金線蓮組織培養(yǎng)研究進(jìn)展

李榮峰 粟楊盛

摘要 金線蓮是一種多年生草本藥用植物，野生資源已逐漸枯竭，人工栽培能為金線蓮的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供充足的材料。從金線蓮的人工繁殖、金線蓮組培莖段和頂芽外植體選取、外植體消毒、培養(yǎng)基（基本、誘導(dǎo)、生根）選擇等幾方面進(jìn)行了綜述，同時分析了金線蓮組織培養(yǎng)中存在的問題，并指出今后金線蓮的研究重點。

關(guān)鍵詞 金線蓮;組織培養(yǎng);研究進(jìn)展

中圖分類號 S567.23 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2020）03-0015-03

Abstract Anoectochilus roxburghii is a perennial herbaceous medicinal plant.The wild resources have been gradually depleted.Artificial cultivation can provide sufficient materials for the industrial development of A.roxburghii.This paper reviewed the artificial breeding of A.roxburghii，the selection of the stem segments and top bud explants of A.roxburghii，the disinfection of explants，and the selection of medium （basic，induction，rooting）.The problems in the tissue culture of A.roxburghii were analyzed，and the research focus of A.roxburghii was pointed out in the future.

Key words Anoectochilus roxburghii;Tissue culture;Research progress

金線蓮（Anoectochilus roxburghii），別名金線蘭、金絲草、金絲線、金耳環(huán)、烏人參、金線虎頭蕉、金線入骨消、金線石松、金石蠶、少年紅、小葉金耳環(huán)、麻葉菜等， 是蘭科開唇蘭屬植物的多年生草本藥用植物，因其葉脈呈金黃色而得名。成分分析研究發(fā)現(xiàn)，金線蓮富含糖類成分（多糖13.326%，低聚糖11243%，還原糖9730%）、?；撬?、強心甙類、酯類、生物堿、甾體，多種氨基酸，微量元素及無機元素等[1-6]，金線蓮氨基酸和微量元素兩者含量均高于國產(chǎn)西洋參和野山參，它們與牛磺酸、多糖類成分具有營養(yǎng)、抗衰老、調(diào)節(jié)人體機體免疫的作用。近年來在臺灣地區(qū)和東南亞一些國家金線蓮熱銷，其原藥材供不應(yīng)求，但由于金線蓮對生態(tài)環(huán)境要求嚴(yán)格，加之近年自然環(huán)境嚴(yán)重破壞，自然資源本來就不多以及過度采挖，造成金線蓮野生資源逐漸枯竭[7]，目前已經(jīng)到了瀕臨滅絕的程度?，F(xiàn)今，利用不同外植體材料和方法完成金線蓮離體再生已獲得成功[8-10]。許多科研工作者也投入了大量的時間和精力，試圖通過改善培養(yǎng)基組成和成分配比來縮短金線蓮組培中繼代時間、提高根系質(zhì)量和生根效率，但始終未能獲得實質(zhì)性的突破[11-13]。前人已分別系統(tǒng)綜述了金線蓮化學(xué)成分分析、外植體篩選、培養(yǎng)基組分、不同移栽條件、條件優(yōu)化及無土栽培技術(shù)、人工種子制作及人工栽培條件等[14-19]，筆者擬重點介紹金線蓮人工繁殖、金線蓮組培莖段和頂芽外植體選取、外植體消毒、培養(yǎng)基（基本、誘導(dǎo)、生根）選擇等，同時分析存在的問題及將來可能的突破點。

1 金線蓮人工繁殖

金線蓮人工繁殖目前得到很大的發(fā)展，主要有種子繁殖、分根法或扦插法繁殖、組織培養(yǎng)繁殖。種子繁殖時由于金線蓮種子微小，自然萌發(fā)率極低，只有在無菌條件下供給充足的養(yǎng)分，種子才能萌發(fā);以分根法或扦插法繁殖，繁殖系數(shù)極低，在量上無法形成規(guī)模;而利用組織培養(yǎng)方法，可以在較短時間內(nèi)獲得大量種苗，這是目前保護(hù)和開發(fā)金線蓮的唯一途徑。

