新型吡唑啉衍生物合成與抑菌活性實(shí)驗(yàn)研究

羅杰偉，程登龍，鐘 月，劉沂明，朱 紅*

(1.川北醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川 南充 637000；2.川北醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，四川 南充 637000)

傳染病仍然是當(dāng)今嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的疾病。在抗感染治療中，抗菌藥物的發(fā)現(xiàn)及使用為人類(lèi)的健康帶來(lái)了福音。但隨著細(xì)菌耐藥性的不斷出現(xiàn)，甚至超級(jí)細(xì)菌的出現(xiàn)，使抗菌治療不斷受到新的挑戰(zhàn)，人類(lèi)生命受到嚴(yán)重威脅，研究者也在不斷尋找和研制新的抗菌藥物的征途上不斷進(jìn)取。文獻(xiàn)表明[1-3]，吡唑啉化合物因具有廣泛的生物學(xué)活性如消炎、止痛、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等作用而受到關(guān)注，已經(jīng)成為合成化學(xué)殺菌劑的重要研究對(duì)象,因此吡唑啉化合物將具有非常好的應(yīng)用前景。

吡唑啉化合物是一類(lèi)具有廣泛生物活性的物質(zhì)，此類(lèi)化合物因具有如抗菌、抗炎、抗腫瘤等活性在醫(yī)藥生產(chǎn)中具有重要的用途，長(zhǎng)期以來(lái)受到業(yè)內(nèi)關(guān)注[4]。早在19世紀(jì)后期，F(xiàn)ischer E等采用丙烯醛與苯肼合成出吡唑啉類(lèi)化合物，在之后的很長(zhǎng)一段時(shí)間里，采用α，β-烯酮類(lèi)(醛)化合物與肼類(lèi)化合物合成了很多吡唑啉類(lèi)衍生物。自20世紀(jì)70年代Ankhiwala M D等[5]報(bào)道了某些取代的吡唑啉化合物具有優(yōu)良的殺菌活性和Makino K等[6]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在1-位氮原子上引入磺?；珊Y選出除草活性較強(qiáng)的化合物后，許多新型吡唑啉類(lèi)化合物在醫(yī)藥中的應(yīng)用產(chǎn)生了良好的效果。吡唑啉環(huán)是不同生物活性的重要結(jié)構(gòu)單元，且取代基在環(huán)上不同位置變換可明顯影響其生物活性。如楊金美等[7]報(bào)道了幾種酰代吡唑啉酮金屬配合物具有抑菌活性；Turan-Zitounia G等[8]發(fā)現(xiàn)含硫雜環(huán)2-吡唑啉化合物呈現(xiàn)較強(qiáng)的抗菌活性。此外，王瑾玲等[9-10]報(bào)道了一些?；吝蜻衔锖蚘oshioka Koichi等[11]報(bào)道了一些吡唑烷酮類(lèi)化合物也具有殺菌性能，而趙軍龍等[12-13]報(bào)道了含二茂鐵基吡唑啉具有較好的抗真菌活性?；谝陨涎芯浚菊n題組根據(jù)α,β-不飽和醛酮親核加成反應(yīng)原理合成化合物L(fēng){[3-(4-N,N-dimethyl-pyenyl)-5-Anthracen-9-yl]-Pyrazoline}和化合物M[3-ferroceny-5-(Anthr acen-9-yl)-Pyrazoline]，并利用1H NMR、13C NMR對(duì)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征,測(cè)定化合物L(fēng)和化合物M對(duì)金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、大腸桿菌、痢疾桿菌、白色念珠菌、新型隱球菌的抑菌效果。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

瓊脂粉，分析純；蛋白胨，北京OXOID公司；酵母提取物，北京OXOID公司；沙保羅氏瓊脂，杭州濱和微生物試劑有限公司。其余所用試劑均為化學(xué)純或分析純,實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)、乙型溶血性鏈球菌、大腸桿菌(8099)、痢疾桿菌、白色念珠菌和新型隱球菌均由川北醫(yī)學(xué)院病原實(shí)驗(yàn)中心提供。

