姜黃素抑制馬立克氏病病毒在CEF細胞中的復制

馮 春 ，楊 帆 ，喬丹丹 ，秦愛建 ,3，錢 琨 ,3

（1.揚州大學 教育部禽類預防醫(yī)學重點實驗室，揚州 225009；2.揚州大學 江蘇省動物預防醫(yī)學重點實驗室，揚州 225009；3.江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州 225009）

馬立克氏?。∕arek's disease，MD）是由α皰疹病毒科馬立克氏病病毒（Marek's disease virus，MDV）感染引起的惡性T細胞淋巴瘤，導致家禽嚴重的免疫抑制，給家禽業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失[1]。目前MD的防控主要是疫苗免疫，常用的疫苗包括血清I型弱毒疫苗CVI988、814株，Ⅱ型疫苗SB-1以及Ⅲ型疫苗HVT[2]。研究表明臨床使用的MDV疫苗能保護機體不發(fā)生急性惡性腫瘤，但并未能阻止體內(nèi)病毒的復制和釋放。在疫苗選擇壓力下，MDV毒力不斷進化，近年來有免疫雞群暴發(fā)MD的報導[3]，提示MDV有突破現(xiàn)有疫苗保護的趨勢。因此，在研發(fā)更加有效疫苗的基礎上，尋求有效抗病毒藥物也是一種控制疾病發(fā)生、發(fā)展的途徑。

中草藥源遠流長，其提取物中含大量生物活性物質(zhì)，部分提取物或代謝產(chǎn)物具有廣譜的抗病毒作用和多種免疫調(diào)節(jié)功能，無藥物殘留，目前得到國內(nèi)外研究人員的廣泛關注[4]。姜黃素（Curcumin，Cur）是一種橙色晶體狀粉末，為酸性多酚類化合物，從姜黃的根莖中提取得到。化學式為C21H20O6（3-甲氧基-4-羥基-苯基-1，6-庚二烯-3，5-二酮），不僅具有二酮類結構，也具有多酚類結構。姜黃素結構的特殊性和稀有性決定了其抗病毒的化學藥理作用[5]。Du等[5]發(fā)現(xiàn)姜黃素通過阻礙病毒脫衣殼以及病毒介導的細胞融合現(xiàn)象抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）內(nèi)化進入MARC-145細胞；Bryan等[6]發(fā)現(xiàn)姜黃素可以抑制寨卡病毒（Zika virus，ZIKV）和基孔肯尼雅病毒（Chikungunya virus，CHIKV）等囊膜病毒吸附到細胞表面從而抑制病毒感染；Zhu等[7]發(fā)現(xiàn)姜黃素可以抑制牛Ⅰ型皰疹病毒BoHV-1進入MDBK細胞；Kutluay等[8]發(fā)現(xiàn)姜黃素可以抑制單純皰疹病毒的早期即刻（Herpes simplex virus immediate-early，HSV-IE）基因的表達影響病毒復制。然而，姜黃素對家禽病毒病的療效還鮮有報道。

本研究旨在探究姜黃素對MDV超強毒株RB-1B在雞胚成纖維細胞（chick embryo fibroblast cell，CEF）中復制產(chǎn)生的影響，為防控MD有效抗病毒藥物的研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 生物材料和試劑 雞胚成纖維細胞（CEF）由9～10日齡的SPF雞胚制得；MDV超強毒株RB-1B由本實驗室保存；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和DMEM均購自GIBCO公司；姜黃素購自SIGMA公司；針對血清I型MDV糖蛋白gB的單抗BA4由本實驗室制備并保存；內(nèi)參抗體α-Tubulin購自SIGMA公司；細胞裂解液RIPA buffer購自康為世紀公司；CCK-8溶液、BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；FITC標記的山羊抗鼠二抗、HRP標記的羊抗鼠二抗均購自Jackson公司；HRP化學發(fā)光底物液購自Bio-Rad公司；總RNA提取試劑盒購自Axygen公司；PrimerScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser（Perfect for Real Time）反轉錄試劑盒以及SYBR熒光染料購自TaKaRa公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 細胞毒性實驗 姜黃素溶于DMSO中，配置貯存濃度為20 mmol/L，于-20℃保存?zhèn)溆?。藥物細胞毒性檢測按照CCK-8說明書操作，簡述如下：姜黃素用含1%FBS的DMEM稀釋至5、10、20、25、40、80 μmol/L。將不同濃度的姜黃素加入到細胞孔內(nèi)，每個濃度設置4個重復，分別設置DMSO以及各個濃度有藥物無細胞的對照，37℃細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)96 h，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，37℃繼續(xù)孵育0.5～4 h，酶標儀于D450處讀取數(shù)值。細胞存活率=

