犬圓環(huán)病毒Cap蛋白的生物信息學(xué)分析及原核表達(dá)

汪 偉，辛佳亮，杜 倩，韓知曉，易馳喆，閉璟珊，曹 亮，莊忻雨，張 赫，鄭 敏，孫文超,4，魯會(huì)軍,4，金寧一1,,4

（1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530004；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事獸醫(yī)研究所，長(zhǎng)春130122；3.廣西動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，南寧530000；4.溫州大學(xué)病毒學(xué)研究所，溫州 325035）

犬圓環(huán)病毒（Canine circovirus，CanineCV）屬于環(huán)狀病毒科（Circoviridae）環(huán)狀病毒屬，是一種二十面體對(duì)稱(chēng)、無(wú)囊膜包裹的單鏈環(huán)狀DNA病毒。CaineCV的基因組全長(zhǎng)為2064 bp或2063 bp，包含兩個(gè)主要的開(kāi)放閱讀框，分別編碼復(fù)制酶蛋白（Rep蛋白）和衣殼蛋白（Cap蛋白）。CaineCV于2012年在美國(guó)被首次報(bào)道[1]，隨后陸續(xù)在意大利、德國(guó)以及中國(guó)被發(fā)現(xiàn)[2-3]。Li等[4]在淋巴結(jié)和脾臟有明顯炎癥或血管損傷的病犬體內(nèi)檢測(cè)到CaineCV；在意大利，Decaro等[2]從養(yǎng)殖場(chǎng)犬繁殖舍中一條死于急性腸炎的幼犬體內(nèi)檢測(cè)到CanineCV。目前，CanineCV被懷疑是引起犬淋巴結(jié)肉芽腫和壞死性血管炎的致病因子，犬感染CanineCV的主要臨床癥狀為嘔吐、出血性腹瀉等[2]。電鏡檢查和病理學(xué)剖檢發(fā)現(xiàn)，CanineCV與圓環(huán)病毒屬的其他成員相似，主要侵害淋巴細(xì)胞，這與其同屬成員PCV2引起豬皮炎與腎病綜合征的臨床癥狀高度相似[5-10]。目前尚無(wú)病例或報(bào)道證實(shí)CanineCV單獨(dú)感染能引起動(dòng)物發(fā)病。2016年，孫文超等[3,11-12]在我國(guó)首次發(fā)現(xiàn)了該病毒并建立了熒光定量方法；流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果證實(shí)，我國(guó)與歐美流行的CanineCV毒株處于兩個(gè)不同的分支。目前，對(duì)CaineCV的研究尚無(wú)進(jìn)展，其致病性以及致病機(jī)理不明確，尚沒(méi)有針對(duì)該種病毒的ELISA檢測(cè)方法和可提供完全保護(hù)的中和抗體，給臨床防控帶來(lái)了巨大困難。CanineCV ORF2包含813個(gè)核苷酸，編碼由270個(gè)氨基酸組成的Cap蛋白[1]。本研究以該病毒的基因組序列為參考模板，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增完整的ORF2序列，并在線預(yù)測(cè)ORF2的核定位信號(hào)（nuclear localization sequence，NLS），切除了其N(xiāo)端由26個(gè)氨基酸序列構(gòu)成的NLS，并將缺失后的ORF2序列克隆至pET-28a載體，通過(guò)大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)缺失NLS的ORF2基因，制備針對(duì)CaineCV的ELISA檢測(cè)方法以及對(duì)Cap在病毒感染中的作用進(jìn)行深入研究。

1 材料與方法

1.1 菌株、載體、細(xì)胞和試劑 pGEM-T載體購(gòu)自Promega公司；DL2000 DNA marker、感受態(tài)細(xì)胞DH5α、BL21（DE3）、血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；蛋白胨、酵母粉、瓊脂粉、瓊脂糖、卡那霉素等均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì) 以GenBank 公布的XF16株序列（GenBank登錄號(hào)：MF797786.1）為參考，設(shè)計(jì)擴(kuò)增ORF2全長(zhǎng)引物以及缺失NLS的ORF2 引物。全長(zhǎng)上游引物Cap F（BamHI）：5'- CGGGATCCATG CGCGTACGAAGACATG-3'，d-cap上游引物F（BamHI）：5'- CGCGGATCCCAAAACAATTTC AAACTGTT -3'，下游引物R（XhoI）：5'-CCCTC GAGCAACTGTCGACCAGTTTCATAA-3'，目的片段大小為813 bp和735 bp，引物由吉林省庫(kù)美生物科技有限公司合成。

