川翠3號黃瓜SSR指紋圖譜的構(gòu)建及種子純度鑒定

楊宏等

摘 要：為了建立雜交黃瓜品種川翠3號的快速純度鑒定體系，用164對全基因組覆蓋的SSR引物對川翠3號及其親本進(jìn)行了多態(tài)性篩選及純度鑒定。其中4對引物表現(xiàn)出穩(wěn)定的共顯性，電泳圖譜清晰、易分辨，特異性強(qiáng)，對川翠3號種子鑒定純度為99.0%，真、假雜種編號與田間鑒定結(jié)果一致，可以用來區(qū)別其中混雜的母本、父本及其他種子，說明這4對引物組成的指紋圖譜能為川翠3號雜交種的真?zhèn)舞b定、純度檢測及親本提純等提供準(zhǔn)確的技術(shù)指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞：黃瓜；川翠3號；SSR指紋圖譜；純度鑒定

種子純度鑒定是保證種子質(zhì)量的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)的種子形態(tài)學(xué)鑒定、幼苗鑒定法不適用于黃瓜種子純度鑒定。田間小區(qū)種植鑒定法，周期長、費用高，無法滿足種子貿(mào)易中快速鑒定的要求，且受環(huán)境影響大，結(jié)果不夠準(zhǔn)確。DNA電泳鑒定技術(shù)為種子的純度鑒定提供了一種更為快速、高效的方法，可以彌補(bǔ)其他純度鑒定技術(shù)中的許多缺陷，具有以下優(yōu)點：在植物任何組織的任何發(fā)育時期均可用于分析；多態(tài)性位點分布廣，遺傳穩(wěn)定；不受任何環(huán)境因素的影響。

SSR引物共顯性的特點在雜交種純度鑒定具有獨特優(yōu)勢，已在水稻[1～4]、玉米[5]、棉花[6，7]、油菜[8，9]、茄子[10]、大白菜[11]、花椰菜[12]、黃瓜[13]等多種作物上應(yīng)用。SSR的位點特異性和日益豐富的標(biāo)記群體使SSR成為基因精細(xì)定位及作圖的有力工具。目前黃瓜已開發(fā)的SSR標(biāo)記已有2 000多對[14～16]，位點多，分布均勻，檢測區(qū)域覆蓋黃瓜7條染色體。利用SSR分子標(biāo)記，黃瓜葉片苦味、矮化、果實網(wǎng)紋等重要基因都能夠被定位，為克隆奠定了基礎(chǔ)[16～18]。同時，SSR分子標(biāo)記也是黃瓜種質(zhì)資源多樣性分析的重要方法之一[19，20]?？傊?， SSR標(biāo)記具有共顯性、位點特異性、位點豐富、穩(wěn)定、易操作等特點，因此成為構(gòu)建分子指紋圖譜的重要標(biāo)記。

隨著品種保護(hù)的需求增加，加之親本退化等問題嚴(yán)重，需要建立信息更豐富的骨干材料分子指紋圖譜。川翠3號是高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)華北型黃瓜新品種，對黃瓜霜霉病、白粉病等主要病害有較強(qiáng)抗性，具有較大的推廣應(yīng)用前景。本文利用SSR 分子標(biāo)記技術(shù)，構(gòu)建了川翠3號及其親本的DNA指紋圖譜，以期為該品種的權(quán)益保護(hù)、真?zhèn)舞b別、雜種純度鑒定和親本提純等提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黃瓜品種川翠3號單株100株及其親本各20株，由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所黃瓜課題組提供。供試材料于2013年7月中旬播種，7月23日定植于四川省農(nóng)科院園藝所黃瓜課題組雙流基地，露地常規(guī)栽培管理。小區(qū)種植F1植株350株，田間種植按隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，3次重復(fù)。隨機(jī)選取100株掛牌標(biāo)記編號，用于SSR分析和田間性狀調(diào)查。

1.2 試驗方法

①基因組DNA的提取 父本、母本各20株，幼嫩葉片等量混合后用CTAB法小量提取DNA。100株F1植株分單株取幼嫩葉片，分別提取DNA，且DNA試管標(biāo)記號與植株田間掛牌號一致。在1%瓊脂糖凝膠上檢測DNA質(zhì)量，并稀釋到適當(dāng)濃度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

②PCR擴(kuò)增和電泳檢測 164對全基因組覆蓋的SSR引物來自Ren等[14]、Miao等[15]公開發(fā)表信息，由上海生工生化公司合成。SSR反應(yīng)體系，總

共25 μL，包括：20 ng模板DNA，前后引物各

1.0 μmol/L，10×PCR Buffer 2.5 μL，1.0 U Taq酶，

0.2 mmol/L dNTPs。SSR擴(kuò)增體系為：94℃預(yù)變性

5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，30次循環(huán)；最后72℃延伸10 min。采用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠，180 V電泳2.5 h后檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得親本和雜交種的擴(kuò)增條帶，銀染顯色后記錄結(jié)果。SSR標(biāo)記的數(shù)據(jù)記錄根據(jù)電泳結(jié)果采用0、1系統(tǒng)描述條帶的相對位置，條帶清晰的記為1，缺失的則記為0，依據(jù)分子量從小到大的順序讀帶，不具多態(tài)性的條帶不予統(tǒng)計。