2 金線蓮組培外植體的選取

選擇和確定合適的外植體是進(jìn)行離體培養(yǎng)的基礎(chǔ)，同一植物不同部位有不同的特點，因此必須分析同一植物不同部位的生長狀況，尋找確定滿足培養(yǎng)目的的植物部位。金線蓮組織培養(yǎng)時，可用其莖段、頂芽、種子、葉片作為外植體，以莖段、頂芽組培效果較好。

2.1 莖段作外植體

李海鷹等[20]選取金線蓮不同部位莖段進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)金線蓮不同部位莖段不定芽的誘導(dǎo)結(jié)果存在較明顯的差異，其中又以不含頂芽和根的中間帶節(jié)莖段較好，不定芽的增殖率都在4倍以上。江建銘等[21]以金線蓮莖段為外植體研究金線蓮組織快繁，結(jié)果表明外植體以不含頂芽和長根的中間段莖節(jié)為好。吳坤林[22]對金線蓮快繁的研究也證明了這一點，上部的莖段因含有頂芽，頂端優(yōu)勢表現(xiàn)較為強烈，以高生長為主，不定芽發(fā)生較少;中部莖段不定芽均從葉痕節(jié)中發(fā)生，并不斷分枝，形成多枝叢生芽;下部莖段由于組織老化，再生能力差，雖有不定芽發(fā)生，但發(fā)生和生長緩慢。祁永瓊等[23]對金線蓮不同外植體組培，基部莖段在培養(yǎng)基中增殖產(chǎn)生的幼苗較為細(xì)弱，黃化苗率為34.5%;頂芽在培養(yǎng)基中增殖產(chǎn)生的幼苗都較健壯，沒有黃化苗產(chǎn)生;中部莖段增殖產(chǎn)生的幼苗生長情況則介于基部莖段和頂芽之間。

相比較而言，基部莖段增殖率一般，高于頂芽，低于帶節(jié)中間莖段，產(chǎn)生的幼苗黃化苗率高且弱小，需要壯苗培養(yǎng)后才可進(jìn)行生根培養(yǎng);頂芽在培養(yǎng)基中增殖產(chǎn)生的幼苗都較為健壯且沒有黃化苗，可直接進(jìn)行生根培養(yǎng)，但增殖率較中間帶節(jié)莖段低;中部帶節(jié)莖段黃化苗不多，增殖率高且幼苗也夠健壯，是金線蓮組織培養(yǎng)理想的外植體。

2.2 頂芽作外植體

在頂芽和側(cè)芽的組培過程中，金線蓮的個體發(fā)生途徑是由體細(xì)胞胚發(fā)育成類原球莖，往后發(fā)育的進(jìn)程與種子胚的形態(tài)建成途徑相似。頂芽和側(cè)芽也可直接啟動，形成叢生芽，再誘導(dǎo)生根成苗。還可用金線蓮葉片或不帶芽的莖段作外植體，首先要經(jīng)過脫分化形成愈傷組織，再沿不同的途徑成苗。金線蓮的種子非常細(xì)小，呈翅狀， 是由一個簡單的胚和單層細(xì)胞的種皮組成;種子萌發(fā)時首先是胚膨大，然后種皮破裂，經(jīng)過40 d，可見淺黃色呈球狀的原胚，被稱為原球莖[24]。張鐵等[25]通過滇越金線蓮種子無菌萌發(fā)后得到的原球莖經(jīng)分化成幼苗，發(fā)現(xiàn)其在Hyponexl培養(yǎng)基上萌發(fā)速度快，萌發(fā)率最高，達(dá)70%，原球莖的生長狀況最好。金線蓮組織培養(yǎng)以成年植株上取得莖段和莖尖組織為主要培養(yǎng)材料，以帶節(jié)莖段或頂芽接種于培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d后，可見到帶節(jié)的莖段膨大，腋芽萌動生長，突起并伸長， 呈白色;培養(yǎng)25 d后，腋芽繼續(xù)伸長，并從基部增生出新的芽體后長成小苗，基部的新芽上又產(chǎn)生新的芽點，經(jīng)過不斷的繼代培養(yǎng)后形成大量叢生芽[26]。黃德貴等[27]在對金線蓮叢生芽的研究中發(fā)現(xiàn)，金線蓮帶節(jié)莖段經(jīng)培養(yǎng)能得到大量種苗。節(jié)段的腋芽分化過程中，有腋（側(cè)）芽萌生和原球莖增殖兩途徑。以固體培養(yǎng)基培養(yǎng)帶節(jié)莖段，90 d后側(cè)芽再生，其最高的繁殖倍率平均達(dá)5.1倍。祁永瓊等[23]選用金線蓮的頂芽、中部莖段以及基部莖段作為材料，研究金線蓮組織培養(yǎng)快速繁殖成苗技術(shù)，以頂芽作為外植體時，誘導(dǎo)率和增殖倍數(shù)都是最高的;增殖培養(yǎng)時，這3種外植體的增殖率都較高，其中頂芽增殖倍數(shù)達(dá)7.5倍。

