日本血吸蟲7 d童蟲cDNA文庫構建及免疫篩選

韓宏曉，洪 煬，傅志強，彭金彪，林矯矯

（1.中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所 農業(yè)農村部動物寄生蟲學重點開放實驗室，上海200241；2.上海市閔行區(qū)動物疫病預防控制中心，上海201109）

日本血吸蟲病是一種危害嚴重的人畜共患寄生蟲病，目前血吸蟲病的防治主要依賴于抗血吸蟲藥物吡喹酮的使用，但存在對童蟲藥效差、不能預防重復感染和潛在耐藥性風險等問題[1]。當前我國血吸蟲病防控已從疫情控制轉入疫情消除階段，建立更為靈敏、特異和可用于早期感染診斷的技術，是做好血吸蟲病消除工作的迫切需求[2]。童蟲是血吸蟲在終宿主體內早期發(fā)育的蟲體階段，血吸蟲童蟲階段cDNA文庫構建、免疫源性相關基因的篩選及重要童蟲階段差異表達基因的功能分析等研究，對篩選血吸蟲早期診斷抗原分子和疫苗候選分子等都具有重要意義[3-4]。

本研究構建了日本血吸蟲7 d童蟲cDNA文庫，利用日本血吸蟲感染10 d和42 d的小鼠血清篩選該文庫，獲取感染10 d的抗血清特異陽性克隆，對陽性克隆進行測序驗證和分析，為加深理解日本血吸蟲的生長發(fā)育機制，并對血吸蟲早期診斷抗原分子和疫苗候選分子的發(fā)現(xiàn)提供新信息。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和酶 Trizol試劑購自Invitrogen公司；cDNA文庫構建試劑盒SMARTTMcDNA Library Construction Kit購自Clontech公司；Gigapack?ⅢGold Packaging Kit購自Stratagene公司；HRP-羊抗鼠IgM酶標二抗購自Sigma公司；IPTG、X-gal等分子生物學試劑購自Promega公司；硝酸纖維素膜購自Whatman公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 實驗動物和血清 新西蘭白兔（雄性，2.5～3.0 kg）購自上海羅涇飛達實驗動物養(yǎng)殖場；BALB/c小鼠購自中國科學院上海實驗動物中心；尾蚴由中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所釘螺室提供；新西蘭白兔以腹部貼片法分別感染15 000條血吸蟲尾蚴，在感染后7 d剖殺，以肝門靜脈灌注法收集日本血吸蟲童蟲備用；日本血吸蟲感染小鼠的10 d和42 d血清由本實驗室制備。

1.3 日本血吸蟲7 d童蟲總RNA的提取和純化 按照說明書用Trizol對新鮮收集的日本血吸蟲7 d童蟲提取總RNA，并使用Nanodrop對提取的RNA進行定量。以RNase-free DNase Ⅰ消化、RNA easyTMMini Kit試劑盒純化去除基因組DNA污染。

1.4 日本血吸蟲7d童蟲cDNA文庫的構建和鑒定 在日本血吸蟲7 d童蟲純化后總RNA中加入CDS Ⅲ/3'PCR primer、SMART Ⅳ Oligonucleotide、dNTP Mix后，以Primer Script Reverse Transcriptase Ⅲ反轉錄合成cDNA第一鏈；再分別加入mRNA 5'端Cap區(qū)和3'端polyA區(qū)通用引物、dNTPs和polymerase Mix合成雙鏈cDNA。雙鏈cDNA經蛋白酶K消化和SfiI酶切消化后過柱去除小片段cDNA；將收集的cDNA片段與λTriplEx2噬菌體的兩臂連接，轉化到宿主菌XL1-Blue構建包裝好的初始文庫。鋪LB平板對初始文庫進行滴度和容量的測定，藍白斑篩選預估初始文庫重組率；提取噬菌體DNA，以通用引物PCR擴增測定重組子插入片段大小。