③田間純度鑒定 9月中旬對100株標(biāo)記單株進(jìn)行田間純度鑒定。田間純度鑒定方法為主要差異表型性狀比對，調(diào)查性狀有：株型、株高、葉形、節(jié)間長度、瓜形、瓜色、果實表面蠟粉、瓜把、瓜長等。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交種共顯性標(biāo)記的篩選

用164對SSR引物對親本DNA進(jìn)行擴(kuò)增，每對引物擴(kuò)增的位點為1～2個，片段大小介于100～500 bp。擴(kuò)增后電泳檢測顯示12對引物親本間有多態(tài)性，多態(tài)性比例為7.31%。其中4對引物（ssr17922、ssr07220、ssr18718、ssr02385）在F1中呈共顯性（表1），條帶清晰，親本特征片段分子量差異大于10 bp，分別位于1號、3號和6號染色體。這4對SSR引物擴(kuò)增出的條帶可以明確區(qū)分雜交種F1和親本（圖1）。這4對引物組成了川翠3號及其親本的DNA指紋圖譜（表2）。

2.2 雜交種SSR純度鑒定

利用ssr17922、ssr07220、ssr18718、ssr02385 4對引物對100株F1進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，這4對引物在99株單株中均擴(kuò)增出含雙親條帶的雜合帶型，1株為母本基因型（圖2、3）。因此，分子標(biāo)記鑒定結(jié)果表明，該100株單株中有真雜種99株，純度為99.0%，1株假雜種為母本。

2.3 雜交種田間鑒定

盛果期對100株標(biāo)記單株進(jìn)行田間鑒定，其中99株表現(xiàn)一致，所有農(nóng)藝性狀均符合川翠3號黃瓜植物學(xué)性狀描述，顯示為真雜種，1株雜株的植物學(xué)性狀與母本一致。因此，田間鑒定結(jié)果表明，該100株單株的純度為99.0%，1株假雜種為母本混雜。

3 討論與結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，田間鑒定與分子標(biāo)記鑒定結(jié)果均顯示該100株雜種群體的純度為99.0%，且假雜種田間編號與分子標(biāo)記純度鑒定的編號一致。因此，分子標(biāo)記純度鑒定方法準(zhǔn)確、有效，可代替田間純度鑒定。

研究發(fā)現(xiàn)的4對引物ssr17922、ssr07220、ssr18718、ssr02385在川翠3號黃瓜及其親本中呈共顯性，條帶清晰、穩(wěn)定、易識別，這些特殊SSR 條帶構(gòu)成了該品種及其親本的指紋圖譜。使用ssr17922、ssr07220、ssr18718、ssr02385中的任何一組引物都能準(zhǔn)確迅速地鑒定川翠3號及其親本，4組引物可以鑒別川翠3號和其他品種。川翠3號指紋圖譜的構(gòu)建不僅能為該品種真?zhèn)舞b別和材料提純提供技術(shù)支持，為黃瓜新品種的審定和保護(hù)提供重要依據(jù)，并在新品種的DUS測試和品種資源遺傳多樣性的評價等方面具有重要的應(yīng)用價值。此外，該指紋圖譜還能為川翠3號相關(guān)表型性狀基因的定位分析提供信息，縮小引物篩選范圍，同時為同類型華北型黃瓜純度鑒定提供可供選擇的標(biāo)記。

使用分子標(biāo)記開展純度鑒定迅速、準(zhǔn)確，可節(jié)省大量人力和時間。雜交種純度低不僅損害經(jīng)營企業(yè)的聲譽(yù)和利益，縮短品種的推廣年限，還會導(dǎo)致產(chǎn)量下降，影響農(nóng)民收益。目前，種子公司經(jīng)常采用的鑒定方法是將當(dāng)年生產(chǎn)的雜交種抽樣到海南南繁基地進(jìn)行田間純度檢測，形態(tài)性狀易受氣候條件和栽培措施等方面的影響，準(zhǔn)確性較差，而且成本高、時間長。本試驗中，田間純度鑒定從播種到盛果期進(jìn)行植物學(xué)性狀調(diào)查，耗時2個月，且催芽、育苗、整地、定植、田間管理、植物學(xué)性狀調(diào)查等需要大量人工，而應(yīng)用分子標(biāo)記進(jìn)行純度鑒定需要催芽、提取DNA、PCR和凝膠電泳，選取1對引物進(jìn)行分析鑒定，整個周期約1周，且鑒定結(jié)果準(zhǔn)確，不受環(huán)境影響。

本研究中，親本間多態(tài)性引物僅占164對引物的7.31%，表明川翠3號黃瓜親本間遺傳背景較窄。性狀調(diào)查表明，該品種親本間差異僅能通過瓜色、瓜形的差異來判斷，容易誤判并且在無瓜情況下很難判斷品種真實性。使用SSR分子標(biāo)記能大大提高純度鑒定的準(zhǔn)確性，是窄遺傳背景雜交種子純度鑒定的有效方法。

參考文獻(xiàn)

[1] 彭鎖堂，莊杰云，顏啟傳，等.我國主要雜交水稻組合及其親本SSR標(biāo)記和純度鑒定[J].中國水稻科學(xué)，2003，17（1）：1-5.