恒溫空氣浴搖床，哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠；生物安全柜，美國(guó)BIO-RAD公司；SHP-150型生化培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌比濁管，北京哲成科技有限公司。

1.2 合成路線

圖1為化合物L(fēng)與化合物M的合成路線。

1.3 合成步驟

1.3.1 化合物L(fēng)的合成與結(jié)構(gòu)表征

氮?dú)獗Ｗo(hù)下將化合物1(參考文獻(xiàn)[14]的方法合成)(2.55 g、7.1 mmol)加入20 mL無(wú)水乙醇與5 mL冰乙酸混合液中，緩慢滴加水合肼(0.82 g、16.4 mmol),常溫?cái)嚢?0 min使其混合均勻。加熱至70 ℃回流8 h，冷卻至常溫，用CH2Cl2萃取3次，合并有機(jī)相，無(wú)水Na2SO4干燥，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干得黃色固體，粗品經(jīng)柱層析純化(石油醚與乙酸乙酯體積比為4∶1)，得到黃色粉末狀物質(zhì)1.02 g，產(chǎn)率為40%，熔點(diǎn)為(180～184) ℃。

將化合物L(fēng)提純，充分干燥，選擇CDCl3為氘代溶劑，將帶有樣品的核磁管裝入核磁測(cè)定儀器中，鎖定氘代溶劑吸收峰，掃描并收集信號(hào)。1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ(ppm):3.0(s,J=5.5 Hz,6H,-CH3),5.25(s,1H,-CH-),6.61(d,2H,-CH2-),7.15(s,1H,Ar-H,),7.28(d,2H,Ar-H),7.42～7.58(m,5H,Ar-H),7.95(d,2H,Ar-H),8.15(d,2H,Ar-H)，8.55(s,1H,Ar-H)。13C NMR(CDCl3,400 MHz)δ(ppm):40.07，111.67，121.76，124.31～135.54，149.36，152.27，200.01。

圖1 化合物L(fēng)與化合物M的合成路線Figure 1 Synthesis routes of compounds L and M

1.3.2 化合物M的合成與結(jié)構(gòu)表征

氮?dú)猸h(huán)境下將化合物2(參考文獻(xiàn)[14]的方法合成)(2.68 g、7.1 mmol)加入20 mL無(wú)水乙醇和5 mL冰乙酸的混合液中，緩慢滴加水合肼(0.81 g,16.4 mmol),常溫?cái)嚢?0 min使其混合均勻。加熱至70 ℃回流8 h，冷卻至常溫，用CH2Cl2萃取3次，合并有機(jī)相，無(wú)水Na2SO4干燥，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，粗品經(jīng)柱層析純化(石油醚與乙酸乙酯體積比為3∶1)，得到黃色固1.52 g，產(chǎn)率為56.72%，熔點(diǎn)為(250～255) ℃。

1.4 抑菌活性實(shí)驗(yàn)

1.4.1 制備LB培養(yǎng)液及LB平板

按照LB培養(yǎng)液的常規(guī)制作方法，分別稱(chēng)取蛋白胨和酵母提取物，加入三角燒瓶中，加雙蒸水(DW)100 mL加熱溶解后，再加雙蒸水，調(diào)節(jié)pH值，按需分裝后高壓滅菌(15磅，15 min)，即制得LB培養(yǎng)液。

稱(chēng)取2 g瓊脂粉放入加有100 mL的LB培養(yǎng)液的三角燒瓶中，高壓滅菌(15磅，15 min)，取出后稍冷倒板，即制得LB平板，備用。相似方法制備沙氏培養(yǎng)基及血清平板。

1.4.2 配備藥物溶液

將化合物L(fēng)與化合物M干燥，稱(chēng)取0.037 5 g化合物L(fēng)和0.043 2 g化合物M，置于100 mL容量瓶中，加乙腈溶解，制備成濃度1.0×10-3mol·L-1儲(chǔ)備液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 制備菌懸液

