頂復(fù)門原蟲γ-氨基丁酸代謝旁路研究進(jìn)展

胡俊菁，戚南山，吳彩艷，李 娟，呂敏娜，林栩慧，于林增，張健騑，廖申權(quán)，孫銘飛

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所 廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，廣州 510640）

頂復(fù)門原蟲是一大類細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲，包括瘧原蟲（Plasmodiumspp.）、剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）、隱孢子蟲（Cryptosporidiumspp.）、巴貝斯蟲（Babesiaspp.）和艾美耳球蟲（Eimeriaspp.）等多種重要病原體[1]。能量代謝是寄生原蟲生存所必須，頂復(fù)門原蟲在不同生活階段其寄生環(huán)境有所不同，獲取能量底物的種類、數(shù)量及能量代謝方式也存在差異[2]。胞內(nèi)寄生原蟲可以利用多種途徑獲得能量，其內(nèi)生發(fā)育階段主要處于低氧或無(wú)氧環(huán)境，糖酵解（glycolysis）是獲取能量的主要途徑之一，其次是利用多個(gè)途徑的代謝產(chǎn)物進(jìn)入三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA）產(chǎn)生ATP[3-5]。其中γ-氨基丁酸代謝旁路（γ-aminobutyric acid shunt，GABA shunt）作為TCA循環(huán)的補(bǔ)充途徑，為弓形蟲和瘧原蟲的生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖提供能量?jī)?chǔ)備及部分碳骨架，具有重要的生物學(xué)意義[6-8]。本文對(duì)頂復(fù)門原蟲γ-氨基丁酸代謝途徑及其生物學(xué)作用進(jìn)行綜述。

1 γ-氨基丁酸代謝旁路的研究

1.1 γ-氨基丁酸代謝旁路 γ-氨基丁酸是一種谷氨酸衍生的氨基酸，存在于動(dòng)物、植物和微生物等各種生物中，可通過(guò)γ-氨基丁酸代謝旁路代謝為琥珀酸進(jìn)入TCA循環(huán)，也可轉(zhuǎn)化為α-酮戊二酸進(jìn)入TCA循環(huán)[9-10]。典型的γ-氨基丁酸代謝旁路是由谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase，GAD）、γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶（GABA transaminase，GABA-T）和琥珀酸半醛脫氫酶（succinic semialdehyde dehydrogenase，SSDH）三種重要酶組成。其代謝過(guò)程為：谷氨酸在GAD催化下生成γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）；γ-氨基丁酸在GABA-T催化下，與丙酮酸發(fā)生轉(zhuǎn)氨作用生成琥珀酸半醛和丙氨酸；琥珀酸半醛在SSDH催化下氧化生成琥珀酸進(jìn)入TCA循環(huán)。蟲體利用底物谷氨酸生成琥珀酸的代謝路徑構(gòu)成TCA循環(huán)的一個(gè)側(cè)支，被稱為γ-氨基丁酸代謝旁路。

1.2 γ-氨基丁酸代謝旁路的生理功能 γ-氨基丁酸是一種廣泛存在于原核和真核生物的四碳非蛋白質(zhì)氨基酸。γ-氨基丁酸通過(guò)γ-氨基丁酸代謝旁路參與大多數(shù)生物的重要代謝過(guò)程，在不同生物體中發(fā)揮不同的生理作用。血吸蟲具有發(fā)達(dá)的神經(jīng)系統(tǒng)，含有大量的神經(jīng)遞質(zhì)，比如γ-氨基丁酸可作為神經(jīng)系統(tǒng)的一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)[11]。寄生原蟲靶向γ-氨基丁酸活性的化學(xué)治療藥物通過(guò)結(jié)合神經(jīng)細(xì)胞或肌肉細(xì)胞的谷氨酸門控氯離子通道而發(fā)揮作用，而宿主的GABA受體僅存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)有血腦屏障保護(hù)，因此此類治療藥物對(duì)哺乳動(dòng)物宿主相對(duì)安全[12-13]。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)GABA廣泛存在于細(xì)菌、真菌、植物及哺乳動(dòng)物中，因病原生物中GABA受體存在的位置與哺乳動(dòng)物宿主存在顯著的差異，針對(duì)GABA的藥物被推薦用于治療感染性疾病[14]。γ-氨基丁酸參與微生物氮源和碳源的代謝，以及腐胺和精胺等多胺的代謝，并能夠?qū)Χ喾N逆境脅迫產(chǎn)生應(yīng)答，具有重要的生理功能[15]。植物中γ-氨基丁酸代謝旁路參與調(diào)節(jié)植物體內(nèi)pH值、植物生長(zhǎng)發(fā)育、碳/氮源營(yíng)養(yǎng)平衡、逆境脅迫響應(yīng)和信號(hào)傳遞等，植物γ-氨基丁酸在多種逆境條件（缺氧、冷害、機(jī)械刺激、干旱、鹽脅迫）大量積累，發(fā)揮多種生物學(xué)作用[16-17]。對(duì)頂復(fù)門原蟲如弓形蟲和瘧原蟲的研究發(fā)現(xiàn)，γ-氨基丁酸代謝旁路在蟲體入侵宿主細(xì)胞及有性生殖階段發(fā)揮重要的生物學(xué)作用[6-7,18]。

