Regesi再生硅、Bio-Oss骨粉對成骨細胞增殖、 成骨分化作用的影響

賈琰 張保榮

Regesi再生硅、Bio-Oss骨粉對成骨細胞增殖、

成骨分化作用的影響

賈? ?琰1? ? ? 張保榮2

1.濰坊醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院，山東濰坊? ?261053;2.航空總醫(yī)院口腔診療中心，北京? ?100012

[摘要] 目的 觀察小鼠成骨細胞（MC3T3-E1）分別在Regesi再生硅和Bio-Oss骨粉材料上的生長情況，分析Regesi再生硅材料、Bio-Oss骨粉對小鼠成骨細胞增殖、成骨分化的影響。 方法 將實驗分為3組，分別為Regesi再生硅實驗組、Bio-Oss骨粉實驗組和對照組，將兩種材料分別放置于24孔板中，對照組為空白，將細胞分別接種在各組24孔板上，培養(yǎng)1、4、7 d時倒置顯微鏡觀察細胞生長情況;培養(yǎng)1、4、7 d時MTT檢測細胞的增殖活性;培養(yǎng)7 d時堿性磷酸酶（ALP）試劑盒測定成骨細胞的OD值來分析ALP活性;培養(yǎng)7 d時Rt-PCR方法測定3組細胞的Runx2和Osterix（OSX）基因表達情況。 結(jié)果 顯微鏡下觀察，各組細胞隨著時間增加而數(shù)量增加;培養(yǎng)7 d時與對照組比較，Regesi再生硅組細胞增殖水平升高（P < 0.05），ALP活性、Runx2、OSX mRNA表達水平升高（P < 0.05），培養(yǎng)7 d時Bio-Oss骨粉組細胞增殖水平降低（P < 0.05），ALP活性、Runx2、OSX mRNA的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。結(jié)論 Regesi再生硅能促進MC3T3-E1細胞的增殖、分化水平;Bio-Oss骨粉能減緩細胞增殖，但成骨分化能力與單純成骨細胞無明顯差異。

[關(guān)鍵詞] 增殖;成骨分化;Regesi再生硅;Bio-Oss骨粉;MC3T3-E1細胞

[中圖分類號] R318? ? ? ? ? [文獻標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）01（c）-0013-04

Effect of Regesi regeneration silicon and Bio-Oss bone meal on proliferation and osteogenic differentiation of osteoblasts

JIA Yan1? ?ZHANG Baorong2

1.Oral Medicine School， Weifang Medical College， Shandong Province， Weifang? ?261053， China;2.Oral Clinic， Aviation General Hospital， Beijing? ?100012， China

[Abstract] Objective To observe the growth of mouse osteoblast （MC3T3-E1） on Regesi regeneration silicon and Bio-Oss bone powder， and to analyze the effects of Regesi regeneration silicon materials and Bio-Oss bone powder on mouse osteoblast proliferation and osteogenic differentiation. Methods The experiment was divided into three groups， respectively Regesi regeneration silicon group， Bio-Oss bone powder group and control group. The two materials were placed in 24-well plates， while the control group was blank. Cells were inoculated on 24-well plates in each group， and the cell growth was observed by inverted microscope at 1， 4 days， and 7 days of culture; MTT was used to detect cell proliferation activity at 1， 4 days， and 7 days of culture; OD value of osteoblasts was determined by alkaline phosphatase （ALP） kit at 7 d culture to analyze ALP activity. Rt-PCR method was used to determine Runx2 and Osterix（OSX） gene expression in 3 groups of cells at 7 days of culture. Results Under the microscope， the number of cells in each group increased with time. The proliferation level of cells in Regesi group increased （P < 0.05）， and the ALP activity elevated，the expression levels of Runx2 and OSX mRNA increased at 7 days of culture（P < 0.05）. The proliferation level of cells in the bio-Oss bone meal group was decreased at 7 days of culture（P < 0.05）， and there was no significant difference in the ALP activity， and the expression levels of Runx2 and OSX mRNA （P > 0.05）. Conclusion Regesi regenerated silicon can promote the proliferation and differentiation of MC3T3-E1 cells. Bio-Oss bone powder can decrease cell proliferation， while there is no significant difference between osteogenic differentiation ability and osteoblasts alone.