將-70 ℃保存的金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、大腸桿菌、痢疾桿菌、白色念珠菌和新型隱球菌菌種取出，室溫解凍。接種環(huán)焚燒滅菌分別取細(xì)菌分區(qū)劃線接種于適宜平板，37 ℃培養(yǎng)18 h，用無(wú)菌接種環(huán)取單個(gè)菌落接種于5 mL的LB培養(yǎng)液中，37 ℃水浴，180 rpm振搖培養(yǎng)18 h。參照標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌比濁管，用無(wú)菌pH=7.2磷酸鹽緩沖液(PBS液)制備成菌濃度(5.0×105～5.0×106) cfu·mL-1的菌懸液[15]。

1.4.4 抑菌實(shí)驗(yàn)

分別取0.1 mL菌懸液均勻涂布于適宜平板表面，自然干燥，每個(gè)平板放置兩個(gè)牛津杯，輕壓固定，分別吸取0.2 mL化合物L(fēng)的乙腈溶液及化合物M的乙腈溶液加入不同的牛津杯中，37 ℃培養(yǎng)20 h后觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，測(cè)量抑菌圈的直徑[16]。試驗(yàn)同時(shí)設(shè)置乙腈溶液作用組、正常LB培養(yǎng)液對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果與討論

化合物L(fēng)與化合物M對(duì)不同微生物的抑菌效果觀察結(jié)果如表1所示。

表1 化合物L(fēng)與化合物M對(duì)不同微生物的抑菌效果觀察結(jié)果

表1的抑菌結(jié)果顯示，空白乙腈作用組、LB培養(yǎng)液對(duì)照組的細(xì)菌生長(zhǎng)良好，細(xì)菌生長(zhǎng)未受影響；化合物L(fēng)對(duì)金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、大腸桿菌、痢疾桿菌均有一定的抑菌作用，且對(duì)金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌的抑菌作用強(qiáng)于大腸桿菌和痢疾桿菌?；衔颩對(duì)金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌和大腸桿菌和痢疾桿菌也有一定的抑菌作用，其抑制金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌的作用略強(qiáng)于大腸桿菌、痢疾桿菌。比較兩者對(duì)細(xì)菌的作用結(jié)果(抑菌圈直徑的大小)，化合物L(fēng)的抑菌作用明顯強(qiáng)于化合物M，原因可能是化合物L(fēng)的吡唑啉環(huán)連接N、N-二甲基苯環(huán)增強(qiáng)了抑菌活性。兩種化合物對(duì)白色念珠菌和新型隱球菌(真菌)均無(wú)抑制作用。

3 結(jié) 論

(1) 吡唑啉化合物對(duì)多種細(xì)菌均有不同程度的抑制作用，抑菌機(jī)理主要是抑制菌體糖及代謝中間產(chǎn)物的氧化和脫氫，并能抑制蛋白和核酸的合成，可避免臨床上某些抗菌素的毒副反應(yīng)及耐藥性。抗菌實(shí)驗(yàn)顯示，化合物L(fēng)的抑菌作用明顯強(qiáng)于化合物M，原因可能是化合物L(fēng)的吡唑啉環(huán)連接N、N-二甲基苯環(huán)增強(qiáng)了抑菌活性。

(2) 金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌是一種典型的革蘭氏陽(yáng)性菌；大腸桿菌、痢疾桿菌是革蘭氏陰性菌的代表；而白色念珠菌、新型隱球菌則是一種單細(xì)胞真菌。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，化合物L(fēng)和化合物M對(duì)典型革蘭氏陽(yáng)性菌和典型革蘭氏陰性菌有一定的抑菌效果，對(duì)真核細(xì)胞型微生物作用不明顯。但由于化合物L(fēng)的乙腈溶解性及水溶解性均較化合物M差，表明化合物L(fēng)的實(shí)際抑菌效果可能比實(shí)驗(yàn)結(jié)果還要強(qiáng)一些。