2 頂復(fù)門原蟲γ-氨基丁酸代謝旁路

頂復(fù)門原蟲可以利用谷氨酸作為碳源，為蟲體提供能量或中間代謝產(chǎn)物。最近的研究表明，頂復(fù)門弓形蟲具有完整的γ-氨基丁酸代謝旁路，谷氨酸經(jīng)代謝轉(zhuǎn)化為琥珀酸進(jìn)入TCA循環(huán)[7,9]；頂復(fù)門瘧原蟲具有部分的γ-氨基丁酸代謝，因缺乏琥珀酸半醛脫氫酶而不具備完整的γ-氨基丁酸代謝旁路，谷氨酸經(jīng)代謝轉(zhuǎn)化為α-酮戊二酸進(jìn)入TCA循環(huán)[19-22]。

2.1 弓形蟲的γ-氨基丁酸代謝旁路 研究表明弓形蟲具有完整的TCA循環(huán)，TCA循環(huán)和β-氧化是弓形蟲速殖子階段獲取能量的主要方式之一[7,9]。構(gòu)建弓形蟲琥珀酸合成酶缺失株，發(fā)現(xiàn)缺失株速殖子的生長(zhǎng)受到一定抑制。但谷氨酸代謝對(duì)速殖子的生長(zhǎng)發(fā)育具有同樣重要的作用，推測(cè)γ-氨基丁酸代謝旁路主要為速殖子的快速繁殖、胞外溢出及入侵新的宿主細(xì)胞提供能量。研究進(jìn)一步證實(shí)，這一時(shí)期弓形蟲顯著的減少用于形成膜脂的脂肪酸合成，減少對(duì)能量的消耗，以維持蟲體的增殖與入侵[23]。

弓形蟲利用γ-氨基丁酸代謝旁路將谷氨酸轉(zhuǎn)為γ-氨基丁酸，再經(jīng)轉(zhuǎn)氨酶（SSDH）作用生成琥珀酸半醛。SSDH還可以利用丙酮酸或α-酮戊二酸作為底物進(jìn)行轉(zhuǎn)氨作用（圖1）[1]。Blume等[24]發(fā)現(xiàn)弓形蟲的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺失株在谷氨酸的存在條件下，可恢復(fù)滑行運(yùn)動(dòng)能力，證實(shí)蟲體可以利用谷氨酸代謝適應(yīng)葡萄糖饑餓。抑制TCA循環(huán)可抑制速殖子的復(fù)制；而缺乏γ-氨基丁酸代謝旁路的蟲體則表現(xiàn)出生長(zhǎng)衰退，因營(yíng)養(yǎng)不足而無(wú)法維持活力的現(xiàn)象，表明GABA可作為短期的能量?jī)?chǔ)備[7,25]。TCA循環(huán)對(duì)于弓形蟲在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制是必要的，而γ-氨基丁酸代謝旁路則是能量的儲(chǔ)備，為弓形蟲的發(fā)育繁殖提供必需的能量需求。

圖1 弓形蟲γ-氨基丁酸代謝旁路模式圖[1]Fig.1 The schematic representation of GABA shunt in Toxoplasma gondii[1]

2.2 瘧原蟲的γ-氨基丁酸代謝旁路 瘧原蟲無(wú)性生殖期主要利用糖酵解途徑獲取能量，將葡萄糖降解為乳酸，僅有少量的丙酮酸經(jīng)支鏈酮酸脫氫酶（branched-chain Ketoacid Dehydrogenase，BCKDH）轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A進(jìn)入TCA循環(huán)[19]。丙酮酸進(jìn)入TCA循環(huán)受谷氨酸代謝生成的α-酮戊二酸調(diào)控。因瘧原蟲缺失的琥珀酸半醛脫氫酶使得其γ-氨基丁酸代謝與弓形蟲的不同，γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)化為α-酮戊二酸直接參與TCA循環(huán)（圖2）[19]。研究表明γ-氨基丁酸在瘧原蟲的有氧代謝中起到重要作用，可調(diào)控TCA循環(huán)。