1.3 姜黃素對MDV復制的影響 為觀察不同濃度姜黃素對MDV復制的影響，選擇0、2、20 μmol/L濃度姜黃素在12孔細胞板中預處理細胞4 h，然后每孔加入200 pfu病毒與不同濃度姜黃素的混合物，設置4個重復，并使用含姜黃素的維持液培養(yǎng)96 h后，收集細胞分別用于RNA提取、蛋白裂解、間接免疫熒光和病毒噬斑計數(shù)。為觀察姜黃素作用的時間效應，參考文獻[9]，將姜黃素（20 μmol/L）與MDV的混合物共同加入到CEF細胞中，設置僅接種MDV不加姜黃素組作為對照組，分別于接種MDV后24、48、72、96 h測定MDV基因表達水平和增殖情況。

1.4 不同時間點加入姜黃素對MDV復制的影響 根據(jù)參考文獻[4, 9-10]，確定姜黃素抑制MDV復制作用的時間點，分別在MDV感染前中后的不同時間段加入姜黃素（20 μmol/L）處理CEF細胞，實驗方案簡述如下，第一種方案（P1）：MDV感染前4 h用姜黃素（20 μmol/L）預處理CEF細胞，PBS清洗后接種MDV，1%含F(xiàn)BS的DMEM于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)96 h；第二種方案（P2）：姜黃素和MDV的混合物共同加入到CEF細胞中，吸附4 h 后PBS洗滌，加入含1%FBS的DMEM于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)96 h；第三種方案（P3）：MDV感染CEF細胞4 h后，使用PBS洗滌細胞并用含姜黃素和1% FBS的DMEM于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)96 h；第四種方案（P1+P2+P3）：細胞預處理階段、MDV吸附感染階段以及MDV后期復制階段，細胞培養(yǎng)液中均含有20 μmol/L的姜黃素，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)96 h，測定MDV滴度驗證姜黃素對MDV復制不同階段的抑制情況。

1.5 姜黃素直接對病毒感染性的影響 根據(jù)參考文獻[7, 11]設計實驗如下：分別將MDV與姜黃素（20 μmol/L）混合物或者MDV與DMEM混合物在37℃孵育1.5 h，然后將混合物接種至單層CEF細胞中，96 h后分別測定病毒基因表達量以及病毒增殖情況。

1.6 Western blot檢測 收集細胞利用RIPA buffer裂解，并使用BCA試劑盒進行蛋白定量。采用常規(guī)方法進行SDS-PAGE、轉印、5%脫脂乳封閉、一抗（gB蛋白的單克隆抗體BA4和內(nèi)參α-tubulin）和二抗（HRP羊抗鼠1∶10 000）的孵育、顯色等步驟，最終使用HRP增強型化學底物避光顯色5 min后，于超靈敏化學發(fā)光成像系統(tǒng)拍照保存。

1.7 間接免疫熒光檢測 MDV接種于CEF細胞96 h后，利用固定液（丙酮∶乙醇=3∶2）室溫固定CEF細胞5 min，PBS洗滌后加入BA4抗體孵育60 min后，在加入二抗FITC標記的羊抗鼠孵育30 min后，于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.8 病毒噬斑計數(shù) 將含病毒的細胞懸液進行10倍梯度稀釋，稀釋后的10-1～10-7病毒懸液分別接種至96孔細胞板中的CEF細胞，4～5 d后對相應稀釋梯度的噬斑進行計數(shù)，計算方式如下：病毒滴度（pfu/mL）=（平均每孔噬斑數(shù)×稀釋倍數(shù)）/每孔接種病毒量（mL）