[Key words] Proliferation; Osteogenesis differentiation; Regesi regeneration silicon; Bio-Oss bone meal; MC3T3-E1 cells

口腔頜面部骨組織結(jié)構(gòu)是支撐面型的重要基礎(chǔ)，因各種原因造成的骨組織缺損[1]，極大地影響了患者的健康和生活。如何更好地修復(fù)骨缺損，是臨床醫(yī)生亟待解決的問題和難題。硅已被證實能夠增加各種材料的生物活性，且不影響他們的機械性能或誘導(dǎo)細胞毒性[2]，本研究通過試驗一種新材料-Regesi再生硅對小鼠成骨細胞增殖、成骨分化作用的影響，分析Regesi再生硅的生物學(xué)性能。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與設(shè)備

MC3T3-E1細胞株;Regesi再生硅（幸福益生公司，中國，批號：2019041605）;Bio-Oss骨粉[蓋思特利商貿(mào)（北京）有限公司，批號：81700762];四甲基偶氮唑藍（MTT）;堿性磷酸酶（ALP）試劑盒（南京建成，中國，批號：201907 13）;倒置顯微鏡（奧林巴斯IX51，日本）;酶標(biāo)儀（德國）;RNA提取試劑盒[寶生物工程（大連）有限公司，批號：AJ31039A];One Step TB Green？誖PrimeScriptTM Rt-PCR Kit（Perfect Real Time）[寶生物工程（大連）有限公司，批號：AJ11126A];PCR引物（北京天一輝遠生物科技有限公司）;熒光定量PCR儀（ABI7500，美國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)? 將MC3T3-E1細胞株培養(yǎng)于α-MEM培養(yǎng)基（含1%雙抗混合液、10%FBS）中，細胞培養(yǎng)箱內(nèi)5%CO2、37℃常規(guī)培養(yǎng)，3～4 d傳代1次，待細胞進入對數(shù)生長期后進行實驗。

1.2.2 實驗分組? 將實驗分為3組：Regesi再生硅實驗組、Bio-Oss骨粉實驗組、對照組。將各組材料滅菌后固定于24孔細胞培養(yǎng)板中，每孔約0.2 g，將成骨細胞接種到預(yù)濕后的材料上，放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。

1.2.3 倒置顯微鏡觀察各組材料的細胞生長情況? 在細胞復(fù)合培養(yǎng)至第1、4、7天，在倒置顯微鏡下分別觀察3組細胞生長情況。

1.2.4 MTT試驗檢測細胞增殖情況? 在細胞與材料接種培養(yǎng)至第1、4、7天時進行MTT實驗，取3組細胞各8孔，每孔加入配制5 mg/mL MTT溶液100 μL，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱4 h后取出培養(yǎng)板，吸棄孔中培養(yǎng)液，再每孔加入DMSO 750 μL后移入96孔板中。置于37℃搖床震蕩15 min以充分溶解結(jié)晶物。然后從每孔吸取200 μL放入酶標(biāo)儀中在490 nm單波長處測定各孔吸光度值（OD值）。

1.2.5 堿性磷酸酶測定盒測定ALP活性? 當(dāng)細胞在材料上培養(yǎng)至第7天，取3組細胞各8孔，吸棄培養(yǎng)孔中培養(yǎng)液，PBS緩沖液沖洗3遍后每孔加入1%TritonX-100細胞裂解液100 μL冰上裂解30～40 min。再按照ALP活性測定試劑盒操作說明書測定在520 nm波長處的吸光度值。

1.2.6 Rt-PCR測定3組中Runx2和OSX基因表達情況? 當(dāng)細胞在材料上培養(yǎng)至第4天時，加入礦化誘導(dǎo)液（含50 μg/mL維生素C、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉和10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基），再培養(yǎng)7 d后，采用RT-PCR技術(shù)測定Runx2（Runt related transcription factor 2）和Osterix（OSX）基因表達量。反轉(zhuǎn)錄引物名稱及序列如下。OSX上游引物序列：5′-GCTCGTCTGACTGCCTGCCTAGTGT-3′，下游引物序列5′-ACC-TGGTGAGATGCCTGCGTGGAT-3′;Runx2上游引物序列：5′-CCTTCCAGACCAGCAGCACTCCAT-3′，下游引物序列5′-TCCGTCAGCGTCAACACCATCATTCT-3′;β-actin上游引物序列5′-GAAGATCAAGATCAT-TGCTTCC-3′，下游引物序列5′-TACTCCTGCTTGCTGATCCA-3′。Rt-PCR反應(yīng)：取3組細胞各4孔，采用RNA提取試劑盒提取總RNA，-80℃保存待用。按照One Step TB Green？誖PrimeScriptTMRt-PCR Kit（perfect real time）說明書加入反應(yīng)液，反轉(zhuǎn)錄總RNA合成cDNA及進行PCR擴增。程序設(shè)置按照試劑盒說明書。反應(yīng)條件：42℃ 5 min;95℃ 10 s;95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個循環(huán);95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。反應(yīng)結(jié)束后，用2-△△Ct法進行數(shù)據(jù)分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 24.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多個樣本均數(shù)采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 熒光倒置顯微鏡觀察各組材料的細胞生長情況

