菜豆組培快繁技術(shù)研究

韓啟厚等

摘 要：以雙豐3號菜豆為試驗材料，比較了種子消毒方法，篩選了快繁最佳增殖培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基及移栽基質(zhì)。結(jié)果表明，25%次氯酸鈉浸泡20 min對菜豆種子消毒效果最好；最佳增殖培養(yǎng)基為MSB5+6-BA 5.0 mg/L，14 d獲得再生芽為9.2個/外植體；最佳生根培養(yǎng)基為1/2 MSB5+IBA 0.1 mg/L，生根率達(dá)95.3%；最佳移栽基質(zhì)為草炭∶蘑菇渣=1∶1，移栽成活率為97%。

關(guān)鍵詞：菜豆；消毒；增殖；生根；移栽

菜豆（Phaseolus vulgaris L.）又稱四季豆、蕓豆、扁豆等，分為食豆和食莢兩種類型，菜豆在我國各省市均有栽培，種植范圍十分廣泛，是我國重要的糧食作物和蔬菜作物。菜豆能為人類提供豐富的蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素及礦物質(zhì)等[1]，其嫩莢尤其是人們喜食的蔬菜之一。

植物組織培養(yǎng)技術(shù)已在許多作物上得到應(yīng)用，并對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)起到巨大的推動作用，但關(guān)于菜豆組織培養(yǎng)技術(shù)的報道卻相對較少[2]，主要是由于菜豆組織的再生能力較弱，組織培養(yǎng)難度較大。因此，本試驗對菜豆組培快繁技術(shù)做了初步研究，為菜豆種質(zhì)資源保存、種質(zhì)資源創(chuàng)新、脫毒技術(shù)應(yīng)用、遺傳轉(zhuǎn)化以及優(yōu)良品種快繁等工作提供可以利用的技術(shù)平臺。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及時間、地點

供試材料為雙豐3號（天津科潤蔬菜研究所提供），試驗于2012年1月至2014年6月在天津科潤蔬菜研究所組培實驗室完成。

1.2 種子消毒

挑選籽粒均勻一致的菜豆種子，放置于玻璃容器內(nèi)。采用如下4種常見豆類種子消毒方法，并作適當(dāng)改動。T1：70%乙醇處理3 min，無菌水沖洗3次，25%次氯酸鈉溶液浸泡20 min，無菌水洗滌5～6次[3]；T2：25%次氯酸鈉處理20 min，無菌水洗滌5～6次[4]；T3：氯氣熏蒸6 h[5]；T4：氯氣熏蒸12 h[6]。

將處理種子的種臍向下接種于萌發(fā)培養(yǎng)基（MS[7]+6-BA 0.5 mg/L）中，密封好后放置于培養(yǎng)室中培養(yǎng)，每個處理50粒種子，3次重復(fù)，共600粒種子。培養(yǎng)室環(huán)境溫度為25℃，光照強度為4 000 lx，光周期為16 h光照/8 h黑暗。培養(yǎng)5～6 d即可長出幼苗，供試驗備用。

1.3 增殖培養(yǎng)

在超凈工作臺上，取生長5～6 d的2葉1心的無菌苗，放置于滅菌后的培養(yǎng)皿中，切掉胚根及2片真葉，保留葉柄，作為外植體備用。將處理好的外植體的下胚軸部分插入增殖培養(yǎng)基中，插入深度0.5 cm左右。增殖培養(yǎng)基為MSB5（將MS培養(yǎng)基中的有機成分換成B5培養(yǎng)基的有機成分，其他成分不變，縮寫為MSB5）加入不同濃度的6-BA，最終培養(yǎng)基中6-BA濃度分別為0.5、1.0、3.0、5.0 mg/L，每個培養(yǎng)瓶中3個外植體，每個處理10瓶，3次重復(fù)，共120瓶。將密封好的培養(yǎng)瓶放置于培養(yǎng)室中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上。

培養(yǎng)7 d后，再生芽長到2～3 cm切一次，記錄再生芽數(shù)量；將外植體置于相同培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，14 d后切第二次，記錄再生芽數(shù)量，最后統(tǒng)計兩次再生芽數(shù)量，篩選最佳快繁培養(yǎng)基。