1.9 real-time PCR檢測 病毒基因gB、Meq的表達量采用real-time PCR來檢測。real-time PCR引物序列見表1。按照說明書提取RNA并取1 μg總RNA作為模板進行反轉錄獲得cDNA，cDNA加入體系之前用ddH2O進行10倍稀釋。反應體系為：SYBR Premix ExTaqTMⅡ 10 μL、ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL、上下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL、ddH2O 6 μL、模板2 μL，共20 μL。real-time PCR在ABI 7500系統(tǒng)中進行反應，反應程序為95℃預變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火34 s，共40個循環(huán)。以18s為內(nèi)參基因對樣本進行歸一化處理，每個樣本3個重復。

1.10 數(shù)據(jù)結果統(tǒng)計分析 利用GraphPad (version 5.0)軟件對結果進行Student-t分析，以確定不同組別之間是否具有顯著性差異。*代表p＜0.05，表現(xiàn)為差異顯著具有統(tǒng)計學意義；**代表p＜0.01，表現(xiàn)為差異極顯著具有統(tǒng)計學意義；***代表P＜0.001，表現(xiàn)為差異極極顯著具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 姜黃素對CEF的細胞毒性實驗 不同濃度的姜黃素與CEF細胞孵育96 h后，每孔加入CCK-8檢測姜黃素對CEF細胞毒性。結果顯示，姜黃素在濃度20 μmol/L內(nèi)對CEF細胞的生長沒有明顯影響，甚至在濃度10 μmol/L時還具有一定的促生長作用，結果見圖1。因此，本研究最終選擇2、20 μmol/L作為工作濃度進行后續(xù)實驗。

2.2 姜黃素明顯抑制MDV的復制和增值 在MDV接種前4 h以及接種后96 h整個過程中加入姜黃素顯著抑制了MDVMeq、gB基因的表達，并且抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性，見圖2A、2B；噬斑計數(shù)結果顯示姜黃素在濃度20 μmol/L時，顯著降低MDV在CEF細胞中的增殖，結果見圖2C；間接免疫熒光和Western blot結果也顯示，姜黃素明顯抑制了MDV的復制和增殖，見圖2D、2E。

2.3 姜黃素抑制MDV復制具有時間依賴性 在MDV接種CEF細胞后96 h內(nèi)，不同時間點收集CEF細胞進行檢測。加姜黃素組與不加姜黃素對照組MDVgB基因的表達量以及噬斑數(shù)量差異顯著，具有統(tǒng)計學意義，見圖3。結果表明，姜黃素在CEF細胞中抑制MDV的復制，且具有時間依賴性。

表1 real-time PCR引物序列Table 1 Primer sequences of real-time PCR

圖1 姜黃素在CEF細胞中的毒性檢測Fig.1 The cytotoxic effect of curcumin on CEF cells

2.4 姜黃素抑制MDV復制過程解析 為了解姜黃素抑制病毒感染的作用環(huán)節(jié)，設計四種不同的加藥方案，均于接種MDV后96 h收取細胞，用于MDV RNA提取及MDV滴度測定。結果表明，在MDV與CEF細胞吸附階段和MDV復制后期階段加入姜黃素均能抑制MDV復制，以細胞吸附階段作用最顯著，而藥物預處理CEF細胞時，對MDV復制沒有影響，見圖4。

2.5 姜黃素直接影響MDV的感染性 為了進一步明確姜黃素對MDV感染性作用，將MDV與姜黃素在37℃共同孵育1.5 h后感染CEF細胞，real-time PCR和噬斑計數(shù)結果均顯示，姜黃素處理組的MDV基因表達和增殖均明顯減弱，表明姜黃素能直接影響MDV的感染性，結果如圖5所示。

2.6 姜黃素對病毒感染細胞中細胞因子表達的影響 有文獻[12-14]報道，姜黃素可以通過調(diào)節(jié)細胞信號因子影響病毒的增殖。本研究檢測了經(jīng)姜黃素處理與未處理的被MDV感染CEF細胞中的IL-1β、IL-6、IFN-β、ISG12-2、Mx-1和OASL等細胞因子的表達水平，見圖6。結果顯示，姜黃素處理組中，IFN-β、ISG12-2 、Mx-1和OASL表達水平明顯下降，而炎癥相關因子IL-1β和IL-6表達水平顯著升高。