3 外植體的消毒

由于同一植物不同部位有其不同的結(jié)構(gòu)特點，各種激素成分含量也有差異，它們對于不同種類和濃度消毒劑的反應(yīng)也不相同，開始都要對使用的消毒劑種類、濃度和消毒時間進(jìn)行試驗研究，以達(dá)到最佳的消毒效果。在對金線蓮?fù)庵搀w進(jìn)行消毒滅菌處理方法的研究中用到的消毒劑有78%乙醇、2.0%次氯酸鈉、0.1%HgCl2溶液等，處理時間的長短也有差異。黃德貴等[9]用0.1%HgCl2浸泡3 min， 再用12%漂白粉液消毒10 min，雙重消毒金線蓮?fù)庵搀w，材料的污染率為0，芽萌動率達(dá)85%。王建明等[16]對金線蓮?fù)庵搀w消毒滅菌條件進(jìn)行了優(yōu)化，其中以75%乙醇+0.1%HgCl2浸泡處理8 min效果較好。闞世超等[28]用75%乙醇消毒30 s+0.15%HgCl2消毒4 min，啟動金線蓮?fù)庵搀w的培養(yǎng)，污染率為0.001且褐變率只有0.05。

不同學(xué)者及研究人員對金線蓮?fù)庵搀w消毒要求不同，所選擇的試劑、濃度和消毒時間也不盡相同。0.1%HgCl2漫泡3 min+12%漂白粉液處理10 min污染率較低且萌發(fā)率良好;用75%乙醇和0.1% HgCl2浸泡處理8 min，萌發(fā)率較高，但是污染率較高;用75%乙醇消毒30 s+0.15%HgCl2消毒4 min，污染率及褐變率都較低。

4 培養(yǎng)基的選擇

4.1 基本培養(yǎng)基的選取

根據(jù)已有的報道，金線蓮培養(yǎng)所用的基本培養(yǎng)基有MS、1/2MS、B5和N6等。MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)莖段產(chǎn)生芽體的能力比1/2MS培養(yǎng)基強，而誘導(dǎo)頂芽產(chǎn)生新芽體的能力反而是1/2MS更強一些[29]。劉偉等[30]在比較了20種培養(yǎng)基誘導(dǎo)莖段叢生芽的效果后，發(fā)現(xiàn)MS作為基本培養(yǎng)基的效果較佳。也有學(xué)者以改良MS或B5培養(yǎng)基作為誘導(dǎo)分化的基本培養(yǎng)基。高燕等[31]用MS培養(yǎng)基改良為Ar培養(yǎng)基（大量元素減半，微量元素加倍，pH5.8，蔗糖2%，瓊脂粉0.7%）培養(yǎng)金線蓮帶腋芽莖段，獲得了良好的效果。王建勤等[32]在對金線蓮原球莖進(jìn)行誘導(dǎo)時用KC、VW和MS進(jìn)行對比試驗，KC和VW培養(yǎng)基都沒有誘導(dǎo)產(chǎn)生原球莖，而MS培養(yǎng)基上原球莖的誘導(dǎo)率為60%。毛碧增等[29]比較了金線蓮莖段在18種基本培養(yǎng)基誘導(dǎo)叢生芽的效果，表明在MS培養(yǎng)基中添加BA 1.5 mg/L、NAA0.15 mg/L為誘導(dǎo)莖段的最佳組合。劉芳等[33]研究了金線蓮不同部位外植體在不同基本培養(yǎng)基中誘導(dǎo)叢生芽，結(jié)果表明在MS培養(yǎng)基上，金線蓮中部莖段誘導(dǎo)產(chǎn)生叢生芽的效果好，在N6基本培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)金線蓮基部莖段產(chǎn)生叢生芽的效果好。曹天旭等[34]研究外部因子對金線蓮叢生芽增殖和發(fā)根的影響也得到了類似的結(jié)果。金線蓮組織培養(yǎng)再生成苗主要有原球莖、叢生芽等途徑，不同途徑以及不同部位外植體所需培養(yǎng)基不同，具體情況如表1所示。