1.4 再生芽的生根

切取通過快繁獲得的均勻一致的再生植株，插入含有不同濃度IBA的培養(yǎng)基中，基本培養(yǎng)基為1/2 MSB5，IBA濃度分別為0、0.1，0.3、0.5、0.7、1.0 mg/L，每個培養(yǎng)瓶接種再生芽10個，每個處理5瓶，3次重復(fù)，共90瓶。10 d后測生根率和生根數(shù)量，生根率和生根數(shù)量最多的培養(yǎng)基為最佳生根培養(yǎng)基。

1.5 組培苗的移栽

先將生根后的組培苗開蓋煉苗3～4 d，后將組培苗連瓶一起放置溫室內(nèi)煉苗3～4 d，煉苗結(jié)束后將組培苗取出，在水中除掉根部的培養(yǎng)基，盡量使再生根完整。將完整的組培苗移栽到含有不同比例基質(zhì)的營養(yǎng)缽中，基質(zhì)處理分為6種，分別為100%草炭、蛭石、蘑菇渣、草炭+蛭石（1∶1）、草炭+蘑菇渣（1∶1）、蘑菇渣+蛭石（1∶1），每個處理移栽30株組培苗，移栽完的營養(yǎng)缽放置在有塑料薄膜覆蓋的小拱棚內(nèi)，移栽后前3 d適當(dāng)向拱棚內(nèi)噴水，保證拱棚內(nèi)相對濕度達(dá)100%，3 d后逐漸放風(fēng)直至除掉拱棚，10 d后調(diào)查成活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子消毒方法的篩選

由表1可知，將4種消毒方法處理后的種子均無污染，可見4種方法均有較好的消毒效果，但對種子出芽率影響有很大差別。T2處理對發(fā)芽率影響最小，該處理下種子發(fā)芽率極顯著高于其他3個處理，T4處理對種子芽率影響最大，發(fā)芽率僅4%，極顯著低于其他3個處理。T3、T4均為氯氣熏蒸消毒，氯氣熏蒸是最近大豆種子消毒采用的方法，用其消毒對菜豆種子傷害較大。本試驗結(jié)果表明，氯氣不適用于菜豆種子消毒，而采用次氯酸鈉消毒最佳。

2.2 增殖培養(yǎng)基的篩選

從表2可看出，在本試驗范圍內(nèi)，隨著培養(yǎng)基中6-BA濃度的增加，再生芽數(shù)量不斷增加。MSB5+6-BA 5.0 mg/L培養(yǎng)基中再生芽數(shù)量在第一次和第二次均最高，顯著高于其他培養(yǎng)基，并與MSB5+6-BA 0.5 mg/L培養(yǎng)基達(dá)極顯著差異水平。第二次再生芽數(shù)量均要比第一次略低，但增長趨勢與第一次完全一致。兩次再生芽數(shù)量總和，MSB5+6-BA 5.0 mg/L培養(yǎng)基顯著高于其他培養(yǎng)基，并與MSB5+6-BA 0.5 mg/L和MSB5+6-BA 1.0 mg/L培養(yǎng)基達(dá)極顯著差異水平。從3組數(shù)據(jù)上看，MSB5+6-BA 5.0 mg/L培養(yǎng)基是最佳的快繁培養(yǎng)基，擴繁系數(shù)為9.2個/外植體。

2.3 生根培養(yǎng)基的篩選

從表3可看出，當(dāng)IBA濃度為0.1 mg/L時生根率最高，達(dá)到92.5%，顯著高于不加IBA的培養(yǎng)基，其后，隨著IBA濃度增加，生根率逐漸下降。從生根數(shù)量上看，同樣是IBA濃度為0.1 mg/L時最多，達(dá)12.3根/株。隨著IBA濃度的增加，促進了再生植株基部愈傷組織的產(chǎn)生，抑制了再生植株的生根。綜上，最佳生根培養(yǎng)基是1/2 MSB5+IBA 0.1 mg/L。

