾唯贊生物科技有限公司)，β-Actin作為內(nèi)參基因，計(jì)算2-△△CT比較相對(duì)表達(dá)量。與健康對(duì)照比較，患兒mRNA的相對(duì)表達(dá)量下降近一半，說明該突變使轉(zhuǎn)錄層面受到影響，使mRNA不穩(wěn)定(圖5B)。

圖2患兒淋巴細(xì)胞亞群精細(xì)分型
注 正常值參考文獻(xiàn)(Ding Y, Zhou L, Xia Y, et al. Reference values for peripheral blood lymphocyte subsets of healthy children in China. J Allergy Clin Immunol, 2018,142: 970-973.e8)

圖3患兒家系NFKB1基因突變測(cè)序驗(yàn)證
注 紅色箭頭表示患兒攜帶的突變點(diǎn)。野生型蛋白序列和c.2430dupA突變后的蛋白序列對(duì)比，該重復(fù)將導(dǎo)致移碼突變，從第811位氨基酸開始，翻譯提前終止治療：患兒住院期間先后予阿昔洛韋靜滴、伐昔洛韋口服和干擾素抗病毒，頭孢地尼、甲硝唑和阿奇霉素抗感染，復(fù)方甘草酸苷片和谷胱甘肽保肝，血漿輸注以改善凝血功能，潑尼松抑制免疫。治療后，體溫平穩(wěn)，肝功能指標(biāo)有所好轉(zhuǎn)，白細(xì)胞水平仍很高(圖1)，EBV-DNA載量滴度持續(xù)高，完善相關(guān)檢查后，擬行造血干細(xì)胞移植治療。

圖4 p105/p50蛋白結(jié)構(gòu)域示意圖
注 p105和p50蛋白有共同的RHD和GRR結(jié)構(gòu)域，p105還包括ANK結(jié)構(gòu)域和死亡結(jié)構(gòu)域(DEATH)。黑色為文獻(xiàn)報(bào)道的突變位點(diǎn)；紅色代表文獻(xiàn)報(bào)道里有EBV感染的臨床表型；藍(lán)色代表本文患兒的突變。繪圖軟件為DOG1.0(Ren J, Wen L, Gao X, et al. DOG 1.0: illustrator of protein domain structures. Cell Res, 2009,19(2):271-273)

圖5NFKB1缺陷對(duì)蛋白和mRNA的影響
注 A：蛋白免疫印跡結(jié)果患兒p50表達(dá)降低；B：通過熒光定量PCR檢測(cè)，患兒NFKB1mRNA表達(dá)相較于同年齡的健康對(duì)照明顯下降

2 討論

核因子κB(NF-κB)信號(hào)通路在炎癥反應(yīng)、固有免疫和適應(yīng)性免疫的發(fā)育、細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡等過程中起重要作用[1]。NF-κB作為關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子主要包括5個(gè)家族成員：p105/p50、p100/p52、RelA(p65)、RelB和c-Rel[2]。NF-κB信號(hào)通路中相關(guān)基因突變會(huì)造成不同的原發(fā)性免疫缺陷病[3-5]。其中NFKB1基因編碼p105和p50蛋白，前體蛋白p105經(jīng)過蛋白酶體加工處理后轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓腜50[6]。NFKB1缺陷會(huì)導(dǎo)致多種臨床表型，包括常見變異型免疫缺陷病(CVID)和聯(lián)合免疫缺陷病(CID)，通常伴有自身免疫性疾病和自身炎癥性疾病[7-10]。2015年，F(xiàn)liegauf等[8]首次報(bào)道在3個(gè)家系中NFKB1p50單倍劑量不足將導(dǎo)致CVID表型，起病從兒童至老年均可見，臨床表現(xiàn)多樣，嚴(yán)重程度不一，包括成年起病的無丙種球蛋白血癥、肺部感染、肝臟疾病、淋巴結(jié)腫大、皮損、自身免疫病(如自身免疫性甲狀腺炎、自身免疫溶血性貧血和血小板減少等)，偶見脫發(fā)。文獻(xiàn)中3個(gè)突變點(diǎn)都發(fā)生在RHD，該區(qū)域負(fù)責(zé)p50/RelA二聚化的形成和DNA結(jié)合，因而p105未受影響，p50蛋白表達(dá)減少。NFKB1突變還使B細(xì)胞發(fā)育受損，停滯在前-B細(xì)胞階段[11]。Boztug等[12]報(bào)道位于RHD結(jié)構(gòu)域的NFKB1突變還可導(dǎo)致EBV淋巴增殖性疾病的新表型，p50和磷酸化的p105蛋白表達(dá)降低，過渡性B細(xì)胞減少，T細(xì)胞數(shù)量雖正常但增殖功能下降，因而該患者表現(xiàn)出CID表型，EBV相關(guān)的淋巴增殖性疾病可能是由于NFKB1缺陷累及了CD27誘導(dǎo)的T細(xì)胞活化。雖然此后多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)報(bào)道了新的NFKB1突變位點(diǎn)和不同的臨床表型[7,9,13]，但目前僅有4篇文獻(xiàn)報(bào)道NFKB1缺陷患兒存在EBV感染癥狀[10,12,14,15]。NFKB1缺陷出現(xiàn)臨床表型多樣的原因可能與基因突變位點(diǎn)、年齡和環(huán)境因素有關(guān)，小年齡的患兒癥狀比較輕[7]。然而，Hoeger等[15]比較了NFKB1突變位點(diǎn)與CVID、自身炎癥、CID和EBV相關(guān)的淋巴增殖疾病之間的關(guān)系，并未發(fā)現(xiàn)明顯的基因-表型關(guān)系。圖4總結(jié)了文獻(xiàn)報(bào)道的突變位點(diǎn)與EBV感染表型后發(fā)現(xiàn)，二者并無明顯聯(lián)系。NFKB1缺陷尚無標(biāo)準(zhǔn)治療方法，需注意個(gè)體化，文獻(xiàn)報(bào)道主要通過使用抗生素、免疫球蛋白替代、激素、利妥昔單抗、麥考酚酸酯及造血干細(xì)胞移植治療，目前尚無長(zhǎng)期隨訪和生存數(shù)據(jù)證明移植的效果[6,15]。