4.2 誘導(dǎo)培養(yǎng)基的選取

組織培養(yǎng)中常用到的植物生長調(diào)節(jié)劑有生長素、細(xì)胞分裂素、赤霉素以及其他化合物等。植物生長調(diào)節(jié)劑的種類、配比不同對培養(yǎng)物的影響具有顯著性差異。一般來說，生長素濃度高于細(xì)胞分裂素濃度有利于生根培養(yǎng);細(xì)胞分裂素濃度高于生長素濃度容易誘導(dǎo)產(chǎn)生新芽;生長素濃度與細(xì)胞分裂素濃度相當(dāng)時常用于愈傷組織的誘導(dǎo)。何云芳等[35]試驗表明，BA 4.0 mol/L，NAA0.3 mol/L和GA30.3 mol/L時，對叢生芽產(chǎn)生和伸展的效果較好。高燕等[31]研究發(fā)現(xiàn)，金線蓮對6-BA不敏感，當(dāng)培養(yǎng)基中的6-BA濃度達(dá)4.0 mg/L時未出現(xiàn)畸形苗，但是在金線蓮培養(yǎng)過程中6-BA具有積累效應(yīng)，應(yīng)根據(jù)幼苗的長勢來確定6-BA用量;金線蓮增殖培養(yǎng)時，在培養(yǎng)基中加入一定量的KT可以促進(jìn)叢生芽的分化和增殖。王建勤等[32]在研究誘導(dǎo)金線蓮原球莖與植株再生時配合使用細(xì)胞分裂素、玉米素和生長素提高了原球莖誘導(dǎo)率。S-3307是一種新型高效的植物生長調(diào)節(jié)劑，有抑制赤霉素生物合成的功能，具有促進(jìn)植株分蘗、抑制植物生長的作用，在金線蓮原球莖增殖培養(yǎng)時，加入一定量的生長抑制劑能提高增殖率。而TDZ有很強的細(xì)胞分裂活性（CTK），有促進(jìn)植物芽再生和繁殖的能力，并且能打破芽的休眠，還可用來調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育。楊柏云等[36]在誘導(dǎo)金線蓮原球莖的培養(yǎng)基中加入不同濃度的NAA、TDZ和S-3307，發(fā)現(xiàn)其對原球莖分化作用大小依次為TDZ>S-3307>NAA。江建銘等[21]以莖段為外植體開展生長調(diào)節(jié)劑對不定芽增殖、幼苗生長的影響研究，不定芽增殖時MS培養(yǎng)基添加BA3.0 mg/L+NAA0.5～1.0 mg/L，60 d增殖倍數(shù)高達(dá)5.0以上;壯苗時MS培養(yǎng)基添加NAA 3.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+香蕉提取物20%（或椰子汁20%）的效果良好。曹天旭等[34]在BS培養(yǎng)基中加入5 mg/L BA，金線蓮叢生芽增殖及植物生長最顯著。楊柏云等[36]以金線蓮莖段為外植體，在MS培養(yǎng)基中加入不同濃度的6-BA、NAA、TDZ和S-3307，研究表明在誘導(dǎo)原球莖時，在MS培養(yǎng)基中加入TDZ 0.4 mg/L和NAA0.2 mg/L，誘導(dǎo)率達(dá)93.3%;原球莖增殖時MS培養(yǎng)基添加6-BA2.0 mg/L、S-3307 1.0 mg/L和NAA 0.2 mg/L，增殖系數(shù)達(dá)9.4;芽分化時MS培養(yǎng)基添加S-3307 1.5 mg/L、TDZ 0.4 mg/L、NAA1.5 mg/L和瓊脂0.7%，分化率達(dá)91.7%;生根培養(yǎng)基1/2MS添加NAA0.2 mg/L、活性炭0.05%和瓊脂0.7%，生根系數(shù)達(dá)4.4。黃勇[37]以滇越金線蓮和花葉開唇蘭2個金線蓮品種種子為材料進(jìn)行無菌萌發(fā)，結(jié)果表明，滇越金線蓮和花葉開唇蘭在MS（不加大量元素）+花寶13 g/L+椰子汁10%中無菌萌發(fā)情況良好;在MS（不加大量元素）+花寶13 g/L+蛋白胨2 g/L+香蕉汁100 g/L+活性炭5 g/L的固液體培養(yǎng)基中交替進(jìn)行繼代培養(yǎng)生長速度快、增殖系數(shù)高且煉苗移栽后存活率高、生長情況良好。研究人員得出的金線蓮最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基生長調(diào)節(jié)劑配比見表2。