2.4 移栽基質(zhì)的篩選

從表4可以看出，無論是單一基質(zhì)還是不同基質(zhì)混配，移栽成活率均在90%左右，其中以草炭∶蘑菇渣比例為1∶1的時候成活率最高，達(dá)到了97%，可能是由于草炭和蘑菇渣的透氣性較好，并且其中都含有一定的營養(yǎng)物質(zhì)和配料，能夠充分供應(yīng)組培苗的生長，而其他基質(zhì)養(yǎng)分不夠充足或養(yǎng)分比較單一，因而導(dǎo)致移栽成活率較低，因此，草炭∶蘑菇渣=1∶1為最佳的移栽培養(yǎng)基。

3 結(jié)論與討論

種子消毒方法多種多樣，本試驗比較了國外菜豆及大豆種子常用的4種消毒方法。根據(jù)本試驗和前人的研究結(jié)果，作者認(rèn)為，氯氣穿透力較強，且操作時濃度不易精確把握，對種子刺激作用比其他方法強烈，因此氯氣熏蒸比較適合于大豆[5]等一些種皮相對較厚或?qū)β葰獠惶舾械姆N子消毒，對種子損傷小，而用在菜豆種子上則嚴(yán)重影響種子的發(fā)芽率，不適于菜豆種子消毒。次氯酸鈉消毒是菜豆種子消毒最好的選擇。菜豆種子由于產(chǎn)地及采收習(xí)慣存在差異，種皮表面污染物多少也同樣存在差異，如果種子帶菌量較多，可適當(dāng)在次氯酸鈉消毒方法上增加一些消毒步驟，消毒會更加徹底；而對于一般比較干凈的菜豆種子來講，采用次氯酸鈉消毒足以達(dá)到徹底消毒的效果。

快繁是在最短的時間內(nèi)獲得最多的再生植株，本試驗主要是利用菜豆幼苗上存在多個芽點的特點，采用6-BA刺激芽點生長產(chǎn)生叢生不定芽，達(dá)到快繁的目的，比通過愈傷組織培養(yǎng)更容易獲得再生植株[8]，增殖效率更高。隨著培養(yǎng)基中6-BA濃度的提高，再生芽數(shù)量逐漸增加，而且相同6-BA濃度第二次再生芽數(shù)量少于第一次，說明在繼代培養(yǎng)過程中器官形成能力和增殖能力有隨著培養(yǎng)代數(shù)增加而下降的趨勢，這與Crocomo等[9]結(jié)論相同。

再生植株生根是比較容易的，即使不加入任何激素其依然可生根，但一般生根少、質(zhì)量差。加入一定濃度的生長素可以促進根的生成，但生長素濃度過大會抑制生根[10]，刺激再生植株基部生成大量愈傷組織，從而阻礙了再生根的形成[11]。

組培苗移栽成活與否主要是看組培苗是否能夠適應(yīng)環(huán)境的變化，采用草炭和蘑菇渣混合基質(zhì)效果最好，主要是草炭和蘑菇渣的透氣性好，而且其中養(yǎng)分及有機質(zhì)成分也相對較高，滿足了組培苗對氧氣及養(yǎng)分的需求，因此最有利于組培苗成活。

菜豆組培快繁與常規(guī)種子繁種相比，不受時間及空間的限制，并且快繁系數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于種子繁殖。菜豆組培快繁的成功將為優(yōu)良種質(zhì)資源保存、保持種性及快速推廣提供十分有效的手段。

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Abstract： In this paper， we took common bean cultivar Shuangfeng No.3 as experiment material， and compared seed disinfection methods， in order to screen out rapid and suitable enrichment medium， rooting medium and transplanting matrix. The results showed that， the disinfection effect of treatment with 25% sodium hypochlorite for soaking 20 minutes was the best， and the most suitable enrichment medium was MSB5+6-BA 5.0 mg/L， which could obtain 9.2 regenerated buds every explant after cultured 14 days. The most suitable medium for rooting was 1/2 MSB5+IBA 0.1 mg/L， which rooting rate was above 95.3%， while the most suitable transplanting matrix was peat∶spent mushroom compost=1∶1， with transplanting survival rate of 97%.

Key words： Common bean； Disinfection； Enrichment； Rooting； Transplanting