3 討論

馬立克氏病是MDV引起的一種高度接觸傳染性、淋巴組織增生性疾病。該病是第一個可以用疫苗預防的腫瘤性疾病[2]。但到目前為止，還沒有有效的方法可以完全治療患病雞，阻止病毒在體內(nèi)復制，只能通過疫苗免疫雞群來控制疾病的發(fā)生。藥物抗病毒可減少病毒在體內(nèi)的復制，有研究表明，姜黃素通過不同機制發(fā)揮抗病毒活性，這些機制涉及直接抑制病毒復制機制或抑制病毒復制所必需的細胞信號傳導途徑。已有研究表明，姜黃素通過影響CHIKV、ZIKV、HCV、BoHV-1和PRRSV囊膜的流動性干擾病毒囊膜與細胞膜的融合抑制病毒感染[5-7,15]，或者通過影響細胞內(nèi)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)或細胞凋亡過程來降低JEV、DENV、CVB3的感染性[12-14]，此外姜黃素還通過顯著影響HSV-1 IE基因表達，從而降低了HSV-1啟動裂解感染周期的能力[8]。

圖2 姜黃素抑制病毒基因表達呈劑量依賴性Fig.2 Inhibition of virus replication by Curcumin in a dose dependent manner

圖3 姜黃素抑制病毒復制呈時間依賴性Fig.3 Inhibition of virus replication by Curcumin in a time dependent manner

本研究結果表明，姜黃素能劑量和時間依賴性的抑制MDV基因的表達以及病毒在CEF中的增殖，這些結果與以往姜黃素抑制BoHV-1、ZIKV和CHIKV在細胞中的復制結果相似[6-7]，提示姜黃素對家禽病毒也同樣具有一定的抑制作用。不同時間點加入姜黃素的實驗結果顯示，病毒在細胞吸附階段抑制作用最顯著，這或許和藥物能直接影響MDV的感染性有關，這與姜黃素抑制IAV病毒吸附和后期復制階段類似[16]。由于MDV感染細胞的受體及傳播機制還未明晰，所以姜黃素抑制病毒吸附細胞的具體機制有待日后深入研究。以往報道顯示姜黃素可以通過調(diào)控細胞信號因子的表達而影響病毒的復制，例如姜黃素通過調(diào)控宿主細胞泛素蛋白體系統(tǒng)及細胞凋亡相關過程影響病毒復制[12-14]。本研究選擇了部分抗病毒細胞因子及炎癥相關因子進行realtime PCR檢測，結果發(fā)現(xiàn)常見的抗病毒因子都隨著病毒復制減少而降低，而炎癥因子IL-6和IL-1β卻相反，顯著升高，提示炎癥反應可能與MDV的復制相關，其中具體機制還有待進一步研究。在動物體內(nèi)實驗中，姜黃素口服給藥在小鼠模型中顯示出抗癌作用；在巨細胞病毒感染的模型中，姜黃素胃內(nèi)給藥顯著降低了病毒DNA載量和IgM水平，表明姜黃素在體內(nèi)抗病毒活性的潛力[17]；未來姜黃素通過口服給藥預防體內(nèi)MDV的劑量及安全性還需要今后的體內(nèi)實驗數(shù)據(jù)來確定。本研究結果表明，姜黃素以劑量和時間依賴的方式抑制MDV在CEF細胞中的復制。此外，姜黃素還通過直接影響病毒的感染性來抑制MDV在CEF細胞中的復制。這些結果提示，中藥姜黃素具有開發(fā)為抗MDV有效藥物的潛力。

圖4 姜黃素在不同加入時間抑制 MDV增殖的作用Fig.4 Antiviral effects of Curcumin on MDV proliferation at different time points

圖5 姜黃素直接影響MDV的感染性Fig. 5 Direct virucidal activity of Curcumin on MDV

圖6 姜黃素對MDV感染CEF細胞因子表達影響Fig.6 Effects of Curcumin on cytokines expression in MDV infected cells