1.5 7 d童蟲cDNA文庫的免疫學篩選 日本血吸蟲感染小鼠的10 d和42 d血清用大腸桿菌蛋白裂解液預吸收，以去除抗大腸桿菌抗體[5]。將日本血吸蟲7 d童蟲cDNA擴增文庫稀釋鋪板，共鋪15塊板，將2張IPTG預處理的NC膜吸附每個LB平板上的噬菌斑并標記定位再將吸附噬菌斑的NC膜分別與預處理的血吸蟲感染小鼠的10 d和42 d血清孵育過夜，用胎牛血清封閉、HRP-羊抗鼠IgM二抗孵育和DAB顯色。比對10 d和42 d孵育的2張NC膜，篩選出10 d血清孵育的NC膜上特有陽性斑點（42 d血清孵育的NC膜上不顯色的陽性斑點），并復篩3次。復篩獲得的陽性克隆轉化至宿主菌、擴增并提取噬菌體DNA、PCR鑒定后送測序，對獲得的EST序列進行分析。

1.6 RT-qPCR法驗證表達基因 將篩選出來的7個差異表達基因利用在線設計軟件https://www.idtdna.com/scitools設計實時定量PCR特異性引物，分別以純化的10 d和42 d日本血吸蟲cDNA作為模板，應用RT-qPCR法在ABI 7500 real-time PCR系統(tǒng)上按照2-ΔΔCt法對差異表達基因進行相對定量分析[6]，以日本血吸蟲NADH-ubiquinone reductase基因為內參，引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primers used for RT-qPCR analysis

2 結果與討論

日本血吸蟲生活史復雜，不同生活階段蟲體蛋白表達譜不斷的發(fā)生變化，對宿主的免疫應答機制亦不同，尤其是處于早期發(fā)育階段的童蟲，因蟲體小而成為宿主免疫應答的重要靶標。日本血吸蟲肝期童蟲是性別分化和發(fā)育的最快階段，感染后7 d的童蟲剛進入肝門靜脈，蟲體處于細胞分化期，開展童蟲cDNA文庫的構建及免疫篩選可為分離、鑒定早期童蟲發(fā)育和分化相關基因提供了技術手段，對探討血吸蟲的免疫逃避機制、篩選血吸蟲早期診斷抗原分子和疫苗候選分子具有重要意義[7]。

2.1 日本血吸蟲7 d童蟲cDNA文庫構建與鑒定 測定提取的日本血吸蟲7 d童蟲總RNAD260/D280比值為1.90，RNA濃度為520 μg /mL，純化后其D260/D280的比值為1.98，RNA濃度為345 μg/mL。合成雙鏈cDNA階段對雙鏈cDNA的合成循環(huán)數(shù)進行篩選分析，發(fā)現(xiàn)19個循環(huán)合成效率最好。構建的日本血吸蟲7 d童蟲cDNA文庫鋪平板測定其初始文庫滴度為2.4106pfu/mL，對初始文庫進行擴增鋪平板，擴增后文庫滴度為1.6×109pfu/mL，符合文庫滴度要求。cDNA文庫稀釋后鋪平板，加入IPTG、X-gal，培養(yǎng)9～16 h，計數(shù)平板的藍白斑，計算cDNA文庫重組率為98%。隨機挑取單個噬菌斑擴增，提取噬菌體DNA，用測序通用引物T3、T7進行PCR擴增和DNA瓊脂糖凝膠電泳分析，文庫插入片段為0.5～3.0 kb，見圖1。

2.2 日本血吸蟲7 d童蟲cDNA文庫的免疫學篩選及分析 將日本血吸蟲7 d童蟲cDNA擴增文庫稀釋鋪板，每板約1000個噬菌斑的密度共鋪平板15塊，將2張IPTG預處理的NC膜吸附至一塊平板上的噬菌斑并標記定位，后每塊平板對應的2張吸附噬菌斑的NC膜分別與預處理的小鼠的10 d和42 d血清孵育、封閉、二抗孵育和DAB顯色，篩選出10 d血清孵育的NC膜上特有陽性斑點50個，復篩后獲得25個陽性克隆，PCR電泳和測序分析得到出17條有效EST序列。有效EST序列經NCBI比對分析，17條EST序列分別編碼7個基因，見表2。他們分別為：復制蛋白（2 ESTs）、肝再生增強因子（3 ESTs）、血小板活化因子（6 ESTs）、鈣調理蛋白基因（3 EST）、絲束蛋白（1 ESTs）、核糖體RNA（1 EST）和還原型輔酶脫氫酶基因（1 EST）。