1.3 基因組提取 參照血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 基因克隆 以基因組樣品為模板，分別使用全長(zhǎng)引物和切除NLS的引物進(jìn)行PCR，設(shè)置反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s；57℃退火15 s；72℃延伸45 s；30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min。瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，回收純化后連入pGEM-T載體，12℃連接12 h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α，37℃培養(yǎng)1 h，將菌液均勻涂在固體LB（含卡那霉素）平板上培養(yǎng)12 h，挑取單菌落至LB（含卡那霉素）培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，次日提取質(zhì)粒并酶切鑒定，陽(yáng)性克隆送至吉林省庫(kù)美生物科技有限公司測(cè)序，兩種正確的質(zhì)粒分別命名為pT-Cap和p（1-26）T-Cap。

1.5 生物信息學(xué)分析 使用MEGA7將CanineCV的ORF2基因序列與GenBank公布的序列進(jìn)行比對(duì)，使用最大似然法（ML）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)；將測(cè)序結(jié)果上傳至NLStradamus（http://www.moseslab.csb.utoronto.ca/NLStradamus/），在線預(yù)測(cè)CanineCV的ORF2的B細(xì)胞抗原表位、NLS和糖基化位點(diǎn)。

1.6 原核表達(dá)載體的構(gòu)建 將測(cè)序正確的pT-Cap和p（1-26）T-Cap及pET-28a載體分別經(jīng)XhoI和BamHI雙酶切，電泳鑒定后回收酶切產(chǎn)物，16℃連接6 h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)DH5α，菌液涂布在固體LB（含卡那霉素）平板上培養(yǎng)14 h。取單菌落至LB（含卡那霉素）培養(yǎng)基中培養(yǎng)，12 h后提取質(zhì)粒并酶切鑒定，陽(yáng)性質(zhì)粒送吉林省庫(kù)美生物科技有限公司測(cè)序測(cè)序，將測(cè)序正確的樣品分別標(biāo)記為pET-Cap和pET-d（1-26）Cap。

1.7 重組蛋白的原核表達(dá) 將兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞后，涂布在固體LB（含卡那霉素）平板上培養(yǎng)12 h。從平板上挑取單菌落至LB（含卡那霉素）培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，將母液按1∶600的比例接種到LB培養(yǎng)液中，培養(yǎng)至D600值為0.8左右，加入終濃度為0.6 mmol/L的IPTG，取不同時(shí)間點(diǎn)收樣。

1.8 Western blot鑒定誘導(dǎo)產(chǎn)物 樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后，通過(guò)轉(zhuǎn)印將蛋白轉(zhuǎn)移至膜上，常溫下封閉1 h，加入Anti-His（Mouse）抗體常溫下孵育2 h, 搖床上用洗滌液洗3次，加入HPR 標(biāo)記的羊抗鼠二抗孵育1 h，TBST洗3次，AEC顯色。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)分析 根據(jù)GenBanck上面公布的CanineCV的序列，進(jìn)行同源性比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)（圖1），結(jié)果表明本次獲取的CanineCV的Cap蛋白序列與2016年孫文超等[3-4]獲取的JZ98/2014株處在同一分支并且同源性最高，而于意大利、美國(guó)、英國(guó)等分離的毒株同源性較低，且處在不同的分支，這表明，我國(guó)流行的CanineCV毒株與歐美各國(guó)發(fā)現(xiàn)的CanineCV毒株處于兩個(gè)不同的進(jìn)化方向，存在一定的地理隔離，但不同毒株的Cap蛋白同源性均在80%以上，這表明CanineCV的Cap蛋白保守性較高。將序列上傳至網(wǎng)站NLStradamus上，在線預(yù)測(cè)CanineCV的Cap蛋白核定位信號(hào)、糖基化位點(diǎn)和B細(xì)胞表位，見(jiàn)圖2，分析發(fā)現(xiàn)CanineCV的Cap蛋白N端的第2個(gè)至第26個(gè)氨基酸組成其核定位信號(hào)，這表明CanineCV的Cap蛋白可以進(jìn)入宿主細(xì)胞的細(xì)胞核；糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果表明CanineCV的Cap蛋白含有一個(gè)N—糖基化位點(diǎn)（第134位氨基酸）和兩個(gè)O—型糖基化位點(diǎn)（第169和第238位氨基酸），其中第134位氨基酸和第238氨基酸在不同毒株之間高度保守，而第169氨基酸則表現(xiàn)出明顯的毒株差異和地區(qū)差異；通過(guò)在線預(yù)測(cè)B細(xì)胞表位并結(jié)合蛋白親水性及表面可能性分析，推測(cè)CanineCV的Cap蛋白有3個(gè)可能的抗原表位（表1），而在這三個(gè)表位區(qū)域CanineCV Cap蛋白的保守性較高，這有利于Cap蛋白通用型抗體的制備。