瘧原蟲在配子生殖階段的能量獲得方式發(fā)生改變，以有氧代謝的TCA循環(huán)作為其獲取能量的主要方式[26-27]。此時(shí)，糖酵解途徑生成的丙酮酸與乙酰輔酶A是TCA循環(huán)的主要底物，這一現(xiàn)象表明在蚊子體內(nèi)有性生殖階段需要大量的ATP以維持其發(fā)育。研究證實(shí)配子生殖期參與TCA循環(huán)的代謝酶上調(diào)，同時(shí)抑制這些代謝酶的活性可影響瘧原蟲的生長(zhǎng)發(fā)育[18-19,28-29]。雖然TCA循環(huán)在無(wú)性繁殖期并不是必須的，但有性繁殖期TCA循環(huán)發(fā)揮重要的生物學(xué)作用，抑制BCKDH活性可顯著增強(qiáng)γ-氨基丁酸代謝通量。

圖2 瘧原蟲γ-氨基丁酸代謝模式圖[19]Fig.2 The schematic representation of GABA metabolism in Plasmodium falciparum[19]

2.3 其他原蟲的γ-氨基丁酸代謝旁路 近年來(lái)，研究表明γ-氨基丁酸代謝廣泛存在于原生動(dòng)物中?？菔襄F蟲（Trypanosoma cruzi）的生活史復(fù)雜，包括脊椎動(dòng)物、哺乳動(dòng)物宿主和昆蟲載體寄生階段。因哺乳動(dòng)物胞內(nèi)與昆蟲腸道的內(nèi)環(huán)境具有較大差異，蟲體進(jìn)化了一套能量代謝方式以適應(yīng)內(nèi)環(huán)境變化。在葡萄糖存在情況下，上鞭毛體利用糖酵解獲得能量；而當(dāng)葡萄糖缺失情況下，蟲體利用氨基酸代謝獲得能量[30-31]。此外，氨基酸代謝在枯氏錐蟲生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著多種作用，包括合成蛋白質(zhì)和提供能量[32]。研究發(fā)現(xiàn)枯氏錐蟲在能量底物缺乏時(shí)，可以利用谷氨酸、谷氨酰胺及脯氨酸產(chǎn)生ATP，同時(shí)谷氨酸可以由谷氨酰胺、脯氨酸或組氨酸轉(zhuǎn)化提供，并且谷氨酰胺的吸收利用受谷氨酰胺合成酶的調(diào)控[33-34]，而γ-氨基丁酸的吸收利用是通過(guò)至今為止發(fā)現(xiàn)的唯一一個(gè)Na+依賴氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體實(shí)現(xiàn)的[35]?？菔襄F蟲的γ-氨基丁酸代謝類似瘧原蟲，γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)化為α-酮戊二酸的形式參與TCA循環(huán)，產(chǎn)生ATP。因此，在蟲體處于能量底物缺乏時(shí)，γ-氨基丁酸代謝對(duì)于維持蟲體的致病力及能量供應(yīng)具有重要意義。

3 展望

近年來(lái)，γ-氨基丁酸代謝旁路在寄生蟲，尤其是頂復(fù)門原蟲中的生物學(xué)作用研究受到越來(lái)越多的關(guān)注。在弓形蟲和瘧原蟲中的研究取得了突破性進(jìn)展，γ-氨基丁酸代謝旁路不僅為蟲體提供能量?jī)?chǔ)備，并且對(duì)蟲體的生長(zhǎng)繁殖、致病力及適應(yīng)不同寄生環(huán)境等起到重要作用，推測(cè)可從該旁路中的關(guān)鍵酶為生物靶點(diǎn)著手，尋找防治頂復(fù)門原蟲病的新方法。研究表明，該代謝途徑中的關(guān)鍵酶GAD是潛在的殺蟲、殺螨藥物靶標(biāo)，L-蘋果酸是其抑制劑；GABA-T是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的重要藥物靶點(diǎn)，用對(duì)羥基苯甲醛抑制GABA-T活性對(duì)治療癲癇病表現(xiàn)出了良好的效果，香草醛和原兒茶酸等均可有效抑制GABA-T的活性[36]。野黃芩苷元是SSDH的有效抑制劑?，F(xiàn)有的GAD、GABA-T和SSDH有效抑制劑的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為證明它們?cè)陧攺?fù)門原蟲上是否有成為藥物靶標(biāo)的可能性提供了有效參考。目前對(duì)頂復(fù)門其他寄生原蟲γ-氨基丁酸代謝的研究?jī)H限于在基因組數(shù)據(jù)中，發(fā)現(xiàn)和緩艾美耳球蟲（E. mitis）和犬新孢子蟲（Neospora caninum）γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因序列[37]，而對(duì)于γ-氨基丁酸代謝在其他原蟲的代謝途徑、生理意義、調(diào)控機(jī)制等仍不清楚，仍需要在生化、分子和細(xì)胞水平上對(duì)頂復(fù)門原蟲GABA代謝途徑進(jìn)行深入研究，為寄生性原蟲疾病的防治奠定一定的理論基礎(chǔ)。