圖1 PCR擴增日本血吸蟲7 d童蟲cDNA文庫插入片段分析Fig.1 PCR analysis of insert DNA fragment from 7-day schistosomula cDNA library

表2 免疫篩選獲得日本血吸蟲童蟲階段特異表達ESTs序列分析Table 2 Analysis of the schistosomula stage-specific expressed ESTs screened from the cDNA library

復制蛋白A（RPA）是當前國內外研究細胞DNA損傷應激反應的一個熱點，RPA為真核細胞中主要的單鏈結合蛋白，在DNA復制和修復過程中有重要作用[8-9]。在血吸蟲早期感染階段，血吸蟲遭遇新的生存、生長發(fā)育環(huán)境，復制蛋白也可能在DNA損傷應激反應中發(fā)揮作用。肝臟再生增強因子是肝細胞的生存必需的重要因子，存在于線粒體、胞漿、內質網以及胞核之中，肝臟再生增強因子由肝細胞分泌，在Kupffer細胞中通過G-蛋白耦聯(lián)的受體刺激一系列免疫因子如腫瘤壞死因子、白介素-6和一氧化氮的合成[10]。血小板活化因子是一種強效生物活性磷脂類細胞因子，由白細胞、血小板、肺臟、肝臟和腎臟等多種細胞和器官產生，在血栓形成、急性炎癥等病理生理過程中起重要作用[11]。日本血吸蟲7 d童蟲處于細胞分化期，日本血吸蟲可能通過釋放內源性類肝臟再生增強因子和類血小板活化因子來減少免疫應激，維持其正常生長發(fā)育，具體功能還有待進一步試驗驗證。鈣調理蛋白為一類具有多種功能的運動相關蛋白，曼氏血吸蟲研究發(fā)現(xiàn)鈣調理蛋白可對幼蟲發(fā)育、尾蚴建立感染和產卵等具有作用[12]，日本血吸蟲早期童蟲處于生長發(fā)育階段，鈣調理蛋白的特異性表達可能具有與曼氏血吸蟲類似的功能。

2.3 免疫篩選的差異表達基因驗證分析 RT-qPCR分析結果表明，免疫篩選出的差異表達基因在10 d和42 d日本血吸蟲表達各異，其中復制蛋白、肝臟再生增強因子、血小板活化因子、鈣調理蛋白和絲束蛋白在10 d童蟲表達量顯著高于42 d成蟲（＞2倍），而核糖體RNA和還原型輔酶脫氫酶基因在10 d童蟲和42 d 成蟲表達量差異并不顯著（圖2）。究其原因可能源于cDNA免疫篩選方法的局限性所致，隨著蛋白質組學技術的進步和發(fā)展，為精細分析不同發(fā)育階段蟲體蛋白質表達差異提供了可能。

總之，本研究成功構建了日本血吸蟲7 d童蟲cDNA文庫，并使用日本血吸蟲感染小鼠10 d和42 d血清免疫篩選該文庫，獲得多個日本血吸蟲早期童蟲階段特異表達基因，如復制蛋白、肝臟再生增強因子、血小板活化因子、鈣調理蛋白基因等，可為深入研究血吸蟲早期童蟲的生長發(fā)育機制，篩選血吸蟲病疫苗候選分子、藥物靶標和早期診斷抗原提供基礎。

圖2 差異表達基因RT-qPCR分析Fig.2 Analysis of differential expressed genes in 10-day and 42-day S. japonicum by RT-qPCR