[2] 徐艷芳，向殉朝，張艷麗，等.SSR技術(shù)對雜交稻種岡優(yōu)

188的純度鑒定[J].種子，2012，31（7）：126-128.

[3] 趙虹，徐國華，廖芳麗.SSR分子標(biāo)記技術(shù)在雜交水稻種子純度鑒定中的作用[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，50（17）：

3 490-3 491.

[4] 趙虹，張宇飛，林梅，等.SSR鑒定水稻兩系雜交種純度的運用與探討Ⅳ.不同品種同一引物檢測試驗[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，51（21）：4 720-4 721.

[5] 李曉輝，李新海，李文華，等.SSR標(biāo)記技術(shù)在玉米雜交種種子純度測定中的應(yīng)用[J].作物學(xué)報，2003，29（1）：63-68.

[6] 郎需勇，吳建功，楊亮，等.SSR分子標(biāo)記技術(shù)在雜交棉純度鑒定中的應(yīng)用[J].中國棉花，2012，39（9）：17-20.

[7] 葛瑞華，田東洋，袁小玲，等.湘農(nóng)大棉1號的SSR數(shù)字指紋圖譜構(gòu)建及純度鑒定[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2012，28（6）：79-83.

[8] 張寧潔，陳麗，朱文秀，等.SSR標(biāo)記在油菜隱性核不育雜交種的純度鑒定研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（11）：

6 376-6 377.

[9] 曲亮，陳衛(wèi)江，李莓，等.SSR標(biāo)記技術(shù)在甘藍(lán)型油菜雜交種純度鑒定中的應(yīng)用[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2009，35（3）：229-232.

[10] 王利英，喬軍，石瑤，等.茄子SSR多態(tài)性引物的篩選及品種純度鑒定[J].華北農(nóng)學(xué)報，2012，27（4）：98-101.

[11] 管志坤，羅雙霞，李艷霞，等.利用SSR標(biāo)記鑒定油綠3號大白菜品種純度[J].種子，2011，30（9）：34-35.

[12] 趙新，文正華，王永，等.花椰菜雜交種科潤F1代種子純度的EST-SSR鑒定[J].種子，2012，31（5）：119-122.

[13] 張桂華，李家旺，張文珠，等.利用SSR 技術(shù)對黃瓜新品種津優(yōu)35 號進(jìn)行種子純度鑒定[J].北方園藝，2010（12）：140-141.

[14] Ren Y， Zhang Z H， Lui J H， et al. An integrated genetic and cytogenetic map of the cucumber genome[J]. PLoS One， 2009（6）： 1-8.

[15] Miao H， Zhang S P， Wang X W， et al. A linkage map of cultivated cucumber （Cucumis sativus L.） with 248 microsatellite marker loci and seven genes for horticulturally important traits[J]. Euphytica， 2011， 182：167-176.

[16] Zhang W W， Pan J S， He H L， et al. Construction of a high density integrated genetic map for cucumber （Cucumis sativus L.）[J]. Theor Appl Genet， 2012， 124：249-259.

[17] Li Y H， Yang L M， Pathak M， et al. Fine genetic mapping of cp： a recessive gene for compact （dwarf） plant architecture in cucumber， Cucumis sativus L.[J]. Theor Appl Genet， 2011， 123： 973-983.

[18] Zhang S P， Miao H， Yang Y H， et al. A major quantitative trait locus conferring resistance to fusarium wilt was detected in cucumber by using recombinant inbred lines[J]. Mol Breeding， 2014， 34（4）： 1 805-1 815.

[19] Hu J， Wang L， Li J. Comparison of genomic SSR and EST-SSR markers for estimating genetic diversity in cucumber[J]. Biologia Plantarum， 2011， 55： 577-580.

[20] Pandey S， Ansari W A， Mishra V K， et al. Genetic diversity in Indian cucumber based on microsatellite and morphological markers[J]. Biochemical Systematics and Ecology， 2013， 51： 19-27.

Abstract： In order to establish fast purity identification system for hybrid cucumber cultivar Chuancui No.3 seed， we used 164 pairs SSR primers which covered whole genome for purity identification and polymorphic analysis of cucumber cultivar Chuancui No.3 and its parents. The results showed that， four primers were stably codominant， their electrophoretogram were clear， easy to distinguish， and had high specialty， its molecular marker identification purity was 99.0% by detecting some cucumber cultivar Chuancui No.3 seeds， which was the same as the field identification result，they could be used to distinguish medley female parent， male parent and other seeds. So， the fingerprint with these four pairs primers could provide more accurate technical guidance for authenticity identification， purity test and parents purification of hybrids.

Key words： Cucumber； Chuancui No.3； SSR fingerprint； Purity identification