4.3 生根培養(yǎng)基的選取

通過組培快繁得到的金線蓮組培苗需要經(jīng)過培育，待生長健壯、有一定高度、發(fā)根時才能進(jìn)行人工栽培金線蓮。陳永快等

[38]對臺灣金線蓮與福建金線蓮組織培養(yǎng)的研究表明，在生根培養(yǎng)中，不同生長調(diào)節(jié)劑對不同金線蓮品種的生根影響基本一致，所以可以不考慮金線蓮品種對生根培養(yǎng)的影響。黃德貴等[39]通過對比22個配方，在1/2MS+NAA4 mg/L+IBA1 mg/L+活性炭0.3%的組合培養(yǎng)基上培養(yǎng)90 d，壯苗生根效果良好，植株平均可凈增高3.38 cm、葉3.29片、根2.5條、鮮重達(dá)0.5 g。高燕等[31]對金線蓮生根培養(yǎng)基進(jìn)行篩選發(fā)現(xiàn)，在Ar+糖3%+AC0.2%+瓊脂粉0.7%，pH5.8的培養(yǎng)基中加入IBA0.5+NAA0.5或IBA 0.5+NAA1.0，不定根的生根率達(dá) 100%，平均每株根的數(shù)量為3.8～4.0條，不定根平均伸長2.8～3.1 cm，幼苗粗壯，生長良好，看出一定量的NAA和IBA對不定根的誘導(dǎo)有促進(jìn)作用。曹天旭等[34]研究IBA對金線蓮發(fā)根的影響，結(jié)果表明金線蓮發(fā)根較為容易，在MS基本培養(yǎng)基中加5 mg/L IBA，根的生長旺盛。周玉美等[40]、魏翠華等[41]證明蔗糖是影響金線蓮生根的重要因素，蔗糖對產(chǎn)生根的數(shù)量影響較大，卻往往容易被忽略。金線蓮在節(jié)間隙之間會生長出氣生根，所以在生根培養(yǎng)時容易產(chǎn)生根，在培養(yǎng)基中添加一定量的蔗糖、 IBA和NAA能有效地促進(jìn)金線蓮生根。

5 問題及展望

金線蓮經(jīng)過組織培養(yǎng)獲得的脫毒苗不受季節(jié)限制，繁殖速度快于普通育苗方法，而且組培苗在階段發(fā)育上比普通育苗法獲得的幼苗健壯。經(jīng)過學(xué)者和研究人員試驗研究建立起的完善的金線蓮組織培養(yǎng)體系，可以用于工廠大規(guī)?；a(chǎn)的重要理論依據(jù)。運用組織培養(yǎng)技術(shù)能有效地對我國金線蓮種質(zhì)資源進(jìn)行保護(hù)和開發(fā)利用，但還有很多問題有待解決：①組織培養(yǎng)過程中應(yīng)進(jìn)一步控制污染率、黃化率，并進(jìn)一步提高移栽存活率;②目前研究的是不同品種金線蓮的快速繁殖體系，缺乏同一品種在組織培養(yǎng)中的理論依據(jù)和歸納總結(jié);③雖然通過組織培養(yǎng)技術(shù)獲得了大量無性幼苗，但是新品種選育和研究有待進(jìn)一步深化。

未來金線蓮的研究發(fā)展有望在以下幾方面獲得突破：①建立統(tǒng)一的相應(yīng)品種研究體系，為展開品種選育以及基因改造等提供技術(shù)支持與理論依據(jù);②增強對組織培養(yǎng)獲得的金線蓮的成分、藥理分析，提高對金線蓮的利用率;③在對金線蓮細(xì)胞培養(yǎng)獲取藥用成分方面還有極大的研究前景。

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