本文報(bào)道1例NFKB1基因新發(fā)突變，患兒具有反復(fù)發(fā)熱、肝功能受損、凝血異常、EBV相關(guān)淋巴增殖表現(xiàn)。臨床表型中凝血功能異常在其他文獻(xiàn)中尚未見報(bào)道。免疫評(píng)估顯示患兒尚無抗體缺陷的表現(xiàn)，可能由于該病所致的低丙種球蛋白血癥多為成年起病，小年齡的患兒癥狀不重，但需警惕抗體缺陷的出現(xiàn)，隨訪中常規(guī)監(jiān)測(cè)免疫球蛋白水平。本文患兒WBC的升高與降低可能與使用干擾素、阿昔洛韋、激素和血漿輸注等治療有關(guān)?；純?019年10月份進(jìn)行淋巴細(xì)胞亞群和精細(xì)分型時(shí)，WBC處于相對(duì)正常水平，因而該次檢查結(jié)果明顯與其他時(shí)間段不同。WBC的異常增加導(dǎo)致患兒T、B細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)增加，但從比例來看，淋巴細(xì)胞中主要為NK細(xì)胞，T、B細(xì)胞比例明顯降低。精細(xì)分型記憶性B細(xì)胞下降與其他文獻(xiàn)報(bào)道一致。γδT細(xì)胞作為固有免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁，可釋放IL-17和IL-22，并發(fā)揮穿孔素/顆粒酶細(xì)胞素作用，在微生物抗感染免疫中起重要作用，對(duì)NFKB1缺陷患兒γδT細(xì)胞的研究有限，Gonzalez-Granado等[9]報(bào)道NFKB1(c.705G>A)突變患兒γδT細(xì)胞減少，與之相符的是患兒IL-17A和IL-22細(xì)胞因子同樣減少。雖然本研究尚未進(jìn)行細(xì)胞因子實(shí)驗(yàn)，但本文患兒的淋巴亞群精細(xì)分型顯示γδT細(xì)胞減少與Gonzalez-Granado的研究相同。曾有體外實(shí)驗(yàn)表明NFKB1在NK細(xì)胞的成熟過程中必不可少，其缺失會(huì)減弱NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用、IFN-γ的分泌以及使增殖能力受損[14]，淋巴亞群分析提示患兒的NK比例和絕對(duì)計(jì)數(shù)明顯增高，考慮是由NFKB1基因突變所致的異常免疫反應(yīng)，猜測(cè)患兒NK細(xì)胞數(shù)量雖然增多，但多為不成熟細(xì)胞且功能是受損的。文獻(xiàn)報(bào)道NFKB1突變可分為4類：①單倍劑量不足突變，如N末端的無義或移碼突變，通常會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的截短無功能蛋白；②外顯子跳躍突變導(dǎo)致p105中間位置被截?cái)?，引起p50樣突變蛋白的表達(dá)；③N末端的錯(cuò)義突變，可能僅影響p50；④C末端的錯(cuò)義突變，僅影響p105[6,16]。與這4類不同的是，本文患兒屬于C末端死亡結(jié)構(gòu)域的移碼突變，可能會(huì)導(dǎo)致截短的無功能蛋白，蛋白印跡顯示該移碼突變影響p50蛋白的表達(dá)。雖然對(duì)于本病造血干細(xì)胞移植的效果尚不明確，但考慮到目前患兒抗病毒和激素治療后效果不明顯，綜合評(píng)估后移植可作為治療的選擇。