圖1 基于Cap基因序列同源性構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree based on Cap gene sequence homology

表1 Cap潛在B細(xì)胞表位分析Table 1 Cap potential B cell epitope analysis

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 將pT-Cap和pT-d(1-26) Cap質(zhì)粒以及pET-28a載體分別經(jīng)XhoI和BamHI雙酶切后，瓊脂糖電泳鑒定正確。膠回收純化后4℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化Trans 5α。將菌液涂布在含有卡那霉素的LB平板上，培養(yǎng)12 h后挑菌。挑取單菌落用液體LB培養(yǎng)12 h，篩選雙酶切（圖3）及測(cè)序均正確的陽(yáng)性質(zhì)粒，陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pET(28a)-Cap和pET(28a)-d(1-26) Cap。

圖2 GX2017與參考毒株ORF2功能區(qū)序列對(duì)比Fig.2 Alignment of amino acid sequences of encoding region of ORF2 between GX2017 and reference strain

圖 3 pET-Cap 和 pET-d（1-26）Cap 雙酶切鑒定Fig.3 Identification of pET-Cap and pET-d(1-26) Cap by double digestion

2.3 原核表達(dá)產(chǎn)物的鑒定 在轉(zhuǎn)有重組質(zhì)粒的BL21感受態(tài)細(xì)胞中加入終濃度0.5 mmol/L的IPTG，置于37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)，7 h后取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳。將菌液超聲裂解，取上清液和沉淀進(jìn)行SDSPAGE分析鑒定，見(jiàn)圖4。通過(guò)與空載體和0 h的誘導(dǎo)產(chǎn)物對(duì)比，轉(zhuǎn)有pET(28a)-Cap重組質(zhì)粒的重組菌不能表達(dá)帶有His標(biāo)簽的Cap蛋白，而轉(zhuǎn)有重組質(zhì)粒pET(28a)-d(1-26)Cap的重組菌能正確表達(dá)帶有His標(biāo)簽的截短的d(1-26)Cap蛋白，而條帶大小約為34 kDa，與預(yù)期相符。重組d(1-26)Cap蛋白主要集中在沉淀中，表明該重組蛋白主要以包涵體的形式表達(dá)。

2.4 原核表達(dá)產(chǎn)物的Wstern blot鑒定 在SDS-PAGE電泳后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上后，用Anti-His標(biāo)簽抗體檢測(cè)帶有His標(biāo)簽的重組d(1-26)Cap蛋白的反應(yīng)原性，見(jiàn)圖5，結(jié)果表明，重組菌的表達(dá)產(chǎn)物能與Anti-His標(biāo)簽抗體發(fā)生特異性結(jié)合，這表明帶有His標(biāo)簽的重組d(1-26)Cap蛋白得到正確表達(dá)。

3 討論

2012年Kapoor等[1]首次發(fā)現(xiàn)犬圓環(huán)病毒以來(lái)，世界各國(guó)均陸續(xù)發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了犬感染CanineCV的病列，Li等[4]對(duì)多只感染了CanineCV的死亡犬進(jìn)行了尸檢，組織病理學(xué)分析表明病死犬均患有壞死性血管炎和多灶性出血，部分病死犬還患有淋巴結(jié)炎和肉芽腫。這與其同屬成員PCV2感染的臨床癥狀相似[6-13]，尤其與PCV2引起的豬皮炎與腎病綜合征高度相似。Thaiwong 等[13]在出血性腹瀉的病犬體內(nèi)的淋巴壞死灶和肉芽腫病灶中檢測(cè)到高滴度的CanineCV。

圖4 SDS-PAGE電泳分析蛋白表達(dá)Fig.4 SDS-PAGE analysis of protein expression

圖5 d（1-26）Cap蛋白Western blot鑒定Fig.5 Western blot analysis of the d(1-26)Cap proteins