隨著時間的增加，各組細胞數(shù)量增加。見圖1。

2.2 MTT法檢測Regesi再生硅、Bio-OSS骨粉分別對MC3T3-E1細胞增殖的影響

各組MC3T3-E1細胞的增殖活性隨培養(yǎng)時間的增加而升高，在培養(yǎng)7 d時，與對照組比較，Bio-oss骨粉實驗組細胞增殖水平降低（P < 0.05）;Regesi再生硅實驗組細胞增殖水平升高（P < 0.05）。見圖2。

2.3 ALP活性

在培養(yǎng)7 d時，與對照組比較，Regesi再生硅組ALP活性升高（P < 0.05），Bio-oss骨粉實驗組ALP活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見圖3。

2.4 Rt-PCR檢測Runx2、OSX基因的表達

對照組比較，Regesi再生硅組成骨相關(guān)基因Runx2、OSX mRNA的表達升高（P < 0.05）;Bio-oss骨粉實驗組成骨相關(guān)基因Runx2、OSX mRNA的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見圖4～5。

3 討論

尋找更好的骨組織再生修復(fù)材料，為患者再造健康，是生物醫(yī)用材料研究的前沿和熱點[3-5]。Regesi再生硅材料是由溶膠-凝膠法[6-8]制備而成的一種新型生物活性玻璃，目前還沒有在臨床得到應(yīng)用。

成骨細胞經(jīng)歷了增殖、細胞外基質(zhì)分化與成熟、細胞外基質(zhì)礦化等階段成骨[9-10]。本研究選用的MC3T3-E1細胞系具有極好的成骨分化潛能，是體外研究骨細胞增殖、分化與礦化的細胞模型。在細胞的生命活動中，細胞增殖與細胞分化是兩個重要的方面[11]。本研究中，采用MTT法檢測細胞的增殖情況，結(jié)果顯示Regesi再生硅能促進成骨細胞的增殖活性，Bio-oss骨粉減弱成骨細胞的增殖活性。

在分化階段，ALP是成骨細胞分化時分泌的酶，是成骨分化早期的標(biāo)志性蛋白[12]能較客觀的反映成骨細胞的分化情況[13];Runx2和Osterix是成骨細胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在骨發(fā)育的不同階段發(fā)揮重要作用。Runx2是骨形成過程中最早和最具特征性的標(biāo)志[14]，在成骨細胞成熟早期階段發(fā)揮作用[15]。OSX是另一個重要的成骨細胞轉(zhuǎn)錄因子，影響成骨細胞的最終成熟，受Runx2的調(diào)控[16-17]，OSX只在發(fā)育中的骨組織中特異性表達，是成骨細胞分化和骨形成過程中所必需的轉(zhuǎn)錄因子[18]。Runx2和OSX在成骨細胞增殖、分化、轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用，并且參與許多骨組織相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展[19-20]。本研究中，ALP活性檢測及熒光定量PCR的結(jié)果顯示：Regesi再生硅組細胞比對照組細胞ALP活性增加，可以上調(diào)成骨相關(guān)基因Runx2、OSX mRNA的表達，與對照組比較差異有明顯統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）;Bio-oss組細胞與對照組細胞分化差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較Bio-oss骨粉會減弱成骨細胞的增殖，成骨分化能力與單純成骨細胞培養(yǎng)差異不明顯（P > 0.05），是目前臨床應(yīng)用中的較理想的支架材料;Regesi再生硅能促進小鼠成骨細胞的增殖、成骨分化，但尚未進行動物實驗，在細胞水平無法準(zhǔn)確顯示Regesi再生硅對人體骨缺損的修復(fù)作用，還需要通過動物體內(nèi)實驗進一步驗證。

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（收稿日期：2019-10.12? 本文編輯：劉永巧）

[基金項目] 中國科學(xué)院動物研究所研究項目（41426040204）。

[作者簡介] 賈琰（1994.2-），女，濰坊醫(yī)學(xué)院2017級口腔臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)在讀碩士研究生;研究方向：口腔種植學(xué)。

[通訊作者] 張保榮（1979.7-），男，博士，副主任醫(yī)師;研究方向：口腔種植學(xué)、牙周學(xué)。