目前，美國(guó)、意大利、德國(guó)和中國(guó)等國(guó)家已陸續(xù)檢測(cè)到CanineCV，并進(jìn)行了全基因組序列測(cè)序。2016年，孫文超等[3-4]首次從犬血清中樣品檢測(cè)出CanineCV病毒，遺傳進(jìn)化分析表明我國(guó)報(bào)道的CanineCV毒株與歐美各國(guó)發(fā)現(xiàn)的毒株位于不同的進(jìn)化分支[14]。目前可以確定CanineCV可導(dǎo)致犬出現(xiàn)脈管炎、壞死性淋巴結(jié)炎等。通過(guò)病理學(xué)剖檢和電鏡檢查發(fā)現(xiàn)，CanineCV與圓環(huán)病毒屬的其他成員相似，均以淋巴細(xì)胞為主要侵害細(xì)胞，這表明CanineCV 的致病機(jī)制與其同屬成員PCV2相似[15]。CanineCV與其他病毒一起協(xié)同作用，混合感染患病動(dòng)物，目前尚無(wú)證據(jù)表明CanineCV單獨(dú)感染能引起動(dòng)物患病。CanineCV主要其他病原體共感染，CanineCV可能會(huì)損傷宿主免疫系統(tǒng)，造成免疫抑制，從而為其他病原體的感染和增殖提供便利，導(dǎo)致臨床疾病加重。已報(bào)道的CanineCV的基因組長(zhǎng)度均為2063 bp，包含兩個(gè)編碼框，其中含有813 bp 堿基編碼框ORF2編碼病毒的衣殼蛋白Cap蛋白，其分子量大小約為30 kDa。Cap蛋白作為病毒唯一的結(jié)構(gòu)蛋白，主要參與病毒基因組的保護(hù)和病毒的感染，張?chǎng)蔚萚5]通過(guò)構(gòu)建Cap 蛋白和Rep 蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒，通過(guò)共轉(zhuǎn)染發(fā)Cap蛋白和Rep蛋白存在共定位現(xiàn)象并持續(xù)周期，推測(cè)Rep蛋白與Cap蛋白在病毒復(fù)制過(guò)程發(fā)揮協(xié)同作用[13,15-16]。

目前研究表明，PCV2感染后可以誘導(dǎo)Cap蛋白和Rep蛋白的產(chǎn)生，其中Cap蛋白包含主要的抗原中和表位，具有良好的免疫原性[9,17-18]，但是存在體外表達(dá)難度大、表達(dá)量低的缺點(diǎn)，其次針對(duì)PCV2的疫苗產(chǎn)生的抗體主要針對(duì)Cap蛋白，不利于臨床檢測(cè)區(qū)分疫苗免疫與自然感染之間的鑒別診斷問(wèn)題。已有研究表明CanineCV的Cap蛋白較為保守，通過(guò)對(duì)Genbank上公布的CanineCV的Cap蛋白序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)Cap蛋白的同源性較高。通過(guò)在線預(yù)測(cè)Cap蛋白的糖基化位點(diǎn)和B細(xì)胞表位發(fā)現(xiàn)，不同毒株之間的細(xì)胞表位的氨基酸序列同源性較高，這有利于制備CanineCV的通用型亞單位疫苗。

自2012年首次報(bào)道CanineCV后，歐美各國(guó)已逐步開(kāi)展對(duì)CanineCV的研究，然而至今對(duì)其臨床癥狀、病理特征、致病機(jī)制及檢測(cè)手段尚無(wú)明確報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以CanineCV基因組為模板，成功擴(kuò)增出病毒的Cap蛋白序列，并在線預(yù)測(cè)了其核定位信號(hào)序列、糖基化位點(diǎn)以及B細(xì)胞表位，同時(shí)構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，發(fā)現(xiàn)CanineCV的Cap蛋白保守性較高，但是國(guó)內(nèi)流行的CanineCV毒株與歐美國(guó)家發(fā)現(xiàn)的毒株在進(jìn)化上處于兩個(gè)不同的分支，但是Cap蛋白的B細(xì)胞表位區(qū)域的氨基酸序列同源性非常高，這有利于制備CanineCV Cap蛋白的通用性抗體。隨后構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET(28a)-Cap和pET(28a)-d(1-26)Cap。SDS-PAGE分析表明Cap蛋白不能在BL21(DE3)細(xì)胞內(nèi)正確表達(dá)，而缺失了核定位信號(hào)的d(1-26)Cap蛋白能在BL21(DE3)細(xì)胞內(nèi)正確表達(dá)。Western blot鑒定結(jié)果表明帶有His標(biāo)簽的重組d(1-26)Cap蛋白能以包涵體的形式在重組菌中獲得高效表達(dá)。該重組蛋白可用于制備Cap蛋白的抗體，為制備CanineCV的ELISA檢測(cè)試劑盒及CanineCV的亞單位疫苗奠定了基礎(chǔ)。